一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂及制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂及制备方法和应用 (Novel natural solid combined bacteriostatic agent containing procyanidine and polysaccharide as well as preparation method and application of bacteriostatic agent ) 是由 王静祎 汪超 吴茜 孙智达 谢笔钧 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂及制备方法和应用,组合抑菌剂由一定比例的原花青素和多糖组成,步骤是：A、按比例取原花青素和多糖；B、将原花青素和多糖置于混合容器中,混合均匀,得混合物；C、向混合物加入蒸馏水并均匀混合,再避光静置,获得复合物；D、将获得的复合物进行低温减压干燥,获得新型天然固体组合抑菌剂。同时,还涉及了天然固体组合抑菌剂在食品保鲜及保健食品中的应用。多糖的加入逆转了原花青素在低浓度下促进致病菌生长的不利效应,改善了原花青素的抑菌特性,制备方法简便、状态稳定,集合了原花青素和多糖的优点,使该组合抑菌剂可代替抗生素、防腐剂被应用于食品保鲜和保健食品中。(The invention discloses a proanthocyanidin-polysaccharide novel natural solid combined bacteriostatic agent, a preparation method and application thereof, wherein the combined bacteriostatic agent consists of proanthocyanidin and polysaccharide in a certain proportion, and the steps are as follows: A. taking procyanidine and polysaccharide according to a proportion; B. placing procyanidine and polysaccharide in a mixing container, and mixing uniformly to obtain a mixture; C. adding distilled water into the mixture, uniformly mixing, and standing in a dark place to obtain a compound; D. and drying the obtained compound at low temperature under reduced pressure to obtain the novel natural solid combined bacteriostatic agent. Meanwhile, the application of the natural solid combined bacteriostatic agent in food preservation and health-care food is also related. The addition of the polysaccharide reverses the adverse effect of procyanidine for promoting the growth of pathogenic bacteria at low concentration, improves the bacteriostatic property of procyanidine, has simple and convenient preparation method and stable state, and integrates the advantages of procyanidine and polysaccharide, so that the combined bacteriostatic agent can replace antibiotics and preservatives to be applied to food preservation and health-care food.)
技术领域
：本发明属于食品保鲜技术和功能性食品技术领域，具体涉及一种具有协同效应的新型天然固体组合抑菌剂，同时还涉及一种含原花青素及多糖的固体组合抑菌剂的制备方法，更涉及一种含原花青素及多糖的固体组合抑菌剂在食品保鲜及保健食品中的用途。
背景技术
：食源性疾病是备受关注的公共卫生问题，近些年的数据统计表明，全球约四分之一的人口面临食源性致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、志贺氏菌等感染的风险。这些致病菌通过污染水和食物等方式传播，并在食品生长、运输及保藏期间生长繁殖，最终进入人体内并引起腹痛、腹泻、肠炎等疾病，严重危害了消费者的健康，同时也给食品品质和货架期带来了负面影响。
目前，利用抗生素和化学合成的防腐剂杀灭或抑制致病菌的生长繁殖仍被认为是控制食源性致病菌污染、延长食品货架期的有效和首选方法。但值得注意的是，研究表明饲料中添加的抗生素最终会随着肉、蛋、奶等畜禽类及其加工制品被摄入人体内而富集，这些抗生素不仅损害人体健康(例如过敏反应等)，并且长期高抗生素残留会导致机体产生细菌耐药性，对公众健康构成巨大威胁。另一方面，在食品生产、包装过程中使用化学合成的防腐剂可能会增加机体发生癫痫、瘫痪、智力低下、高血压和癌症等疾病的风险。因此，寻找天然、高效和安全的抗菌剂以防止致病菌所导致的食品污染及随之产生的抗生素和防腐剂超量、非法添加是食品安全领域亟需解决的重要问题之一。
随着天然产物的探索与研发日渐成熟，以及人们生活品质的不断提高，消费者也更加愿意接受健康、安全和绿色的天然防腐剂。因此，具有安全、廉价、副反应小、抑菌、微毒或无毒、不易出现耐药性等特性的果蔬和中草药里的活性成分引起了众多研究者的关注。原花青素是一种广泛分布于植物和果蔬中的次级代谢产物，是人体通过日常膳食摄入的主要黄酮类化合物。其基本结构单元为(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素以C-C键相互连接而成，根据儿茶素或表儿茶素的数量(聚合度)可将原花青素分为低聚体(聚合度1-4)和高聚体(聚合度大于5)，而根据单元间的连接方式可以将其分为A-型原花青素(通过C4-C6或C4-C8键连接)和B-型原花青素(通过C2-O-C7或C2-O-C5键连接)。自然界中大部分果蔬植物如莲房、青蛇果等中富含B-型原花青素，少部分食物如荔枝、蔓越橘、肉桂等主要含有A-型原花青素。近年来，由于植物多酚的天然性和抑菌的广谱性，越来越多的研究关注以原花青素为代表的植物多酚的抑菌特性，并取得了一定的进展。我们实验室前期的实验结果表明，莲原花青素对多种产肠毒素大肠杆菌(K88ac、F18ac与K99)的生长具有优异的抑制效果，MIC值从0.8-1.5mg/mL不等；对ATCC25923、ATCC27217等四株金黄色葡萄球菌具有极低的MIC值(0.020-0.047mg/mL)。但同时，也有大量研究表明，多酚类物质在一定浓度下能够促进致病菌的生长。儿茶素作为原花青素重要的单体化合物之一，可以在0.05-1.6mg/mL的低浓度范围内促进大肠杆菌的生长，我们实验室前期的研究也表明，莲原花青素在低于0.8mg/mL时对产肠毒素大肠杆菌K88ac、F18ac和K99显示促生长作用，而出现这一不利现象的原因尚未有确切结论，解决方法也尚未见到报道。
综上所述，以原花青素为代表的多酚类物质具有极大的作为天然、高效抑菌剂而被应用于食品安全和食品保鲜领域的潜力。但现有技术存在的问题是，低浓度原花青素促进致病菌生长这一不利现象在很大程度上限制了以原花青素为代表的多酚类物质在抗有害微生物方面的应用。近些年来，关于多酚与另一种常见的天然来源活性物质——多糖的共同作用逐渐得到重视，研究表明，多酚与某些多糖之间的非共价相互作用(主要包含了疏水、氢键、静电及分子场相互作用等)在提高复合物的生物活性上具有重要的意义。研究发现，有效的相互作用能够改变了多酚和多糖的理化和结构特性，从而对复合物的生物活性产生积极影响。
因此，本发明在实验室前期发现的多酚-多糖间产生了有利于提高生物活性的协同效应的基础之上，以二者间发生非共价相互作用为前提，通过大量研究和实验筛选出几种具有抑菌等生物活性的天然来源原花青素和多糖，提供了一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂。该新型组合抑菌剂不仅具有优异的抑菌活性和应用拓展性，同时利用多糖与原花青素间的非共价相互作用，成功解决了原花青素低浓度促进致病菌生长这一负面效应，这在此之前尚未见相关报道，这为将原花青素-多糖复合物开发成天然、高效的抗菌剂、代替抗生素和防腐剂提供理论基础和科学依据。此外，本发明所述的原花青素和多糖均已被证实在体内具有优异的机体健康提高能力，能够从抗氧化、抗炎、调节肠道菌群等多方面发挥功效，更加增强了该组合抑菌剂的实际应用范围和效果。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，原花青素与多糖间通过产生非共价相互作用引发显著的协同抑菌效应，使得该组合抑菌剂相较于单独使用这些天然功能因子具有更优的抑菌活性。此外，首次利用多糖逆转了原花青素在低浓度下促进致病菌生长的不利效应，拓宽了原花青素和多糖作为有效抑菌成份的可利用性和应用范围，增加了原花青素-多糖组合物代替抗生素和防腐剂运用于食品领域的可能性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂的制备方法，方法易行，操作简便，它能够克服现有技术之不足，采用具有较好抑菌活性的原花青素与另一类同样具有抑菌效果的天然功能因子——多糖(包括羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖或果胶)通过特殊共混进行非共价相互作用、产生有利于抑菌活性的协同效应，不仅提升了原花青素的抑菌能力，同时首次成功解决了低浓度原花青素促进致病菌生长这一重要问题，使得复合物具有更佳的抑菌特性。
本发明还有一个目的是在于提供了一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂在食品保鲜及保健食品中的应用，原花青素和某些多糖(包括羧甲基茯苓多糖、羧甲基壳聚糖和果胶)作为天然来源的功能活性因子，在不同食品介质中均具有较好的适配性，如在液体、固体、粉末状食物中。此外，该组合抑菌剂不仅在体外对致病菌具有优良的抑制生长效果，并且摄入后在体内具有较好的肠道抗氧化、抗炎以及调节肠道菌群等生物活性。从而起到了食品保鲜、提高食品安全以及提高机体健康等多重功效。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，其特征是由原花青素和多糖双组份复合而成，并由以下质量比的原料组成：
原料 质量百分比％
原花青素 15-85％
多糖 15-85％
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，它由以下质量比的原料组成(较好范围)：
原料 质量百分比％
原花青素 40-80％
多糖 20-60％；
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，它由以下质量比的原料组成(最好范围)：
原料 质量百分比％
原花青素 65-75％
多糖 25-35％；
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，它由以下质量比的原料组成(具体值)：
原料 质量百分比％
原花青素 75％
多糖 25％。
该原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂的制备利用了原花青素与多糖间通过特殊共混所引发的非共价相互作用，包括氢键相互作用、静电相互作用和疏水相互作用等，继而导致协同抑菌效应的产生。因此，当二者间具有最为显著的分子间非共价相互作用，即原花青素质量占比75％，多糖质量占比25％时，组合抑菌剂相较于其他混合比例时具有更强的体外抑菌效果。而从样品化学结构的角度，为了使二者间能够产生较强的分子间非共价相互作用从而提高组合物的抑菌活性，通过实验和研究发现没食子酰基是原花青素中最为关键的化学基团，能够显著提高其与多糖的相互作用强度以及随之产生的生物活性提高效果。
因此，对于本发明所述的组合抑菌剂而言，原花青素的来源可以是植物提取物，也可以是原花青素单体化合物。原花青素的提取来源包括莲科植物(莲房或荷叶或莲子壳或莲藕皮或莲藕节)或葡萄或青蛇果或荔枝；原花青素单体化合物包括儿茶素(C)或表儿茶素(EC)或表儿茶素没食子酸酯(ECG)或表没食子儿茶素(EGC)或表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)同样能够与多糖进行相互作用(原花青素与多糖的质量比范围为1:6–3:1)，形成具有较强抑菌活性的组合物，因此也在本发明的内容范围之内。所述的多糖包括羧甲基茯苓多糖(羧甲基取代度0.20-0.95)或羧甲基壳聚糖(羧甲基取代度0.50-1.90)或果胶(酯化度50％-95％)，这些天然来源多糖的共同特点是均具有一定量的负电荷和疏水性，使得氢键相互作用、静电相互作用和疏水相互作用能够在原花青素和多糖间产生，其中羧甲基茯苓多糖的阴离子及疏水性来自于一定取代度(0.20-0.95)的羧甲基，羧甲基壳聚糖的阴离子及疏水性同样来自于一定取代度(0.50-1.90)的羧甲基，而果胶则源于一定酯化度(50％-90％)。
其中，所述的原花青素的制备方法参考现有技术方法(专利授权号：CN02115423.6)，并根据原料的不同略有改动：将新鲜莲房或葡萄皮或荔枝壳或青蛇果处理成小块，以料液比1:10(m/V)加入70％(v/v)乙醇或纯水，使其在60-80℃下浸提5h。随后，将滤液通过旋转蒸发器回收乙醇(水温45℃)，并将浓缩液过AB-8大孔树脂以10倍体积蒸馏水除去杂质，再以70％(v/v)乙醇洗脱，将洗脱液再次通过旋转蒸发器回收乙醇，浓缩液置于4℃避光环境下沉淀过夜后将上清液抽滤，并以一定体积乙酸乙酯萃取，有机相通过旋转蒸发器(水温40℃)旋蒸至干再以少量蒸馏水溶解，最后进行低温减压干燥(-10～-50℃、0.1pa–5pa)，即可得到黄色或棕红色粉末状的原花青素产品。
所述的羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖的制备方法在现有技术(专利授权号CN105348407A)的基础之上略微修改进行。精确称取碱溶性茯苓多糖或壳聚糖3.0g，分散于40mL NaOH(20％)和100mL异丙醇的混合溶液中，并在冰浴状态下搅拌至完全溶解。缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0g一氯乙酸)和40mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，并在室温(20-25℃，以下相同)下搅拌3h左右。随后，将反应体系升温至50℃-60℃并搅拌30min后，再次缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0g一氯乙酸)和40mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，保持该温度范围50℃-60℃继续搅拌1h。最后，通过冰浴迅速使反应体系冷却至室温，并通过10％(v/v)冰醋酸溶液将反应体系pH值调节至7.0以结束衍生化反应，通过旋转蒸发回收异丙醇。接下来，将羧甲基多糖水溶液转移至纤维素透析袋(截留分子量为3500g/mol)中以蒸馏水透析6天，通过旋转蒸发器浓缩后利用DEAE纤维素层析柱脱去蛋白质，最后低温减压干燥(-10～-50℃、0.1pa–5pa)即可获得白色泡沫状的羧甲基茯苓多糖或白色粉末状的羧甲基壳聚糖。
所述果胶的制备方法在现有技术(专利授权号CN 105237653A)的基础之上略微修改进行，而由于果胶广泛分布于柑橘、柠檬、柚子、芒果等果皮中，此处仅以芒果皮果胶的提取为例：将新鲜芒果去皮后,芒果皮立即在95℃蒸1min进行灭酶处理，50℃烘至恒重后,粉碎,过100目筛。将过筛后的芒果皮粉以1:10g/mL的料液比与pH为2.5的柠檬酸水溶液混合，并将pH重新调节至2.5。在80℃水浴2.5h后，将提取溶液在冰浴中立即冷却，并在4℃下以8000r/min离心15min。以料液比为1:4g/mL用95％乙醇过夜沉淀,过滤后，加入50mL丙酮洗涤5min，过滤后以同样条件再洗一次，洗涤后在50℃烘箱干燥至恒重，用50mL蒸馏水溶解干燥后的样品，利用3500Da的透析袋透析72h，通过旋转蒸发器浓缩后利用DEAE纤维素层析柱脱去蛋白质，最后低温减压干燥(-10～-50℃、0.1pa–5pa)即可获得样品果胶。
需要注意的是，通过不同层析树脂获得的羧甲基多糖和果胶的精细化级分同样能够与原花青素或单体化合物进行非共价相互作用，从而提升抑菌活性。
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂的制备方法，其步骤是：
A、按一定比例取原花青素和多糖；
B、将原花青素和多糖置于混合容器中，混合均匀，获得混合物；
C、将混合物缓慢加入总质量1-10倍的蒸馏水并均匀混合，在4℃下避光静置28-32min，获得复合物；
D、将步骤C中获得的复合物进行低温减压干燥，温度控制在-10～-50℃，压力控制在0.1pa–5pa，获得一种新型天然固体组合抑菌剂。
在上述技术措施步骤中，最为关键的是原花青素与多糖均匀混合后在4℃下避光静置28-32min。在此过程中，多糖与原花青素能够充分的进行非共价相互作用，形成一种新型复合物。同时，与现有技术相比，通过上述步骤的技术措施主要解决了原花青素在低浓度下对致病菌所表现出的促生长效应，同时在二者间非共价相互作用的影响下产生协同效应，使得组合抑菌剂相较于原料单独使用时具有更加优秀的抑菌活性和抑菌特性。
因此，本发明的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂具有高效、无公害、不产生耐药性、无毒等优点，不仅能够代替抗生素和防腐剂在食品领域加以应用，通过发挥抑菌活性提高食品安全，同时，本发明通过将两种具有不同生物活性偏向的天然活性物质组合起来，利用二者间的非共价相互作用形成新型组合物，使其在体内能够发挥出优异的肠道抗氧化、抗炎、免疫力提高及调节肠道菌群等多重效果。为人们深入分析天然活性物质复合使用在食品安全方面的应用提供了科学依据。
一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂在保健食品中的应用，其步骤是：
A、原花青素从莲科植物(莲房或荷叶或莲子壳或莲藕皮或莲藕节)或葡萄皮或荔枝壳或青蛇果中提取(专利授权号为：CN 02115423.6)；羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用；果胶在现有技术(专利授权号CN 105237653A)的基础之上略微修改，从柑橘、柠檬、柚子、芒果等果皮中提取得到(常规技术)。
B、所述的原花青素及多糖作为保健食品中的主要药性活性成分，利用现代制药手段，可将原花青素-多糖组合物与固体或液体赋形剂或辅剂(如淀粉、糊精、甘油、木糖醇等)制备成胶囊、微囊、粉剂、片剂、口服液等任意一种药学或保健食品、食品添加剂和膳食补充剂上可接受的剂型。向本发明中述所的原花青素-多糖组合物加入增稠剂β-环装糊精，并加入5-10％的水湿润，最后加入崩解剂羧甲基淀粉钠，再按照常规工艺制粒、装入胶囊，即可得到一种含有原花青素-多糖组合物的保健食品，食用后能够调节肠道菌群、提高肠道健康水平。其中赋形剂或辅剂通常占40％-60％，而原花青素-多糖组合物占30％-50％。
一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂作为食品添加剂在食品保鲜中的应用，其步骤是：
A、将该天然固体组合抑菌剂按照一定剂量直接添加至一些易腐或常在新鲜状态下被食用的食品中，例如饮料、牛奶、奶酪等(添加量通常为100–500mg/kg)，而对于肉类可以通过喷洒、涂抹等方式使该抑菌剂发挥食品保鲜功效。
B、对于易腐食品具有较好的抑菌效果，显著提升了食品的安全性，同时该原花青素-多糖组合物具有抗氧化、抗炎、提升免疫力和调节肠道菌群等功效，有益于人体健康。
将原花青素-多糖组合抑菌剂以无菌蒸馏水配置成0.5-2g/L液体，然后在室温(20-25℃)下将肉类浸泡在该保鲜液中15-20min，并在无菌环境下沥干水分、真空包装。结果表明，该组合抑菌剂的使用能够提高肉类在储藏期间的微生物安全性。
总的来说，在现有技术中，由于原花青素等多酚类物质具有明显的低浓度促进致病菌生长这一缺点，以及抑菌物质在使用时由于环境、食物本身的复杂性而导致实际使用浓度难以确定，使得原花青素等酚类物质在食品保鲜中起到的抑菌效果尚待论证。
因此，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
利用原花青素和多糖间发生的有益于提升生物活性的非共价相互作用，使原花青素和多糖间不仅可以协同抑菌，更是消除了原花青素低浓度促进致病菌生长这一不利现象。使其能够有效代替抗生素和防腐剂以提高食品安全，同时还具有安全、无毒、无细菌耐药性等优点。并且我们实验室已有结果表明，该组合物还能够提高酸奶中益生菌在储存期间的活力，加强其存活性，提高酸奶的品质。同时我们实验室的研究表明，该组合剂在肉类储藏期间还能够发挥抗氧化活性，抑制肉类的蛋白质氧化和脂质氧化，提高肉类的品质。并且，该组合剂随食物被摄入体内后还能够发挥抗氧化活性，同时改善肠道菌群结构，加强肠道健康水平。
附图说明
：图1为一种莲原花青素抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌生长的浓度-效应曲线图(12h)。
图2为一种羧甲基茯苓多糖抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌生长的浓度-效应曲线图(12h)。
图3为一种莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合抑菌剂在不同比例下抑制大肠杆菌生长的浓度-效应曲线图(12h)。
图4为一种Isbologram分析莲原花青素与羧甲基茯苓多糖的协同抑菌效果示意图(12h)。
图5为一种莲原花青素主要组分(图5A)和羧甲基茯苓多糖(图5B)主要级分单独作用时抑制大肠杆菌生长的浓度-效应曲线图(12h)。原花青素单体包括：儿茶素C、表儿茶素EC、表儿茶素没食子酸酯ECG、原花青素二聚体B1及B2；羧甲基茯苓多糖主要级分包括CMPW(CMP经DEAE-FF琼脂糖凝胶吸附并由蒸馏水洗脱下来的级分)及CMPN(CMP经DEAE-FF琼脂糖凝胶吸附并由0.5mol/L NaCl洗脱下来的级分)。
图6为一种经过筛选具有较强抑菌活性的莲原花青素主要组分ECG(表儿茶素没食子酸酯)和羧甲基茯苓多糖主要级分CMPN形成的组合抑菌剂的协同抑菌效果示意图(12h)。
具体实施方式
实施例1：
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，它由以下质量比的原料组成：
原料 质量比％
原花青素 70％
多糖 30％。
实验材料及组合物制备方法：
原花青素从莲科植物(莲房或荷叶或莲子壳或莲藕皮或莲藕节)或葡萄皮或荔枝壳或青蛇果中提取(专利授权号：CN 02115423.6)；羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用；果胶在现有技术(专利授权号CN 105237653A)的基础之上，略微修改从柑橘、柠檬、柚子、芒果等果皮中提取(常规技术)。
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂的制备方法，其步骤是：
A、按一定比例取原花青素和多糖；
B、将原花青素和多糖置于混合容器中，混合均匀，获得混合物；
C、将混合物缓慢加入总质量1-10倍的蒸馏水并均匀混合，在4℃下避光静置28-32min，获得复合物；
D、将步骤C中获得的复合物进行低温减压干燥，温度控制在-10或-20或-25或-38或-45或-50℃，压力控制在0.1pa或0.5或1.1或1.6或2.4或3.5或4.5或5pa，获得一种新型天然固体组合抑菌剂。
实施例2-6：
一种具有协同效应的原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂，它由以下质量百分比的原料组成：
原料及实施例
2
3
4
5
6
原花青素
15
30
50
60
72
多糖
85
70
50
40
28
总计
100
100
100
100
100
其制备步骤与实施例1相同：
实施例7：
本发明之原花青素和多糖单独作用对致病菌的浓度-效应曲线、MIC(最低抑菌浓度)/MBC(最低杀菌浓度)值的确定
1、材料与方法
1.1实验菌种及活化与培养
将四种致病菌(大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和志贺氏菌，由湖北省农科院提供)冻存液通过接种环在LB琼脂培养基平板上划线培养过夜(37℃)，并挑取单菌落再次划线培养过夜，二次活化后的平板保存于4℃环境中。实验过程中所使用的单菌落均取自于每三周活化一次的细菌平板，以保证细菌的活力。
活化后，取致病菌单菌落于无菌LB(Luria-Bertani)肉汤培养基并置于水浴摇床(200rpm/min)中恒温(37℃)培养至对数生长期(6-8h)。随后，培养液于4℃下离心(6300g/min，5min)收集细菌、无菌生理盐水清洗两次并重悬于无菌生理盐水中制得细菌菌悬液。随后，以0.5McFarland浊度管在600nm处的OD值(浓度为108CFU/mL菌悬液的近似OD值)作为参照，测得菌悬液的OD600并通过无菌生理盐水调节浓度，得到浓度为108CFU/mL的致病菌初始菌悬液。
1.2原花青素及羧甲基茯苓多糖抑菌的浓度-效应曲线
采用微孔肉汤法对莲原花青素及羧甲基茯苓多糖对四种致病菌生长曲线的影响进行测定。将样品溶解于MH(Mueller-Hinton)肉汤培养基中并通过0.2μm无菌滤膜过滤，随后将200μL样品溶液加入96孔板中，并通过梯度稀释法得到浓度范围为5～0.078125mg/mL的样品溶液(200μL)。按照1.1描述的方法制得处于对数生长期的致病菌，向96孔板中加入10μL菌液使得每孔最终的细菌浓度约为5×105CFU/mL。同时，以MH肉汤培养基代替样品溶液作为空白对照。最后，将96孔板置于37℃恒温培养箱内孵育12h，并每2h通过酶标仪测定OD600值，即可得到在不同样品影响下的致病菌生长曲线。实验独立重复三次，每次均有三次平行。抑菌率通过以下公式计算：
其中A0代表空白对照组于12h测定的OD600值，而AS代表样品组于12h测定的OD600值。
1.3莲原花青素及羧甲基茯苓多糖抑菌的MIC/MBC值。
通过肉汤稀释法测定了不同样品对四种致病菌的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)。将样品溶解于MH肉汤培养基中并通过无菌滤膜过滤，转移至96孔板后进行梯度稀释。随后，将处于对数生长期的菌液加至96孔板中，使得每孔的最终细菌浓度约为5×105CFU/mL，同时样品浓度为5～0.078125mg/mL。最后，将96孔板置于37℃下孵育15h。其中，MIC定义为抑制致病菌生长的最低浓度(孵育前后OD600值不变)，MBC定义为培养15h后将孔中溶液涂平板继续孵育20h，其中无肉眼可见菌落生长的最低浓度。实验独立重复三次，每次测定均有三次平行。
2、结果与分析
2.1莲原花青素及羧甲基茯苓多糖抑菌的MIC/MBC值。
表1莲原花青素和羧甲基茯苓多糖对四种致病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
aMIC，MBC单位为mg/mL；b--表示没有检测到该样品的MIC和MBC
表1的结果表明，莲原花青素不仅能够完全抑制致病菌生长，同时还具有杀菌效果。此外，莲原花青素对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC最低，而对志贺氏菌的MIC和MBC最高。同时，羧甲基茯苓多糖在实验浓度范围内没有检测出对四种致病菌的MIC和MBC，说明其对这四种致病菌生长的抑制效果远差于莲原花青素。
2.2莲原花青素及羧甲基茯苓多糖抑菌的浓度-效应曲线
莲原花青素单独作用于四种致病菌后(12h)，均发挥了较好的抑制生长能力，且受到致病菌种类的影响(图1)。其中，抑制大肠杆菌的IC50值为0.98mg/mL，对沙门氏菌为1.02mg/mL，而对志贺氏菌值为1.82mg/mL，对金黄色葡萄球菌为0.284mg/mL。此外，莲原花青素对受测致病菌具有低浓度促进增殖的不利作用：对大肠杆菌从0.8mg/mL开始促进生长，最高促生长率为27.5％；对金黄色葡萄球菌从0.26mg/mL开始促进生长，最高促生长率为36.8％；对志贺氏菌从1.47mg/mL开始促进生长，最高促生长率为35.4％；对沙门氏菌从0.59mg/mL开始促进生长，最高促生长率为32.7％，这明显不利于对原花青素抑菌活性的应用。而对于羧甲基茯苓多糖(图2)，其作用12h后对受测致病菌的生长表现出一定的抑制作用。其中，对志贺氏菌的生长具有最好的抑制效果，抑制率最高可达77.54％，IC50值为0.82mg/mL；对于大肠杆菌最高抑制率为54.12％，IC50值为2.48mg/mL；对金黄色葡萄球菌最高抑制率为51.23％，IC50值为4.93mg/mL；对沙门氏菌的最高抑制率仅为28.02％。此外，低浓度羧甲基茯苓多糖并不存在低浓度促进致病菌生长的现象。
实施例8：
本发明之天然固体组合抑菌剂中原花青素与多糖间协同抑菌效果的确定。
1、材料与方法
1.1实验菌种及活化与培养
与实施例7相同。
1.2莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合抑菌剂对大肠杆菌生长的抑制效果
羧甲基茯苓多糖与莲原花青素协同抑菌效果(12h)的具体实验方法同实施例7。其中，羧甲基茯苓多糖-莲原花青素组合物的制备过程按照本说明描述，将两种样品以一定比例复合后低温减压干燥得到，随后将组合物粉末以一定初始浓度溶于MH培养基，经0.2μm微孔滤膜除菌后按一定比例等体积混合。实验独立重复三次，每次测定均具有三次平行。
1.3莲原花青素与羧甲基茯苓多糖间协同抑菌效果测定
根据实验进行到12h时的浓度-抑菌率曲线和数据，通过等效线分析(Isobologramanalysis)研究羧甲基茯苓多糖与莲原花青素之间的协同抑菌作用，并通过公式计算出协同效应值(γ)：
其中IC50Amix和IC50Bmix是复合物中样品A和样品B的IC50值；IC50A和IC50B为样品A和样品B单独使用时的IC50值。若γ＝1，表示两者之间具有相加效应；若γ<1，则表示两者之间具有协同效应，且γ值越小协同作用更强；若γ>1，则两者之间具有为拮抗作用。
2、实验结果与分析
2.1莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合抑菌剂对大肠杆菌生长的抑制效果
莲原花青素与羧甲基茯苓多糖对大肠杆菌12h的共同抑菌效果如图3所示(莲原花青素:羧甲基茯苓多糖，w/w)。对于不同比例组合物，它们对大肠杆菌的抑菌效果相较于莲原花青素单独作用时发生一定的改变。对组合抑菌剂来说，羧甲基茯苓多糖的引入使得莲原花青素的绝对浓度降低，导致组合物的MIC增加(表2)，即需要更高剂量才能够完全抑制大肠杆菌的生长。而从IC50值看，当二者以3:1(w/w)复配时，其IC50值(0.26mg/mL)远低于莲原花青素单独作用时的效果(0.98mg/mL)，二者显示出一定的协同抑菌作用。而在其余比例下复合物抑制大肠杆菌生长的IC50值与莲原花青素单独作用时相比增加。
2.2莲原花青素与羧甲基茯苓多糖间协同抑菌效果测定
进一步通过等效线图分析量化莲原花青素与羧甲基茯苓多糖之间的协同抑菌效果。由图4可以看出，不同比例组合物的IC50点均落在由莲原花青素和羧甲基茯苓多糖单独作用的IC50值相连构成的相加线的左下方，意味着在这些复配比例下，二者间均具有协同抑菌活性。从协同效应值γ(表2，其中γ值越低表明协同作用越强)的计算结果可以看出，二者间的协同效应值均小于1，意味着它们之间存在着协同作用。尤其是当二者以3:1复配时，复合物以原花青素为主体，再辅以羧甲基茯苓多糖产生的协同效果，导致组合剂不仅具有最低的IC50和MIC值，同时也具有最佳的协同效果(γ值最低)。
表2莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物对大肠杆菌的MIC值以及协同效应值(γ)
a复配比例为LSOPC:CMP(w/w)；bIC50及cMIC的单位为mg/mL
实施例9：
本发明之天然固体组合抑菌剂在保健食品中的应用，其步骤是：
A、原花青素从莲科植物(莲房或荷叶或莲子壳或莲藕皮或莲藕节)或葡萄皮或荔枝壳或青蛇果中提取(专利授权号：CN 02115423.6)；羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用；果胶在现有技术(专利授权号CN 105237653A)的基础之上，略微修改从柑橘、柠檬、柚子、芒果等果皮中提取(常规方法)。
B、所述的原花青素及多糖作为保健食品中的主要抑菌活性成分，利用现代制药手段，可将莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物与某种固或液体赋形剂或辅剂(如淀粉、糊精、甘油、木糖醇等)制备成胶囊、微囊、粉剂、片剂、口服液等任意一种药学或保健食品、食品添加剂和膳食补充剂上可接受的剂型，其中赋形剂或辅剂如淀粉、糊精、甘油等，通常占40％或45％或50％或55％或60％，而原花青素-多糖组合物占30％或35或40或45或50％。所述的保健食品在调节肠道菌群，抑制致病菌生长和粘附，同时提高肠道健康水平中具有一定的用途。
向本发明中述所的原花青素-多糖组合物加入增稠剂β-环装糊精，并加入5-10％的水湿润，最后加入崩解剂羧甲基淀粉钠，再按照常规工艺制粒、装入胶囊，即可得到一种含有原花青素-多糖组合物的保健食品。结果表明，该胶囊在食用后能够有效调节肠道菌群、提高肠道健康水平。
实施例10：
本发明之天然固体组合抑菌剂作为食品添加剂在食品保鲜中的应用，其步骤是：
A、原花青素从莲科植物(莲房或荷叶或莲子壳或莲藕皮或莲藕节)或葡萄皮或荔枝壳或青蛇果中提取(专利授权号：CN 02115423.6)；羧甲基茯苓多糖或羧甲基壳聚糖在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用；果胶在现有技术(专利授权号CN 105237653A)的基础之上，略微修改从柑橘、柠檬、柚子、芒果等果皮中提取(常规方法)。
B、将上述原花青素-多糖组合抑菌剂在无菌状态下直接加入饮料、牛奶、奶酪等中，添加量100–500mg/kg，混合均匀后，根据不同种类食品的要求在一定温度等环境下进行储藏备用。对于肉类和果蔬，将原花青素-多糖组合抑菌剂均匀喷洒、涂抹至食物表面，后置于保鲜袋中低温冷藏或冻藏备用。将原花青素-多糖组合抑菌剂以无菌蒸馏水配置成0.5-2g/L液体，然后在室温(20-25℃)下将肉类浸泡在该保鲜液中15-20min，并在无菌环境下沥干水分、真空包装。结果表明，该组合抑菌剂的使用不仅能够提高发挥抑菌活性，提高肉类在储藏期间的微生物安全性。同时，该组合剂在肉类储藏期间还能够发挥抗氧化活性，抑制肉类的蛋白质氧化和脂质氧化，提高肉类的品质。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，本说明书内容不是对本发明的限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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