一种snp分子标记在鉴定高繁殖性能奶牛及辅助育种中的应用
阅读说明：本技术 一种snp分子标记在鉴定高繁殖性能奶牛及辅助育种中的应用 (Application of SNP molecular marker in identification of high-reproductive-performance dairy cows and auxiliary breeding ) 是由 王金鹏 黄金明 鞠志花 杨春红 高运东 刘文浩 肖遥 张亚冉 魏晓超 高亚平 姜 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种SNP分子标记在鉴定高繁殖性能奶牛及辅助育种中的应用,属于生物化学遗传育种技术领域,具体通过牛50K SNP芯片和全基因组关联分析的方法提供了SIGLEC12基因作为奶牛妊娠期标记基因的应用,并通过分子生物学相关技术提供了SIGLEC12基因第七外显子的一组单倍型的信息,可用于选择具有优势妊娠周期基因型的奶牛个体。养殖企业通过选择优势基因型个体留种,可以提高SIGLEC12基因妊娠周期优势基因型在奶牛群体中的频率,从而优化奶牛群体的妊娠周期,提高奶牛的繁殖效率,降低养殖成本,增加经济效益。本发明为加速奶牛的妊娠周期遗传改良提供了一种新的方法。(The invention relates to an application of SNP molecular markers in identification of high-reproductive-performance dairy cows and auxiliary breeding, belongs to the technical field of biochemical genetic breeding, and particularly provides an application of SIGLEC12 gene as a marker gene of the dairy cows in gestation period by a method of carrying out correlation analysis on a 50K SNP chip of a cow and a whole genome, provides information of a group of haplotypes of a seventh exon of SIGLEC12 gene by a molecular biology correlation technology, and can be used for selecting dairy cows with dominant gestation period genotypes. By selecting the dominant genotype individual for seed reservation, breeding enterprises can improve the frequency of the dominant genotype of the SIGLEC12 gene pregnancy period in the dairy cow population, thereby optimizing the pregnancy period of the dairy cow population, improving the breeding efficiency of the dairy cows, reducing the breeding cost and increasing the economic benefit. The invention provides a new method for accelerating the genetic improvement of the pregnancy period of the dairy cow.)
技术领域
本发明属于奶牛育种标记物技术领域，具体涉及一种SNP分子标记、检测所述SNP分子标记的引物序列及包含所述引物序列的试剂盒，还提供所述SNP分子标记、引物及试剂盒在鉴定高繁殖性能奶牛及辅助育种中的应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。随着世界人口的增长，联合国粮农组织(FAO)预测到2050年全球人类消费牛奶的需求将增长50％。数十年来乳业生产系统为了提高产奶量提出了一系列选择方法，并降低土地成本、管理成本等，奶牛的养殖越来越趋向于集约化。但伴随集约化养殖的高牛奶产量，出现了越来越多的动物健康问题，尤其是繁殖方面的问题，如安静发情或不发情，产后卵巢活性降低，受孕率降低，淘汰率和死亡率升高，总体上奶牛的繁殖能力逐渐降低(Gaddis et al.,2016；Gutierrez-Reinoso et al.,2021)。
良好的繁殖性能是奶牛生产系统中保障盈利的关键因素(Shallo et al.,2014)。产犊间隔常被作为评价奶牛繁殖性能的指标(Roche et al.,2017)。产犊间隔是一个复杂的性状，具有较低的遗传力(Berry et al.,2014),意味着表型变异中只有一小部分是由可度量的加性遗传方差解释(Berry and Evans,2014)。相比较而言，妊娠周期具有中等程度的遗传力，遗传力为0.33～0.62(Hansen et al.,2004；Norman et al.,2009)，意味着如果妊娠周期中有相当大比例的加性遗传变异可以预测，就可以实现对表型的相对准确的预测。由于在配子发生过程中同源染色体的分离是相对随机的，仅根据系谱信息不可能实现对遗传价值的高准确性预测。因此，基于基因型的预测产生更精确的遗传估计，可作为评价奶牛繁殖性能的指标。
妊娠周期度量了哺乳动物的胎儿发育过程中从怀孕到分娩的关键阶段。在妊娠周期发生的事件对于后代的健康、生产能力和繁殖力具有重要的影响。妊娠周期的异常将导致早产或过期产，导致急性的和长期的健康问题。妊娠周期与健康、生产和繁殖性能高度相关。妊娠周期延长能导致胎儿体重增加、怀孕率降低和难产(Vieira-Neto et al.,2017)。合理范围内妊娠周期短的奶牛繁殖效率更高，意味着更低的饲养成本、管理成本，更高效的产犊能力，可为牧场带来更高的收益。在荷斯坦牛群体中鉴定到25个SNP位点与妊娠周期显著相关，分布于6个QTL区域内，其中最为显著的SNP位点位于第18号染色体的ZNF613基因的下游，可解释1.37％的遗传变异(Purfield et al.,2019)。
研究表明，274-281天的妊娠周期对于荷斯坦牛群体是最理想的，其产奶量最大化，使产犊难易、围产期死亡率等达到最低。在我国的荷斯坦牛群体中，仍存在优化妊娠周期的空间。但是，关于牛妊娠周期的遗传机制研究较少，相关的分子标记开发工作亟待加强。全基因组关联分析方法(GWAS)是解析复杂性状遗传机制、定位关键候选分子标记位点的有力手段，已在模式物种和非模式物种的质量性状和数量性状遗传机制解析上发挥了重要作用。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素13(SIGLEC12)属于免疫球蛋白超家族的细胞表面蛋白家族。它们通过选择性结合在糖脂和糖蛋白上的不同唾液酸片段来介导蛋白质-碳水化合物的相互作用。SIGLEC12基因与荷斯坦奶牛的产犊性状显著相关，现有研究表明SIGLEC12基因在人类胎盘中表达。
发明内容
基于上述研究背景，本发明目的在于提供一种缩短牛妊娠期的遗传改良方法，为了实现该技术目的，本发明设计筛选与牛妊娠期相关的分子标记辅助育种，从而提高繁殖效率。现有研究表明SIGLEC12基因与荷斯坦奶牛的产犊性状显著相关，可能参与分娩的起始。本发明将SIGLEC12基因作为奶牛妊娠周期候选基因，研究其变异位点与奶牛繁育性状的相关性，并得到如下技术方案：
本发明首先提供一种SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述序列的第481bp处的单核苷酸位点为T或G，第485bp处的单核苷酸位点为G或A，第531bp处的单核苷酸位点为C或T。
本发明的技术方案改善种群奶牛的妊娠期长短的方法是：通过PCR方法获得了奶牛妊娠期周期性状相关的分子标记。进一步的研究中，本发明通过PCR方法提供一个奶牛妊娠周期性状相关SIGLEC12基因，通过Bovine SNP50芯片在该基因的第7外显子上鉴定到3个SNP位点，组成1个单倍型。在荷斯坦牛群体中，针对SIGLEC12基因第7外显子的3个SNP的基因型与该群体牛的妊娠期长短基因组育种值进行关联分析，分析结果表明该单倍型与奶牛妊娠周期显著相关。根据上述SNP位点的鉴定结果，养殖人员可以选择有利的单倍型个体留种，从而改善奶牛群体的妊娠周期性状，提高繁殖效率。
本发明采用的SNP鉴定方法如下：通过Bovine SNP50芯片在奶牛群体中进行基因型鉴定，发现SIGLEC12基因第7外显子上存在3个SNP位点(chr18:g.57591390T>G,chr18:g.57591394G>A,chr18:g.57591440C>T)(SNP位点的坐标位置以牛参考基因组UMD3.1为标准)(附图1)，且突变位点完全连锁，组成一个单倍型组合TGC/GAT；通过奶牛群体基因型和奶牛妊娠周期基因组估计育种值的关联分析，证明该单倍型组合与奶牛妊娠周期显著相关。
基于上述研究结果，SIGLEC12基因第7外显子中所述SNP分子标记可作为鉴定高繁殖性状奶牛和辅助育种的标记物，可用于筛选妊娠期更短的亲本个体，有效缩短繁育周期，节约繁育资源。另外上述分子标记物的相关检测试剂还可以开发为中国荷斯坦奶牛繁育相关产品。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明利用牛SIGLEC12基因第7外显子上的3个SNP位点的信息，并且采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在该3个位点的基因型，实现对具有短妊娠期的基因型个体的早期选择。
2、本发明鉴别了1组由3个SNP组合构成的单倍型，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛SIGLEC12基因在此位点的基因型，并且通过和奶牛妊娠周期性状的估计育种值的关联分析，选择有利的单倍型个体留种，可以提高SIGLEC12基因短妊娠期基因型在奶牛群体中的频率，从而提高奶牛群体的繁殖效率，减少牧场的饲养成本，提高养殖效益。本发明为奶牛的妊娠周期遗传改良提供了一种新的方法。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为SIGLEC12基因第7外显子序列上的3个SNP位点的一代测序结果；
图2为牛SIGLEC12基因野生型的氨基酸序列及预测的二级结构示意图；
图3为牛SIGLEC12基因突变型的氨基酸序列及预测的二级结构示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，妊娠期的长短关系到后代的健康、生产能力等多项指标，合理范围内的缩短妊娠期能够有效的提高奶牛繁殖效率，降低饲养成本。为了实现缩短牛妊娠期遗传改良育种，本发明对与牛妊娠期相关的分子标记进行了筛选，确认SIGLEC12基因第7外显子上3个SNP组成的单倍型与奶牛妊娠周期相关，可作为辅助育种标志物，提高奶牛繁殖效率。基于上述成果，本发明提供了所述SNP分子标记在鉴定高繁殖性能中国荷斯坦奶牛及辅助育种中的应用。
本发明第一方面，提供一种SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，所述序列的第132bp处的单核苷酸位点为T或G，第136bp处的单核苷酸位点为G或A，第182bp处的单核苷酸位点为C或T。
根据本发明的研究结果，SIGLEC12基因第7外显子上的SNP位点chr18:g.57591390T>G属于同义突变，其所在的野生型密码子TCT和突变型密码子TCG都编码丝氨酸(S)。SNP位点chr18:g.57591394G>A属于错义突变，其所在的野生型密码子GAG编码谷氨酸(E)，突变型密码子AAG编码赖氨酸(K)；SNP位点chr18:g.57591440C>T属于错义突变，其所在的野生型密码子GCG编码丙氨酸(A)，突变型密码子GTG编码缬氨酸(V)。
本发明第二方面，用于检测第一方面所述SNP分子标记的引物，所述上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
第一方面所述SNP分子标记位于SIGLEC12基因的第7外显子，所述第7外显子的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。本发明第一方面所述SNP分子标记为PCR手段扩增牛SIGLEC12基因第7外显子得到的扩增产物，所述扩增产物序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示，大小为421bp。
上述SNP分子标记中，其中SEQ ID NO:4所示序列代表优势性状，而SEQ ID NO:5所示代表劣势性状。
本发明第三方面，包含第二方面所述引物的试剂盒。
优选的，所述试剂盒中，还包括采样工具、基因组DNA提取试剂或PCR反应试剂中的一种或几种。
本发明第四方面，提供第一方面所述SNP分子标记在鉴定高繁殖性能奶牛中的应用。
优选的，所述SNP分子标记是上述三种SNP位点的组合，所述SNP位点位于SIGLEC12基因序列的第3401bp、第3405bp或第3451bp处的碱基；其中，所述第3401bp处碱基为G，所述第3401bp处碱基为A或所述第3451bp处的碱基为T，即g.+3401T>G,g.+3405G>A,g.+3451C>T；在本发明效果较好的方案中，上述位点的组合为单倍型GAT作为高繁育性能标志物。当SIGLEC12基因序列上述位点表现为GAT单倍型为奶牛妊娠周期性状的优势单倍型。
优选的，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛、三河牛、新疆褐牛或草原红牛中的一种。进一步优选的方案中，上述SNP分子标记用于鉴定高繁育性能的中国荷斯坦奶牛。
本领域所述家畜的繁育性能包括受配率、受胎率、不返情率、配种指数、产犊率、产犊指数、犊牛成活率及繁殖成活率等。第四方面所述方案中，所述高繁殖性能具体指代中国荷斯坦奶牛妊娠期的长短，应当明确的是，上述SNP分子标记用于鉴定具有合理地、较短妊娠期的奶牛，所述GAT单倍型表现型的奶牛具有更短的妊娠期。
本发明第五方面，提供第二方面所述SNP分子标记的检测引物、第四方面所述试剂盒在鉴定高繁育性能中国荷斯坦奶牛，或中国荷斯坦奶牛辅助育种中的应用。
本发明第六方面，提供一种鉴定高繁育性能中国荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：
(1)提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模版，利用第二方面所述引物对通过PCR反应扩增中国荷斯坦奶牛SIGLEC12基因的第7外显子；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增序列中包括第一方面所述SNP分子标记，则待测牛属于高繁殖性能个体。
优选的方案中，所述扩增序列中，第481bp、第485bp、第531bp处为基因型为GAT时，判断为高繁育性能个体。
本发明第七方面，提供一种中国荷斯坦奶牛的辅助育种方法，所述辅助育种方法包括采用第六方面所述鉴定方法获得优势单倍型的荷斯坦奶牛个体作为亲本进行育种。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
下面对本发明的影响奶牛妊娠周期SIGLEC12基因的第7外显子及其分子标记与应用作以下详细说明。
本发明的影响奶牛妊娠周期SIGLEC12基因的第7外显子及其分子标记与应用，其具体方案是：
1.筛选SIGLEC12基因作为奶牛妊娠周期候选基因
(1)在11个规模化养殖场中采集2709头荷斯坦母牛血液或毛囊样本
在全国11个牧场采集荷斯坦牛样品，牧场所在地点和每个牧场采集的样品数见表1.
表1.采集样品的牧场所在地点及采集样品数目
牧场所在地点
样品数目
牧场所在地点
样品数目
甘肃金昌
294
河北邢台
279
内蒙古通辽
399
江苏宿迁
285
新疆塔城
200
山东德州
200
山东临沂
398
山东济南
94
山东泰安
96
山东东营
268
广东广州
196
(2)使用Illumina BovineSNP50芯片测定所采集样品的基因型。基因型的测定由纽勤公司执行，共获得47843个SNP标记位点的基因型。
(3)根据基因型估计每个个体的妊娠周期基因组育种值。基因组估计育种值由纽勤公司执行。
(4)使用GEMMA软件基于基因型数据，针对妊娠周期基因组育种值进行全基因组关联分析，分析模型使用混合线性模型，牧场和牛月龄作为协变量。使用FDR方法进行多重检验校正。关联分析结果显示最为显著的3个SNP位点位于SIGLEC12基因上的第7外显子上，组成单倍型，显著性P值为2.63E-04。
2.SIGLEC12基因第7外显子优势单倍型的鉴定
在采集到的2709头荷斯坦牛中，鉴定到具有GAT/GAT纯和单倍型的个体有2586个，其妊娠周期估计育种值的均值为-0.699，具有TGC/GAT杂合单倍型的个体有123个，其妊娠周期估计育种值的均值为-0.024，而在基因组遗传评估中，妊娠周期基因组育种值越低越好，因此GAT为优势单倍型。
3.牛SIGLEC12基因第7外显子部分序列扩增
(1)牛尾部静脉血液采集
选择妊娠周期长的牛和妊娠周期短的牛为试验材料，采集牛的尾部静脉血液。
(2)基因组DNA提取
取全血500μL，加入500μL STE裂解缓冲液，依次加入50μL 10％SDS、5μL蛋白酶K(20mg/ml)，56℃裂解约3h，至裂解液澄清。加入同体积饱和酚(250μL)，氯仿/异戊醇(24:1)(250μL)，轻轻晃动20min，12000rpm离心10min。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清，加入同体积氯仿/异戊醇，轻晃20min，12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20℃静置20min，12500rpm离心20min。将核酸沉淀于管底。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入20μL TE(含RNaseA)溶解DNA，37℃静置约30min后，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
(3)引物设计
根据牛SIGLEC12基因(GenBank基因登录号为LOC618463)的基因序列，设计一对特异引物。其中，
正向引物为SIGLEC12-5F：5’-GGGCGTGGGACAACTAAC-3’
反向引物为SIGLEC12-3F：5’-AGGGCTCAGCAGGAAAGG-3’；
(4)复合酶链式反应
用此引物进行PCR扩增，反应体系如下：10×Buffer 1μL，2.5mM dNTP 0.8μL，2.5mM MgCl2，0.6μL，引物F(10μM)0.1μL，引物R(10μM)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，模板0.5μL，LCGreen饱和荧光染料0.7μL，加H2O补足至10μL。扩增反应在Applied Biosystem PCR系统上完成，反应条件如下：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃1min；35个循环；72℃5min。通过Sanger测序测定PCR产物的单倍型。
选择奶牛核心群个体，利用上述分子生物学相关技术检测SIGLEC12基因chr18:g.57591390T>G,chr18:g.57591394G>A,chr18:g.57591440C>T三个位点的基因型，选择有利的单倍型个体留种，可改良奶牛群体的妊娠周期性状，提高繁殖效率，降低养殖成本，增加养殖收益，为培育高繁殖效率的优良奶牛新品系奠定基础。
实施例2
采用Sanger测序方法对SIGLEC12第7外显子的3个SNP位点在荷斯坦牛群体中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，其结果见表2，其包括我国多个牧场中的荷斯坦牛。检测结果表明在我国荷斯坦奶牛群体中存在2种基因型；在所有检测的群体中，GAT/GAT单倍型组合频率为97.8％，TGC/GAT单倍型组合频率为2.2％，GAT单倍型为优势单倍型(见表2)。
表2牛SIGLEC12基因在荷斯坦牛群体中的分布结果
表2说明：上述群体材料均为我国荷斯坦牛群体，其中：群体1为甘肃某牧场的荷斯坦牛群体，群体2为河北某牧场的荷斯坦牛群体，群体3为内蒙古某牧场的荷斯坦牛群体。
为了确定牛SIGLEC12单倍型与牛妊娠周期差异是否相关，选择2709头荷斯坦牛用于SIGLEC12单倍型与妊娠周期估计育种值的关联分析。TGC/GAT单倍型个体的平均基因组育种值为-0.024，GAT/GAT单倍型个体的平均基因组育种值为-0.699。使用PLINK v1.90软件分析不同单倍型与牛妊娠周期性状的相关性，结果显示单倍型与基因组育种值之间为显著相关(P值为5.052e-11)。
本发明鉴别了1组由3个SNP组合构成的单倍型，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛SIGLEC12基因在此位点的单倍型，并且通过和奶牛妊娠周期性状的估计育种值的关联分析，选择有利的单倍型个体留种，可以提高SIGLEC12基因妊娠周期优势单倍型在奶牛群体中的频率，从而提高奶牛群体的繁殖效率，减少牧场的饲养成本，提高养殖效益，为奶牛的妊娠周期遗传改良提供了一种新的方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东奥克斯畜牧种业有限公司
<120> 一种SNP分子标记在鉴定高繁殖性能奶牛及辅助育种中的应用
<130> 202123885
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggctcagc aggaaagg 18
<210> 4
<211> 421
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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ctggactccc tagaggagcc ctcttaaagg ccttggtctc ttttcagggt gaagatctac 120
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gtgtcccggg tgagtgacgt gggcggcttg ccgtccagtg tccccaccgg acccctctgc 240
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cgtctttctg cactcgccgg agcctagaat tcaccgagtc ctgtccatct tccgtttagc 420
a 421
<210> 5
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