阅读说明：本技术 一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物、制备方法及其应用 (Rotavirus-resistant compound in cassia wingnut, preparation method and application thereof ) 是由 胡秋芬 周敏 杨光宇 汪伟光 董淼 杨文武 高茜 刘欣 李雪梅 米其利 李晶 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗轮状病毒的化合物、制备方法及其应用。所述化合物的结构式如下：<Image he="233" wi="301" file="462399DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>；其制备方法包括样品提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离及凝胶柱层析。本发明以翅荚决明的枝叶为原料,提取出一种结构新颖的具有抗病毒活性的化合物,其具有较强的抗轮状病毒活性,抗轮状病毒实验表明,本化合物的TC<Sub>50</Sub>值为208.2μg/mL、IC<Sub>50</Sub>值为7.62μg/mL,治疗指数TI为27.3；其治疗指数远高于对照病毒唑的治疗指数20.8；本化合物毒性低,抗病毒活性好,可为抗轮状病毒药物研发提供高效、低毒的先导性化合物。另外,本发明化合物抗轮状病毒活性的分析为抗病毒药物筛选提供了新的化合物骨架类型,为抗病毒药物及机制的研究发展提供了一种新的思路。(The invention discloses an anti-rotavirus compound, a preparation method and application thereof. The structural formula of the compound is as follows: (ii) a The preparation method comprises the steps of sample extraction, silica gel column chromatography, high performance liquid chromatography separation and gel column chromatography. The invention extracts a compound with novel structure and antiviral activity by using branches and leaves of Cassia alata as raw materials, and the compound has stronger anti-rotavirus activity, and anti-rotavirus experiments show that TC of the compound 50 The value was 208.2 μ g/mL, IC 50 The value is 7.62 mug/mL, and the therapeutic index TI is 27.3; the therapeutic index of the composition is far higher than that of the control ribavirin by 20.8; the compound has low toxicity and good antiviral activity, and can provide a high-efficiency and low-toxicity pilot compound for the research and development of anti-rotavirus medicaments. In addition, the first and second substrates are,the analysis of the rotavirus resisting activity of the compound provides a new compound skeleton type for screening antiviral drugs, and provides a new idea for the research and development of the antiviral drugs and mechanisms.)

一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物化学领域，具体涉及一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物、制备方法及其应用。

背景技术

翅荚决明（Cassia alata L. ）为豆科决明属下的一个种。原产美洲热带地区，广布于全世界热带地区，在我国分布于广东和云南南部地区。该植物花色艳丽，有较高的观赏价值，常用作园林绿化树种。同时，它也是重要的药用植物，具有杀真菌、抗炎症、抗病毒的作用，可以用来治疗皮肤病，是香皂、洗发液、洗液的常用原料之一。它的种子含有的皂角苷可以作为驱除肠道寄生虫的驱虫剂；其叶水煎液常被用来治疗高血压、胃病、发烧、哮喘、毒蛇咬伤、性病等。从天然植物中寻找高效低毒的抗病毒活性分子也是当前天然产物化学的研究热点，临床上，多种药用植物资源广泛用于治疗各种病毒性感染疾病，如板蓝根、忍冬、甘草、苦参、大黄、菊花等。云南天然药物资源极为丰富，且与民族多样性相互交融，多种特色药物在长期民间用药中被证实具有抗病毒功效，因此，从特色药用植物资源中发现病毒抑制剂前景非常广阔。

综上，为了充分利用云南的丰富的翅荚决明资源，寻找高效低毒的抗病毒活性分子，本发明对翅荚决明的化学成分进行研究，并从中分离到一个新骨架类型的化合物，该化合物为色酮和异香豆素的聚合体，具有明显的抗轮状病毒活性。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物，本发明的第二目的是提供一种抗轮状病毒的化合物的制备方法，本发明的第三目的是提供抗轮状病毒的化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物，所述化合物为色酮和异香豆素的聚合体，命名为翅荚决明素B，英文名为：alatain B, 分子式为C₂₄H₂₀O₈。

结构式如下：

其中，本化合物的a片段为色酮，b片段为异香豆素。

本发明的第二目的是这样实现的，所述抗轮状病毒病毒的化合物的制备方法，包括样品提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离及凝胶柱层析，具体包括以下步骤：

A、样品提取：以翅荚决明枝叶为原料，将其晒干、粉碎至30~50目，用第一溶剂浸泡提取2~4次，再将提取液合并、过滤并浓缩得到枝叶提取物浸膏；

B、硅胶柱层析：将所述浸膏上硅胶柱层析，以氯仿和丙酮体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，20:1的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，经TLC监测后，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩合并；

C、高压液相色谱分离：将B步骤中9:1的氯仿-丙酮洗脱浓缩得到的样品经高效液相色谱分离纯化，得目标物粗品；

D、凝胶柱纯化：将所述目标物粗品用甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析进一步分离纯化得目标物纯品；

其中，所述高效液相色谱分离纯化条件如下：以体积浓度为70~80%的甲醇水溶液为流动相，流速15~25 mL/min，以21.2 × 250 mm，5 μm的ZorbaxSB-C₁₈反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为340~365 nm，每次进样0.5 ~ 1.0 mL，收集30 ~ 40 min的色谱峰，多次累加后蒸干得目标物粗品。

本发明的第三目的是这样实现的，所述抗轮状病毒的化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用，所述抗轮状病毒药物包括所述化合物即翅荚决明素B。

所述抗轮状病毒药物包括翅荚决明素B和/或翅荚决明素B药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果为：

1、本发明以翅荚决明的枝叶为原料，提取出一种结构新颖的具有抗病毒活性的化合物，其具有较强的抗轮状病毒活性，抗轮状病毒的实验表明，所述化合物的TC₅₀值为208.2 µg/mL、IC₅₀值为7.62 µg/mL，治疗指数TI为27.3；其治疗指数远高于对照病毒唑的治疗指数20.8；另外，本化合物毒性低，抗病毒活性好，可为抗轮状病毒药物研发提供高效、低毒的先导性化合物。

2、本化合物的制备方法简单，另外，翅荚决明在我国南方发布广泛，生长迅速、生物产量达，原料来源广泛、成本低；而且枝叶再生能力非常强，可持续为本发明所述的活性化合物的分离制备提供原料，因此本化合物可以进行可持续的大规模生产与制备。

3、本发明所述化合物为色酮和异香豆素的聚合体，其中化合物的a片段为色酮，b片段为异香豆素；该类型化合物的抗病毒活性在公开文献中从未见报道，因此，本化合物抗轮状病毒活性的分析为抗病毒药物筛选提供了新的化合物骨架类型，为抗病毒药物及机制的研究发展提供了一种新的思路。

附图说明

图1本发明化合物的核磁共振碳谱（¹³C NMR）。

图2为本发明化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）。

图3本发明化合物的关键HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所采用的原料和设备若非特指，均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明一种翅荚决明中抗轮状病毒的化合物，结构式如下：

本发明抗轮状病毒的化合物的制备方法，包括样品提取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离及凝胶柱层析，具体包括以下步骤：

A、制备翅荚决明枝叶提取物浸膏：以翅荚决明枝叶为原料，将其晒干、粉碎至30~50目，用第一溶剂浸泡提取2~4次，再将提取液合并、过滤并浓缩得到枝叶提取物浸膏；

B、硅胶柱层析：将所述浸膏上硅胶柱层析，以氯仿和丙酮体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，20:1的氯仿-丙酮洗脱液进行梯度洗脱，经TLC监测后，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩合并；

C、高压液相色谱分离：将B步骤中9:1的氯仿-丙酮洗脱浓缩得到的样品经高效液相色谱分离纯化，得目标物粗品；

D、凝胶柱纯化：将所述目标物粗品用甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析进一步分离纯化得目标物纯品；

其中，所述高效液相色谱分离纯化条件如下：以体积浓度为70~80%的甲醇水溶液为流动相，流速15~25 mL/min，以21.2 × 250 mm，5 μm的Zorbax SB-C₁₈反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为340~365 nm，每次进样0.5 ~ 1.0 mL，收集30 ~ 40 min的色谱峰，多次累加后蒸干得目标物粗品。

所述有机溶剂是60 %~100 %的乙醇、甲醇或丙酮的水溶液。

所述步骤A中，每次用1.5~4倍样品质量份的溶剂进行提取，提取时间为12 h~72h。

所述步骤B中，所述浸膏在经硅胶柱层析前，用1~3倍浸膏重量份的丙酮、乙醇或甲醇溶解，再用1~1.6倍浸膏重量份的60~120目硅胶拌样后上样。

所述步骤B中，装柱硅胶为160~300目，所用硅胶的重量为2~5倍量浸膏重量。

本发明抗轮状病毒的化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。

所述抗轮状病毒药物包括所述化合物。

所述抗轮状病毒药物包括所述化合物和/或所述化合物药学上可接受的载体或赋形剂。

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例中翅荚决明枝叶采于云南德宏。

将翅荚决明枝叶晒干、粉碎到30目，取样3.0 kg以70%的丙酮水溶液提取3次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩得浸膏150 g。

将浸膏用180g的甲醇溶解，然后加入80目粗硅胶200 g拌样，用160目硅胶1.0 kg装柱，拌样后上柱；用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-丙酮溶液洗脱得到的洗脱液并浓缩得16.8克浓缩物。浓缩物以78％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈ (21.2 × 250 mm, 5 μm)制备柱为固定相，流动相流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为357 nm，每次进样1.0mL，收集停留时间为36.8 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明翅荚决明素B粗品；将所述翅荚决明素B粗品用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析纯化即得翅荚决明素B纯品。

实施例2

本实施例中翅荚决明枝叶采于云南西双版纳。

将翅荚决明枝叶晒干粉碎至50目，取样3.5 kg,以95%的乙醇提取3次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩得浸膏140 g。浸膏用280g甲醇溶解后，用120目粗硅胶150g拌样，用200目硅胶0.9 kg 装柱，拌样后上柱；再用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-丙酮溶液洗脱得到的洗脱液并浓缩得26.4克浓缩物。以70％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈ (21.2 × 250 mm, 5 μm)制备柱为固定相，流动相流速为25ml/min，紫外检测器检测波长为357 nm，每次进样1.0 mL，收集停留时间为36.8 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得翅荚决明素B粗品。将翅荚决明素B粗品用甲醇溶液溶解，再以甲醇溶液为流动相，用SephadexLH-20 凝胶柱层析分离，即得翅荚决明素B纯品。

试验例1

本化合物为黄色胶状化合物，通过MS、HRMS、 1H NMR、1H和13C NMR 、HMBC及DEPT 等光谱技术对实施例1-2分离得到的抗轮状病毒病毒的化合物进行结构鉴定，具体数据及分析如下：

化合物波谱数据：紫外光谱（溶剂为甲醇） 210 (4.26)、258 (3.68)、292(3.72)、357 (3.47) nm。红外光谱(溴化钾压片) 3418、2943、1722、1657、1606、1548、1432、1359、1146、1050、978、826 cm^–1。ESIMS峰m/z 459 [M+Na]⁺；HRESIMS m/z 459.1050[M+Na]⁺ (计算值459.1056，C₂₄H₂₀O₈Na)；¹H和¹³C NMR谱(图1和图2)，数据见表1。

本化合物紫外光谱、红外光谱显示有羟基、羰基和芳环的特征吸收。高分辨质谱(HRESIMS) 给出准分子离子峰m/z 459.1050 [M+Na]⁺ (计算值459.1056)。结合¹H和¹³ CNMR谱给出一个分子式C₂₄H₂₀O₈，不饱和度为15。

翅荚决明素A的¹H NMR谱 (图1) 显示了一些特征信号，包括1个甲基，1个甲氧基、三个亚甲基，两个双键单峰信号、一个1,2,3,5-四取代苯环信号和一个1,2,3,4-四取代苯环信号。其₁₃C和DEPT NMR谱 (图2) 显示了24个碳信号包括了2个甲基碳 (包括一个含氧甲基)，3个亚甲基（包括1个含氧碳信号），6个烯碳次甲基乙基13个季碳原子信号（包括了3个羰基和5个含氧碳信号）。其中，3个羰基和 18个烯碳占据了12个不饱和度，提示化合物为1个四环体系的化合物。综上所述，初步可以判断翅荚决明素A为一个高度芳构化的异分子二聚体（见图3），它主要由一个C₁₃色酮母核 (1a片段)和一个二环芳烃片段构成 (1b片段)，其平面结构通过1D和2D核磁共振综合解析得到确定：在片段1a的色酮母核 (环A和B)通过特征¹H和¹³C信号得到确定。该片段通过H-3 (δ _H 6.28, s)和C-2/C-4/C-10，H-6 (δ _H 6.56, d,J = 1.8 Hz)与C-8/C-10以及H-8 (δ _H 6.67, d, J = 1.8 Hz)与C-6/C-10的HMBC相关得到确定。除此之外，一个羰基片段 (C-11 至 C-13的三碳单元)和一个羟基 (7-OH) 分别连接在色酮片段的C-5 和C-7位，该推论通过H₂-11 (δ _H 4.15, s) 与 C-6/C-10，以及 7-OH (δ _H10.70, s) 与 C-6/C-7/C-8 得到证实。这些特征与已知化合物 5-acetonyl-7-hydroxy-2-methylchromone 非常类似，不同之处仅仅是原本A环中的C-14甲基变成了1a中的亚甲基，该推测通过H-3与C-14，以及H₂-14和C-2、C-3 、C-9 (⁴ J _CH)得到证实，推测1a片段通过C-14与1b片段连接起来。

余下的11个碳信号（包括1个甲氧基、1个含氧的亚甲基、3个烯碳次甲基和6个季碳信号）归属为1个含有1个甲氧基和一个羟甲基的C9二环结构（1b片段）。进一步通过关键的HMBC信号H-4'与C-1'(⁴ J _CH)、C-3'、C-4a'、C-5'、C-8a'和 C-9'相关，H-7'与C-5'、C-6'、C-8'和C-8a'相关，H-8'与 C-4a'、C-6'、C-7'和 C-8a'相关确定该C9母核为一个异香豆素骨架。除此之外，取代基1个甲氧基和一个羟甲基通过相应的HMBC确定分别连接在C-8' 和 C-3'位置上。最终，片段1a和1b通过关键的H₂-14 与 C-4a'/C-5'/C-6' HMBC相关证实其通过C-14和C-5'连接起来，至此，化合物翅荚决明素B结构得以确定，其英文名为alatain B。

试验例2 本发明化合物的抗轮状病毒活性检测

方法：取实施例1~2制备的化合物作为样品进行抗轮状病毒活性试验，采用体外细胞测试法，即样品与病毒同时作用于MA104细胞后，通过Alarmablue法检测样品对病毒感染致细胞死亡的保护作用，从而测定样品对轮状病毒的活性作用。

(a) 药物的细胞毒性检测

MA104细胞在 96 孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的样品液，继续培养3天后，更换含Alamarblue的培养液，继续培养2～3小时后检测其530/590nm处的荧光值，从而检测样品对 MA104 细胞的毒性，并计算半数细胞毒浓度（TC₅₀）。

(b) 药物抗轮状病毒作用检测

MA104细胞在 96 孔细胞培养板中培养形成单层后，100TCID50的病毒液和不超过20％细胞毒性的梯度浓度药物溶液同时加到MA104细胞上，继续培养4-6天后，更换含Alamarblue的培养液继续培养2~3小时后检测其530/590nm处的荧光值，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

(c) 根基TC₅₀/ IC₅₀计算化合物的治疗指数

结果表明，本发明化合物的TC₅₀值为208.2 µg/mL、IC₅₀值为7.62 µg/mL，治疗指数TI为28.8；其治疗指数超过对照病毒唑(TC₅₀值258.4、IC₅₀值9.5)的治疗指数27.3，表明本化合物具有很好的抗轮状病毒活性。

综上所述，本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景；其结构简单，活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂的研发。