一种2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的重结晶方法
阅读说明：本技术 一种2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的重结晶方法 (Recrystallization method of 2, 3-O-isopropylidene-D-ribonic acid-gamma-lactone ) 是由 邵仲 周玉宝 吴尧 黄鑫 单环宇 许杭梁 蒋东栋 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的重结晶方法,包含以下步骤：a、将含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的粗品溶于酯类溶剂得到含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的溶液；b、在含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的溶液中加入反溶剂后降温至析晶温度析出固体；c、从固体中筛选析出颗粒状的晶体。本发明的方法操作简单,适合大规模生产；得到的产物纯度、产率高。(The invention provides a recrystallization method of 2, 3-O-isopropylidene-D-ribonic acid-gamma-lactone, which comprises the following steps: a. dissolving a crude product containing 2, 3-O-isopropylidene-D-ribonic acid-gamma-lactone in an ester solvent to obtain a solution containing 2, 3-O-isopropylidene-D-ribonic acid-gamma-lactone; b. adding an antisolvent into a solution containing 2, 3-O-isopropylidene-D-ribonic acid-gamma-lactone, cooling to a crystallization temperature, and precipitating a solid; c. and screening out granular crystals from the solid. The method is simple to operate and suitable for large-scale production; the obtained product has high purity and yield.)
技术领域
本发明涉及重结晶技术领域，具体涉及一种2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的重结晶方法。
背景技术
近年来，mRNA药物作为医药界的新兴领域引起了很多关注。随着新冠mRNA疫苗的横空出世，其经济、灵活、高效、易于大规模生产的特点使其成为当下医药界的热门。为了解决mRNA药物的免疫原性问题，目前技术会采用一些化学修饰的核苷(如5-甲基胞嘧啶核苷(m5C)、假尿苷(Ψ)等)来代替天然核苷，在降低药物的免疫原性的同时，不影响甚至提高翻译效率。这些核苷的主体结构D-(+)-核糖，由中间体2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯引入。在现有技术中，如Batra H,Moriarty R M,Penmasta R等人在“A Concise,Efficientand Production-Scale Synthesis of a Protected l-Lyxonolactone Derivative:AnImportant Aldonolactone Core”中所公开的合成方法，该中间体是D-(+)-核糖酸-γ-内酯与丙酮在硫酸催化下反应生成。
将通过该方法制得产物通过色谱柱分离后得到两种产物，将这两种产物进行核磁分析可以得到图1和图2所示的谱图，其中图1为目标产物，图2为杂质，并结合杂质的质谱图(图3)可以得知，最终产物除了目标化合物，还含有同分异构体的杂质。
该杂质的存在会影响后续反应且会消耗更多的物料，不利于放大生产。然而同分异构体的杂质分离纯化难度大，需要色谱柱进行分离，这无疑又增加了生产成本。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的重结晶方法,包含以下步骤：
a、将含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的粗品溶于酯类溶剂得到含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的溶液；
b、在含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的溶液中加入反溶剂后降温至析晶温度析出固体；
c、从固体中筛选析出颗粒状的晶体。
优选地，在降温至析晶温度前先降温至养晶温度培养晶核。
养晶温度为溶液开始析出晶核时的温度，并在该温度下培养一段时间的晶核有利于提高后续降温析晶时的纯度和产率。
优选地，将含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的粗品溶于高于40℃酯类溶剂得到含有2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的溶液。优选地，溶剂温度高于40℃，低于沸点。优选地低于80℃酯类溶剂。优选地为75～80℃酯类溶剂。
优选地，在晶核培养完成后加入反溶剂。
优选地，所述的反溶剂为烷烃类溶剂。
优选地，所述酯类溶剂为乙酸乙酯，乙酸丙酯、乙酸叔丁酯中的一种或多种，优选为乙酸乙酯。
优选地，所述反溶剂为碳原子数少于16的烷烃类溶剂，优选为正庚烷，正己烷、环己烷、石油醚，更为优选为正己烷。
优选地，所述酯类溶剂的体积(ml)与所述粗品的质量(g)之比大于1：1(ml：g)；优选地大于1：1(ml：g)，不高于4：1(ml：g)。
优选地，所述反溶剂的体积与所述酯类溶剂的体积之比不高于1：1；优选地，不高于1：1，不低于1：3。
优选地，所述析晶温度不高于25℃。
优选地，所述析晶温度为-5～25℃；优选为-5～10℃；更优选为0℃。
优选地，析晶时间不低于1h；优选地不低于2h；优选地不低于3h；优选地不低于4h。
优选地，养晶温度为30℃。
有益效果：
1、本方法操作简单，适合大规模生产；
2、通过本方法得到的产物纯度、产率高。
附图说明
图1为2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯HNMR图，1H NMR(δ500MHz,CDCl3)4.84(d,J＝5.6Hz,1H),4.79(d,J＝5.6Hz,1H),4.64(t,J＝1.9Hz,1H),4.00(dd,J＝12.2,2.3Hz,1H),3.82(dd,J＝12.2,1.7Hz,1H),2.41(s,1H),1.48(s,3H),1.39(s,3H)；
图2为同分异构体杂质HNMR图，1H NMR(δ500MHz,CDCl3)4.82(dd,J＝7.8,3.6Hz,1H),4.58(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝13.2Hz,1H),4.34(d,J＝3.6Hz,1H),4.20(dd,J＝13.1,1.6Hz,1H),3.26(s,1H),1.47(s,3H),1.37(s,3H)；
图3为同分异构体杂质m/z(H+)图(m/z＝189.1[M+H]+)；
图4为使用本发明的方法重结晶后得到颗粒状晶体的照片；
图5为使用本发明的方法重结晶后得到粉末状晶体的照片；
图6为实施例1～3的TLC图，图中1、2、3分别代表实施例1、2、3的重结晶产物，图中上方的印记代表产物2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯，下方的印记代表同分异构体的杂质；
图7为实施例12的TLC图，图中原代表粗品、晶代表重结晶后的颗粒状晶体，粉代表重结晶后的粉末状晶体，母液代表析出固体后过滤的滤液，图中上方的印记代表产物2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯，下方的印记代表同分异构体的杂质；
图8为实施例13的TLC图，图中原代表粗品、粉代表重结晶后的粉状产物，母液代表析出固体后过滤的滤液，图中上方的印记代表产物2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯，下方的印记代表同分异构体的杂质。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得，其中试剂的纯度为工业级。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例所使用的2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯粗品依据文献“AConcise,Efficient and Production-Scale Synthesis of a Protected l-Lyxonolactone Derivative:An Important Aldonolactone Core”得到，用高效液相色谱分离粗产物得到两种物质，分别为目标化合物2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯和杂质，核磁谱图分别为图1和图2，图3为杂质的质谱图。通过核磁图和质谱图判断该杂质为2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-γ-内酯的同分异构体。
实施例1～5
将装有75-80℃乙酸乙酯溶液(粗品在乙酸乙酯中溶解并形成的均一溶液)降温至析出晶核的温度(养晶温度)，本实施例为30℃，等析出固体后，以80r/min的搅拌转速缓慢搅拌养晶30min(养晶目的在于培养晶核，有利于提高后续析晶时的纯度和产率)，随后将溶液自然降温至析晶温度后，搅拌转速改为200r/min，搅拌析晶12h，过滤后得产物。
按照以上述方法改变溶剂、析晶温度，考察其对重结晶产物的影响，结果如下表。
上述实施例析出的固体为白色无光泽的颗粒状。产率＝产量/粗品*100％。
当100g的粗品中加入100mL乙酸乙酯时，析出固体过多，搅拌困难，不利于生产放大。
为了解产物的纯度，将产物用乙酸乙酯溶解后通过TLC(展开剂为乙酸乙酯：正己烷＝3:1，碱性高锰酸钾溶液显色)判断。这是因为一方面目标产物和杂质均无紫外响应，无法通过高效液相色谱或的纯度，因此通过TLC图判断产物的纯度。实施例1～3中，如图6所示随着粗品在乙酸乙酯溶液中浓度降低，在TLC图上的表现为，杂质的显色(图中位于下方的印记)越来越不明显，实施例3的产物有微量的杂质显色。而实施例4(未在图6中示出)的产物有着较为明显的杂质显色，表现出的效果与实施例1相似。
实施例6～12
将装有75～80℃乙酸乙酯溶液(100g粗品在300mL乙酸乙酯中溶解并形成的均一溶液)降温至析出晶核的温度(养晶温度)，本实施例为30℃，等析出固体后，以80r/min的搅拌转速缓慢搅拌养晶30min，随后滴加正己烷，滴加完成后自然降温至析晶温度，搅拌转速改为200r/min，搅拌析晶一段时间，过滤后得产物。
其中，按照100g粗品加入300mL乙酸乙酯可以在保证收率的情况下，不过多的使用溶剂，并且方便搅拌，除此之外，以上述方法改变析晶温度、正己烷的添加体积、析晶时间，考察其对重结晶产物的影响，结果如下表。
实施例6～实施例12析出的固体为颗粒状的晶体(参考图4)和粉末晶体(参考图5)，其中颗粒状的晶体为目标产物，而粉末晶体(非目标产物)是目标产物和杂质的混合物。产率＝颗粒晶体/粗品*100％。
对于产物的纯度，将颗粒晶体用乙酸乙酯溶解后通过TLC判断，实施例6～实施例12获得的颗粒晶体具有不明显或微量的杂质显色，与粗品比较，杂质显色显著变浅。因此，重结晶后的产物杂质含量显著降低。如图7所示，为实施例12的TLC图，目标产物(图中所示的“晶”)中基本不含同分异构体的杂质。
就产率而言，比较实施例4、6～8，加入正己烷后的产率显著高于未加正己烷的情况。比较实施例6～8，颗粒晶状收率随正己烷量的提高而增加，到200ml后到达极值，再增加正己烷的量无效果。比较实施例7、9、10，析晶温度降低可以提高收率，当降到0℃时达到极值，温度继续降低无明显效果。比较实施例10～12析晶时间延长可以增加收率，当延长至4小时后达到极值，继续延长时间无明显效果。
实施例13
将装有50-55℃甲基叔丁基醚溶液(100g粗品在300ml甲基叔丁基醚中溶解并形成的均一溶液)降温至析出晶核的温度(养晶温度)，本实施例为20℃，等析出固体后，以80r/min的搅拌转速缓慢搅拌养晶30min，随后滴加200ml正己烷，滴加完成后自然降温至0℃，搅拌转速改为200r/min，搅拌析晶4h，得白色粉状产物56.4g，没有如实施例6～12那样形成两种不同性状的晶体。
产物的TLC图如图8所示，在粗品(原)、粉状产物(粉)和析出固体后过滤的滤液(母液)对比中，产物有较为明显的杂质显色，与粗品相比，杂质含量未显著减少。
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