家族性高胆固醇血症相关基因及其检测试剂盒与应用
阅读说明：本技术 家族性高胆固醇血症相关基因及其检测试剂盒与应用 (Familial hypercholesterolemia related gene and detection kit and application thereof ) 是由 陈牧雷 高元丰 杨新春 王欣 董莹 杨晓艳 曹晔萱 付源 史琳影 张媛 梁庆渊 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了“一种家族性高胆固醇血症相关基因及其检测试剂盒与应用”,属于诊断试剂开发技术,其特征在于,包含人类LDLR基因c.817+1G>C杂合突变,所述c.817+1G>C杂合突变位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第16个碱基位置处；该位点可以作为临床辅助诊断家族性高胆固醇血症的生物标志物；通过检测受试者是否携带上述变异,可以检测该变异的携带者,为受试者提供优生优育指导和遗传咨询,减少患儿出生；为人类攻克家族性高胆固醇血症提供可能的药物治疗靶点,促进创新药物研发。(The invention discloses a familial hypercholesterolemia related gene and a detection kit and application thereof, belonging to the development technology of diagnostic reagents, which is characterized by comprising human LDLR gene c.817+1G > C heterozygous mutation, wherein the c.817+1G > C heterozygous mutation is positioned at the 16 th base position of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 1; the site can be used as a biomarker for clinically auxiliary diagnosis of familial hypercholesterolemia; by detecting whether the subject carries the variation or not, the carrier of the variation can be detected, and the prenatal and postnatal care guidance and the genetic counseling are provided for the subject, so that the birth of the infant patient is reduced; provides possible drug treatment targets for human beings to overcome the familial hypercholesterolemia, and promotes the research and development of innovative drugs.)
技术领域
本发明涉及诊断试剂开发，具体涉及家族性高胆固醇血症相关基因及其检测试剂盒与应用。
背景技术
家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)又称家族性高β脂蛋白血症，其临床特点是高胆固醇血症、特征性黄色瘤、早发心血管疾病家族史。FH是儿童期最常见的遗传性高脂血症，也是脂质代谢疾病中最严重的一种，可导致各种危及生命的心血管疾病并发症出现，是冠状动脉疾病的一种重要危险因素。本病最特征的临床表现为血LDL-C水平增高、黄色瘤、角膜弓和早发性冠心病。纯合子的临床表现比杂合子严重得多。FH患者的临床表现取决于其基因型，非遗传因素也对其有影响。FH基因型与表现型的关系比较复杂，即使带有相同突变，甚至属于同一家族的个体其临床表现差异也较大。
对FH患者的B型超声检查常可发现主动脉根部硬化，主动脉根部硬化逐渐加重，同时可出现主动脉瓣钙化和(或)左冠状动脉主干狭窄。15％患者有冠状动脉瘤样扩张(指冠状动脉的局限或弥漫性扩张，其直径超过了相邻正常冠脉的1.5～2倍)，而年龄、性别配对的对照组(非FH冠心病患者)中仅2.5％有冠状动脉瘤样扩张。并同时发现冠状动脉瘤样扩张与血浆HDL-C水平呈负相关，因而认为FH者易发生冠状动脉瘤样性疾病。FH患者血脂代谢失衡，会加快动脉粥样硬化及早发冠心病的进程，因而早期发现和诊断FH,及早进行干预，可显著降低冠脉疾病的发病率及死亡率，改善临床预后。
目前，基因检测是确诊FH的一种新型手段。任何一个或一组FH的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。目前已知的FH相关变异超过2000个，其中约1000个变异已经得到足够证据支持而被归类为致病变异和可能致病变异两类之中，这些变异主要分布在三个基因:LDLR(90％以上)、APOB(5％～10％)、PCSK9(1％以下)。但是仍有部分FH患者无法用已知的致病基因解释，提示存在未发现的致病基因，有必要进一步探索完善FH致病基因数据从而提高早期检测FH的准确率。
发明内容
基于上述领域的需求和发明人的发现，本发明提供家族性高胆固醇血症相关基因的应用及其检测试剂盒，技术方案如下：
1.一种LDLR突变基因，其特征在于,包含人类LDLR基因c.817+1G>C杂合突变,所述c.817+1G>C杂合突变位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第16个碱基位置处。
2.检测所述LDLR突变基因的试剂在制备家族性高胆固醇血症检测试剂盒中的用途。
3.根据所述的用途，其特征在于，所述试剂包含PCR扩增所需试剂。
4.根据所述的用途，其特征在于，所述试剂包含SEQ ID NO:2所示的正向引物，SEQID NO:3所示的反向引物。
5.根据所述的用途，其特征在于，所述试剂包含Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性方法用试剂、单链构象多态性分析用试剂和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交用试剂中的一种或多种。
6.一种家族性高胆固醇血症相关基因的检测试剂盒，其特征在于，包含检测前述LDLR突变基因的试剂。
7.根据所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂包含PCR扩增所需试剂。
8.根据所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂包含SEQ ID NO:2所示的正向引物，SEQ ID NO:3所示的反向引物。
9.根据所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂包含Sanger测序试剂。
本发明提供的通过检测LDLR基因c.817+1G>C是否杂合突变，可以将家族性高胆固醇血症变异基因携带者和正常人群区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断家族性高胆固醇血症的生物标志物；
通过检测受试者是否携带上述变异，可以检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克家族性高胆固醇血症提供可能的药物治疗靶点，促进创新药物研发。
LDLR基因编码低密度脂蛋白受体，低密度脂蛋白受体(LDLR)基因家族由参与受体介导的特定配体内吞的细胞表面蛋白组成。低密度脂蛋白(LDL)通常与细胞膜结合，进入细胞后进入溶酶体，在溶酶体中蛋白质被降解，胆固醇被用来抑制微粒体酶3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A(HMG CoA)还原酶，这是胆固醇合成中的限速步骤。同时，胆固醇酯的合成也发生了相互的刺激，对于维持血浆脂蛋白代谢平衡起到十分重要的作用。LDLR基因突变与常染色体显性遗传的家族性高胆固醇血症和低密度脂蛋白胆固醇水平升高的发生有关。
家族性高胆固醇血症(AD)临床表现为血LDL-C水平增高、黄色瘤、角膜弓和早发性冠心病。临床表现取决于其基因型，非遗传因素也对其有影响，纯合子的临床表现比杂合子严重。杂合子血浆胆固醇浓度通常是正常人的2～3倍，介于350-550mg/L之间；纯合子则较正常人高6～8倍，介于650-1000mg/L之间。杂合子黄色瘤多在20岁后出现，纯合子4岁前出现。杂合子多在30岁后出现冠状动脉疾病，而纯合子多在儿童期就出现。发病率：杂合子1/500，纯合子1/100万。
在对诊断为“家族性高胆固醇血症”的受检者进行基因检测中发现其携带了LDLRc.817+1G>C杂合变异；查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC:无)。查询百世诺本地中国人群数据库，该变异频率为0.00000406。查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，该突变位点附近突变位点c.814_817del(p.Val271_Asn272insTer)、c.810C>A(p.Cys270Ter)、c.817+2T>G、c.817+2T>C、c.818-2A>G等被报导为家族性高胆固醇血症的致病变异，但文献检索未见到本发明发现的变异与疾病相关的报导。根据现有证据：该变异为罕见变异、本地数据库频率为0.00000406、附近位点曾被报导为致病变异，但缺乏家系连锁及功能学证据支持，所以推测该变异为家族性高胆固醇血症的高度可疑致病突变；本发明的研究表明：受检者携带了家族性高胆固醇血症的高度可疑致病突变LDLR基因c.817+1G>C杂合变异，支持临床家族性高胆固醇血症的诊断；家系验证该变异遗传自受检者母亲(FH-CF-48-1)；该突变致病性较为明确,以常染色体显性遗传的模式在家族内传递，遗传概率为50％。
该杂合突变的发现，丰富了家族性高胆固醇血症基因检测的靶点，提高了家族性高胆固醇血症基因检测的准确率。
附图说明
图1是本发明实施例家系中LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因携带者与家族性高胆固醇血症相关关系图；
图2是本发明实施例中患者及家系中其他患病成员的Sanger测序图。
具体实施方式
以下结合附图及示例性实施例子说明本发明的实现过程，以下所描述的是实施方式不应解读为对本发明的范围作出限制。
实施例1.LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因，体外检测LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因的试剂盒
本实施例提供LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
SEQ ID NO:1ttggctgcgt taatg g/c tgag cgctggccat。
本实施例还提供用于检测LDLR基因c.834delG杂合缺失突变基因的引物：
正向引物：5'-GCCTCTCAAGCAGTTGGAACCAC-3'(SEQ ID NO:2)；
反向引物：5'-TCACTTGCCCACAGACGCACA-3'(SEQ ID NO:3)。
本发明实施例提供的一种体外检测LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因的试剂盒，该试剂盒包括：1)的扩增LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因的引物；2)PCR扩增酶；3)PCR缓冲液、二价阳离子或一价阳离子、杂交溶液。具体的，体外检测LDLR基因c.817+1G>C杂合突变基因的试剂盒的组分如表1所示：
表1
实施例2、体外检测待测样品中是否存在FH相关基因的方法
本发明实施例提供的一种体外检测待测样品中是否存在家族性高胆固醇血症相关基因的方法，所述方法包括以下步骤：
1.提取待测样品的DNA，针对所述LDLR基因的c.817+1G>C位点进行PCR扩增；其中，所述待测样品为待测个体的血液、头发、唾液、头发或活组织；
提取样品的DNA可以采用任何已知成熟技术。本本实施例中，待测样品的DNA提取使用磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒(百世诺)进行样本的DNA提取:向96深孔板第1、7列加入200μl样本(血清/全血)、10μl蛋白酶K,移液器吹打混匀，室温静止10～15min后加入150μl结合液。将96深孔板放入全自动核酸提取纯化仪ZK-01，开始DNA提取，程序设置为如表2所示：
表2
将96深孔板取出仪器，第6列、12列为提取完成的待测样本的DNA。
2.对所述PCR扩增产物进行分析，本步骤中，PCR扩增条件如表3所示：
表3
取3μl PCR产物,使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,选用1000bp Marker作参考。产物纯化后，进行Sanger测序，然后读取测序结果。
3.鉴定LDLR基因的c.817+1G>C位点是否突变
若待测定LDLR基因的c.817+1G>C位点突变，则认为该变异基因的携带者为家族性高胆固醇血症的高度可疑致病突变(B级)。
因而，检测该LDLR基因的c.817+1G>C位点突变可用于临床诊断家族性高胆固醇血症，为携带早发家族性高胆固醇血症变异的家庭提供遗传阻断，提高优生优育质量。
实验例1.家族性高胆固醇血症与LDLR基因c.817+1G>C杂合突变关联性研究
1.受检者信息，如下表4所示
表4
利用本发明实施例1的检测试剂盒及实施例2的试剂盒的检测方法对受检者的LDLR基因进行性检测。
2.检测结果说明
检测结果：受检者携带了家族性高胆固醇血症的高度可疑致病突变LDLR基因c.817+1G>C杂合变异，支持临床家族性高胆固醇血症的诊断。
用本发明实施例1的检测试剂和实施例2的检测方法检测受检者携带LDLR变异基因，具体详见下表6所示:
表6
注：AD为常染色体显性遗传，AR为常染色体隐性遗传，XLD为X染色体显性遗传，XLR为X染色体隐性遗传，-为OMIM数据库暂无遗传方式。
A级：明确致病突变，家系连锁或功能证据支持与疾病明确相关。
B级：高度可疑致病突变，人群数据及生物信息分析提示很可能与疾病相关。
C1级；可疑致病变异，基因功能、人群数据及生物信息分析提示可能与疾病相关，但是缺乏证据支持。
C2级：临床意义未明变异，根据现阶段对疾病和遗传信息的认知，无法判断与疾病关系。D级：可能良性变异，根据现阶段对疾病和遗传信息的认知，判断导致疾病的可能性低。
3.家系验证
用本发明实施例1的检测试剂和实施例2的检测方法检测受检者家属携带LDLR变异基因情况，同时进行临床诊断，结果列表7所示。
表7
样本编码
与受检者关系
LDLR:c.817+1G>C
临床诊断
FH-CF-48-1
先证者母亲
杂合变异
家族性高胆固醇血症
FH-CF-48-2
先证者弟弟
杂合变异
家族性高胆固醇血症
FH-CF-48-3
先证者儿子
无变异
无家族性高胆固醇血症
如图1和图2所示，家系验证该变异遗传自受检者母亲(FH-CF-48-1)；受检者的弟弟(FH-CF-48-2)也携带了该变异，验证了该突变为常染色体显性遗传。
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