具有阿扎菲酮结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用
阅读说明：本技术 具有阿扎菲酮结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用 (Coupling reagent with azaphenanthrone structure and application thereof in preparation of polypeptide and protein conjugate ) 是由 姚祝军 伊善东 王欢 魏思媛 奚婕 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于有机合成及蛋白质修饰技术领域,特别涉及具有阿扎菲酮结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用,本发明的具有阿扎菲酮结构的多肽、蛋白质偶联试剂在水溶液中稳定性好,对蛋白质的修饰操作简单方便,结构新颖,与目前已知的修饰试剂结构都不一样,偶联产物的连接稳定性好,为多肽、蛋白质的各种功能化修饰提供了一种新技术和新方式。(The invention belongs to the technical field of organic synthesis and protein modification, and particularly relates to a coupling reagent with an azaphenanthrone structure and application thereof in preparation of polypeptide and protein conjugates.)
技术领域
本发明属于有机合成及蛋白质修饰技术领域，特别涉及具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用。
背景技术
多肽或蛋白质的修饰是有效改善其理化性质，如增加水溶性、延长生物体内作用时间及降低毒副作用等的重要手段。通过特定功能基团(导向基、荧光团、药物)的引入可以改变多肽或蛋白质在生命体系中的分布、进行生物医学成像及疾病治疗等。一般地，偶联试剂需要与多肽或蛋白质中的一些官能团进行反应，由于赖氨酸在蛋白质中的含量高(人体蛋白质组中占5.9％)并且通常暴露于蛋白质表面，因此赖氨酸是重要的修饰位点。
目前对多肽或蛋白质中赖氨酸残基的修饰方法比较单一，经典的修饰方法是使用预先制备的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与赖氨酸残基形成稳定的酰胺键。但是NHS酯在水溶液中易水解，并且会与酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸反应生成副产物，限制了其应用。因此，亟待开发新的赖氨酸偶联方法，实现对多肽和蛋白质的高效无痕迹修饰。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一类新型的具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的多肽和蛋白质偶联试剂，可以在近生理条件下快速高效地与多肽或蛋白质序列中的赖氨酸残基化学选择性地发生O→N插入取代反应，实现对多肽及蛋白质的偶联。
本发明的技术方案如下：
一类新型的具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的多肽、蛋白质偶联试剂，所述偶联试剂结构如式(Ⅰ)所示：
其中R1选自：
H、
R2选自：
H、Cl、Br、I
R3选自：
H、
本发明所述的具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的偶联试剂合成路线如下：
(1)
(2)
(3)
(4)
所述具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的多肽、蛋白质偶联试剂的具体合成步骤为：
(1)以化合物1为初始原料，经过Sonogashira偶联反应实现化合物1与化合物2的偶联得化合物3,引入取代基R1；
(2)化合物3与卤代试剂反应，在苯环上引入一个卤素原子得化合物4，引入取代基R2；卤代试剂选自SO2Cl2、N-溴代丁二酰亚胺、N-碘代丁二酰亚胺任意一种；
(3)在硝酸银和三氟乙酸作用下化合物4发生环异构化生成2-苯并吡喃盐过渡态,随后在高价碘试剂IBX作用下发生氧化反应得到化合物5；
(4)化合物5与羧酸化合物6进行酯化反应得到化合物7，引入取代基R3。
本发明还提供了由式(Ⅰ)化合物对多肽或蛋白质进行偶联的方法，得到如式(Ⅱ)所示的多肽偶联产物和如式(Ⅲ)所示的蛋白质偶联产物。
其中，m表示蛋白质中游离胺基的数目。
优选地，所述多肽为多肽序列1(AcNH-QAWECMKF-CONH2)、多肽序列2(AcNH-APSKF-CONH2)或多肽序列3(AcNH-DRVYIHGKF-CONH2)；所述蛋白质为溶菌酶(Lysozyme C)、核酸内切酶(RNase A)或组蛋白(H2A)。
相对于现有技术，本发明的优点如下：
本发明的具有阿扎菲酮(azaphilone)结构的多肽、蛋白质偶联试剂在水溶液中稳定性好，对蛋白质的修饰操作简单方便，结构新颖，与目前已知的修饰试剂结构都不一样，偶联产物的连接稳定性好，为多肽、蛋白质的各种功能化修饰提供了一种新技术和新方式。
附图说明
图1为化合物5a在不同pH下对多肽序列1的修饰动力学；
图2为多肽偶联产物P-1的二级质谱；
图3为多肽偶联产物P-2的二级质谱；
图4为多肽偶联产物P-3的二级质谱；
图5为溶菌酶(lysozyme C)偶联产物的质谱图；
图6为核酸内切酶(RNase A)偶联产物的质谱图；
图7为组蛋白(H2A)偶联产物的质谱图；
具体实施方式
化合物1通过文献(Boger et al.J.Am.Chem.Soc.2008,130,12355-12369.)报道的方法合成。
本发明通过实施例1-8合成化合物：
合成路线为:
(1)
(2)
(3)
(4)
实施例1、4中的原料2a通过以下方法合成:
合成路线：
具体合成方法为：
将5g钠氢(122mmol,1.2eq.)、0.95g四丁基碘化铵(5.1mmol,0.025eq.)加入500ml圆底烧瓶中，N2保护，加入300ml无水四氢呋喃，降至0℃，滴加12ml二乙二醇单甲醚S2(102mmol,1.0eq.)；室温下搅拌15min；降至0℃，滴加10.5ml溴丙炔S1(122mmol,1.2eq.)，室温反应，TLC跟踪，反应结束后，加入30ml冰水淬灭，减压浓缩，旋去大部分四氢呋喃，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，减压蒸馏(5mm Hg,内温74℃，外温117℃)，得15.8g化合物2a，收率98％。
实施例2中原料2b通过以下方法合成:
合成路线：
具体合成方法为：
将12.6g钠氢(315mmol,3.0eq.)、1.9g四丁基碘化铵(5.25mmol,0.05eq.)加入1000ml圆底烧瓶中,N2保护，加入400ml无水四氢呋喃，降至0℃，滴加10ml二乙二醇S3(105mmol,1.0eq.)；室温下搅拌30min；降至0℃，滴加27.15ml溴丙炔S1(315mmol,3.0eq.)，滴毕移至室温，TLC跟踪，反应结束后，加入40ml冰水淬灭，减压浓缩，旋去大部分四氢呋喃，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析(PE:EA＝50：1-7：1)，得17.5g化合物2b，收率91％。
实施例3、5中原料2c通过以下方法合成:
合成路线：
具体合成方法为：
将83mg化合物S4(1.0mmol,1.0eq.)、401mg化合物S5(1.2mmol,1.2eq.)加入10ml圆底烧瓶中，N2保护，加入0.4ml无水三乙胺，8ml无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌，TLC跟踪，反应结束后，10％盐酸调至中性，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝200:1-15:1)，得228mg化合物2c，收率75％。
实施例6中原料2d通过以下方法合成:
具体合成方法为：
将55.4mg化合物S4(0.67mmol,1.0eq.)、216mg化合物S6(0.81mmol,1.2eq.)加入10ml圆底烧瓶中，N2保护，加入0.3ml无水三乙胺，6ml无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌，TLC跟踪，反应结束后，10％盐酸调至中性，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝200:1-15:1)，得133mg化合物2d，收率85％。
实施例1：
5a的合成，R2＝Cl、R3＝H。
将1.8g化合物1(7.8mmol,1.0eq.)、900mg四(三苯基膦)钯(0.78mmol,0.1eq.)、148mg碘化亚铜(0.78mmol,0.1eq.)置于50ml两颈瓶中，加装冷凝管，N2保护，加入15ml脱气的N,N-二甲基甲酰胺，5ml脱气三乙胺，加入2.4g化合物2a(15.6mmol,2.0eq.)，60℃下加热搅拌，TLC跟踪，反应结束后，10％盐酸调至中性，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝50:1-15:1)，得2.12g化合物3a，收率88％。
将1.81g化合物3a(5.87mmol,1.0eq.)置于100ml圆底烧瓶中，N2保护，加入45ml无水二氯甲烷，置于0℃，滴加0.57ml磺酰氯(7.04mmol,1.2eq.)，TLC跟踪，反应结束，加水淬灭，二氯甲烷萃取，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝50：1-6：1),得1.56g化合物4a，收率77％。
将390mg化合物4a(1.14mmol,1.0eq.)、18.7mg硝酸银(0.11mmol,0.1eq.)置于25ml圆底烧瓶中,N2保护，加入8ml二氯乙烷、0.8ml三氟乙酸，室温下搅拌，TLC跟踪；原料反应完全后，加入384mg 2-碘酰基苯甲酸(1.37mmol,1.2eq.)、21mg四丁基碘化铵(0.06mmol,0.05eq.),室温下反应，TLC跟踪，反应结束后，硫代硫酸钠淬灭，减压浓缩，柱层析分离(二氯甲烷:MeOH＝150:1-120:1)，得285mg化合物5a，收率70％。
5a核磁及质谱表征：1H NMR(500MHz,chloroform-d)δ7.89(s,1H),6.85(s,1H),4.34(s,2H),3.89(s,1H),3.79–3.74(m,2H),3.73–3.68(m,2H),3.67–3.63(m,2H),3.58–3.52(m,2H),3.37(s,3H),1.56(s,3H).13C NMR(126MHz,chloroform-d)δ193.99,190.22,160.32,151.85,138.94,115.84,110.15,106.24,84.26,71.99,71.13,70.79,70.73,68.78,59.17,28.55.HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C16H19ClNaO7 +381.0712；found381.0710.
实施例2：
同实施例1的方法，R2＝Cl、R3＝H。制得化合物5b。
5b核磁及质谱表征：1H NMR(500MHz,chloroform-d)δ7.89(s,1H),6.86(s,1H),4.35(s,2H),4.19(d,J＝2.4Hz,2H),3.88(s,1H),3.79–3.74(m,2H),3.73–3.67(m,6H),2.43(t,J＝2.4Hz,1H),1.57(s,3H).13C NMR(126MHz,chloroform-d)δ193.98,190.22,160.33,151.87,138.95,115.85,110.17,106.27,84.27,79.62,74.79,71.14,70.76,70.68,69.19,68.83,58.55,28.57.HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C18H19ClNaO7 +405.0712；found 405.0708.
实施例3：
同实施例1的方法，当R2＝Cl、R3＝H，制得化合物5c。
5c核磁及质谱表征：1H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.87(s,1H),6.68(s,2H),6.55(s,1H),5.95(t,J＝6.0Hz,1H),5.28(s,1H),3.31(dd,J＝9.2,6.6Hz,4H),2.52(t,J＝7.7Hz,2H),2.01(tt,J＝12.1,3.5Hz,1H),1.89–1.79(m,4H),1.68(td,J＝17.5,16.3,7.1Hz,3H),1.40(qd,J＝13.1,3.3Hz,2H),1.03–0.87(m,2H).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcdfor C25H28ClN2O7 +503.1580；found 503.1575.
实施例4：
5d的合成，R2＝H、R3＝H。
将1.8g化合物1(7.8mmol,1.0eq.)、900mg四(三苯基膦)钯(0.78mmol,0.1eq.)、148mg碘化亚铜(0.78mmol,0.1eq.)置于50ml两颈瓶中，加装冷凝管，N2保护，加入15ml脱气的N,N-二甲基甲酰胺，5ml脱气三乙胺，加入2.4g化合物2a(15.6mmol,2.0eq.)，60℃下加热搅拌，TLC跟踪，反应结束后，10％盐酸调至中性，EA萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝50:1-15:1)，得2.12g化合物3a，收率88％。
向10ml反应管中加入50mg化合物3a(0.16mmol,1.0eq.)、1.4mg AgNO3(0.008mmol,0.05eq.),N2保护，加入1.5ml二氯乙烷、0.15ml三氟乙酸，室温下搅拌，TLC跟踪；原料反应完全后，加入49mg 2-碘酰基苯甲酸(0.18mmol,1.1eq.)、3mg四丁基碘化铵(0.008mmol,0.05eq.),室温下反应，TLC跟踪，硫代硫酸钠淬灭，减压浓缩，柱层析分离(DCM:MeOH＝150:1-100:1)，得20mg化合物5d，收率38％。
5d核磁及质谱表征：1H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.85(d,J＝0.9Hz,1H),6.44(s,1H),5.58(d,J＝1.1Hz,1H),4.26(d,2H),3.74-3.72(m,2H),3.69-3.67(m,2H),3.65-3.63(m,2H),3.56-3.54(m,2H),3.37(s,3H),1.53(s,3H).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcdfor C16H21O7 +325.1282；found 325.1279.
实施例5：
同实施例4的方法，当R2＝H、R3＝H，制得化合物5e。
5e核磁及质谱表征：1H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.04(d,J＝1.1Hz,1H),6.82(s,2H),6.40(s,1H),5.49(d,J＝1.2Hz,1H),3.35(d,J＝5.8Hz,2H),3.23(t,J＝6.8Hz,2H),2.50(t,J＝7.5Hz,2H),2.12(tt,J＝12.1,3.5Hz,1H),1.88–1.77(m,4H),1.77–1.69(m,2H),1.65(dtd,J＝11.2,7.1,3.5Hz,1H),1.49(s,3H),1.41(qd,J＝12.7,3.4Hz,2H),1.00(qd,J＝13.0,3.5Hz,2H).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcd for C25H29N2O7 +469.1969；found 469.1968.
实施例6：
同实施例4的方法，当R2＝H、R3＝H，制得化合物5f。
5f核磁及质谱表征：1H NMR(400MHz,methanol-d4)δ7.99(d,J＝1.1Hz,1H),6.77(s,2H),6.35(s,1H),5.44(d,J＝1.2Hz,1H),3.72(t,J＝6.9Hz,2H),3.15(t,J＝6.8Hz,2H),2.46–2.36(m,4H),1.75(p,J＝7.0Hz,2H),1.43(s,3H).HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcdfor C20H21N2O7 +401.1343；found 401.1339.
实施例7：
化合物7的合成，R2＝Cl、
将50mg化合物5a(0.14mmol,1.0eq.)，38mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.20mmol,1.4eq.),8.6mg 4-二甲氨基吡啶(0.07mmol,0.5eq.)置于10ml圆底烧瓶中，N2保护，加入6ml无水N,N-二甲基甲酰胺，置于0℃，滴加19μL化合物6(0.17mmol,1.2eq.)，TLC跟踪，反应结束，二氯甲烷萃取，减压浓缩，柱层析分离(PE:Acetone＝100：1-10：1),得18mg化合物7，收率28％。
化合物7核磁及质谱表征：1H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.89(s,1H),6.88(s,1H),4.34(d,J＝1.0Hz,2H),3.78–3.74(m,2H),3.73–3.69(m,2H),3.68–3.64(m,2H),3.59–3.51(m,2H),3.38(s,3H),2.59(t,J＝7.3Hz,2H),2.28(td,J＝7.0,2.7Hz,2H),1.97(t,J＝2.6Hz,1H),1.86(p,J＝7.2Hz,2H),1.55(s,3H).HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd forC21H24ClO8 +453.1311；found 453.1307.
实施例8:
化合物9的合成：
R2＝Cl、R3＝H。
将11.4mg化合物5b(0.03mmol,1.0eq.)，14mg化合物8(0.027mmol,0.9eq.)置于10ml反应管中,加入8.5mg三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(0.016mmol,0.5eq.)，6mg六氟磷酸四乙腈铜(0.016mmol，0.5eq.),N2保护，加入2ml二甲亚砜，室温搅拌，HPLC跟踪，反应结束，HPLC分离,得7.6mg化合物9，收率31％。(分离条件，反相色谱柱：Agilent Eclipse XDB(5μm,9.4mm×250mm)；溶剂为乙腈-水(添加0.1％甲酸)；梯度：0-5分钟：10％乙腈，5-15分钟：10％-90％乙腈，15-25分钟：90％乙腈，25-30分钟：90％-10％乙腈，30-35分钟：10％乙腈)。
化合物9核磁及质谱表征：1H NMR(600MHz,methanol-d4)δ8.21(d,J＝8.2Hz,1H),8.10(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),8.02(s,1H),8.00(s,1H),7.77(d,J＝1.9Hz,1H),7.21(dd,J＝9.5,2.4Hz,2H),7.01(dt,J＝9.5,2.4Hz,2H),6.91(t,J＝2.4Hz,2H),6.85(s,1H),4.59(s,2H),4.48(t,J＝6.9Hz,2H),4.35(s,2H),3.75–3.69(m,2H),3.67–3.63(m,6H),3.43(t,J＝6.9Hz,2H),3.28(s,12H),2.22(p,J＝6.9Hz,2H),1.45(s,3H).13C NMR(151MHz,methanol-d4)δ196.65,192.06,170.92,168.56,162.32,161.68,159.03,158.78,153.79,145.96,141.52,140.37,137.09,134.43,132.54,131.62,129.88,129.58,125.32,116.91,115.23,114.95,97.37,71.89,71.61,71.58,70.79,69.39,65.02,64.41,40.89,38.31,30.96,27.60.HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcd for C46H48ClN6O11 +895.3064；found 895.3063.
实施例9：
稳定性分析：
将化合物5a-5f、7、9分别置于pH 7.0/7.4/8.0磷酸盐缓冲液中进行孵育，HPLC结果表明，孵育15小时，化合物5a-5f、7、9均未见明显水解，表明其在水溶液中高度稳定，优于传统的NHS酯。
实施例10：
5a对多肽序列1的偶联
将多肽序列1溶解在pH 7.0磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成10mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取60μL多肽序列1母液于1.5ml离心管中，加入90μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，HPLC监测偶联效率，反应10分钟，偶联效率约为80％(如图1所示)。同理，当磷酸盐缓冲液pH调整为7.4及8.0时，偶联效率提高，10分钟偶联效率分别为90％及98％。5a特异性与赖氨酸残基进行反应，修饰位点由二级质谱进行验证(如图2所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与多肽序列1偶联，均可获得同样的技术效果。
实施例11：
5a对多肽序列2的偶联
将多肽序列2溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成10mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取60μL多肽序列1母液于1.5ml离心管中，加入90μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，HPLC监测偶联效率，反应10分钟，偶联效率约为98％。5a特异性与赖氨酸残基进行反应，修饰位点由二级质谱进行验证(如图3所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与多肽序列2偶联，均可获得同样的技术效果。
实施例12：
5a对多肽序列3的偶联
将多肽序列3溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成10mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取60μL多肽序列1母液于1.5ml离心管中，加入90μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，HPLC监测偶联效率，反应10分钟，偶联效率约为98％。5a特异性与赖氨酸残基进行反应，修饰位点由二级质谱进行验证(如图4所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与多肽序列3偶联，均可获得同样的技术效果。
实施例13：
5a对溶菌酶(lysozyme C)的偶联
将溶菌酶(lysozyme C)溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成0.3mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取100μL溶菌酶(lysozyme C)母液于1.5ml离心管中，加入75μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，反应24h后，超滤进行脱盐处理，LC-MS进行质量表征，质谱数据表明溶菌酶(lysozyme C)中所有6个赖氨酸残基及1个N端胺基均被修饰(如图5所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与溶菌酶(lysozyme C)偶联，均可获得同样的技术效果。
实施例14：
5a对核酸内切酶(RNase A)的偶联
将核酸内切酶(RNase A)溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成0.3mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取100μL核酸内切酶(RNase A)母液于1.5ml离心管中，加入75μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，反应24h后，超滤进行脱盐处理，LC-MS进行质量表征，质谱数据表明核酸内切酶(RNase A)中所有10个赖氨酸残基及1个N端胺基均被修饰(如图6所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与核酸内切酶(RNase A)偶联，均可获得同样的技术效果。
实施例15：
5a对组蛋白(H2A)的偶联
将组蛋白(H2A)溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲液(100mM)中配置成0.3mM母液，将化合物5a溶解在二次水中配置成20mM母液，取100μL组蛋白(H2A)母液于1.5ml离心管中，加入120μL化合物5a母液，于37℃水浴中进行反应，反应24h后，超滤进行脱盐处理，LC-MS进行质量表征，质谱数据表明组蛋白(H2A)中所有13个赖氨酸残基及1个N端胺基均被修饰(如图7所示)。
将化合物5a-5f、7、9分别与组蛋白(H2A)偶联，均可获得同样的技术效果。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
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