一种用于自由流电泳的等电点标准品
阅读说明：本技术 一种用于自由流电泳的等电点标准品 (Isoelectric point standard substance for free flow electrophoresis ) 是由 马艳 师要辉 吴清灵 马校卫 张思齐 沈治峰 袁新玲 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于自由流电泳的等电点标准品,包括：等电点物质,所述等电点物质设有8种,且每个等电点物质对应不同等电点,所述等电点物质均带有可肉眼直接观察的颜色,所述等电点物质的等电点在3.8-10.1之间,所述等电点物质由超纯水稀释的小分子物质组成,所述等电点物质分子量在200-600KDa之间,均为苯环、杂环类物质。本等电点标准品满足pH3-10、pH7-10和pH5-8体系标准,在异构体分离制备过程中可以对pH进行定位,极大的提高了异构体的定位,缩短异构体制备时间。(The invention provides an isoelectric point standard for free flow electrophoresis, which comprises: the device comprises 8 isoelectric point substances, wherein each isoelectric point substance corresponds to different isoelectric points, the isoelectric point substances have colors which can be directly observed by naked eyes, the isoelectric points of the isoelectric point substances are between 3.8 and 10.1, the isoelectric point substances are composed of small molecular substances diluted by ultrapure water, and the isoelectric point substances have molecular weights between 200 and 600KDa and are benzene rings and heterocyclic substances. The isoelectric point standard meets the system standards of pH3-10, pH7-10 and pH5-8, can position the pH in the process of separating and preparing isomers, greatly improves the positioning of the isomers and shortens the preparation time of the isomers.)
技术领域
本发明属自由流电泳技术领域，具体涉及一种用于自由流电泳的等电点标准品。
背景技术
电荷异构体分析是生物治疗蛋白质的一项监管要求。这些大的异质分子在生产过程中历经多种酶促翻译后修饰，例如糖基化和赖氨酸切断。此外，在纯化和储存过程中可发生多种化学修饰，例如氧化或脱氨。自由流电泳是制备蛋白质药物电荷异构体的最佳方法。
自由流电泳(Free Flow Electrophoresis，FFE)是半制备型分离技术，具有可连续分离、多种分离模式、无固定支持介质和分离条件温和等优势，特别适用于生物材料的分离纯化和制备。自由流等电聚焦电泳(IEF-FFE)利用连续流动的两性电解质溶液，在分离室内的电场方向形成线性pH梯度。样品随溶液纵向流动，并在电场作用下发生横向偏转，达到其等电点处不再横向移动，被强制聚焦在此位置，不受扩散和对流的影响，仅在溶液流动方向移动。具有不同等电点的蛋白质或肽等良性物质可通过IEF-FFE达到分离。在分离时带有不同颜色的等电点标准品可以准确定位不同蛋白质药物电荷异构体的位置，但现有的等电点标准品在定位分离蛋白质药物电荷异构体的效果不佳，很难满足不同体系的要求。因此亟需一种新的用于自由流电泳的等电点标准品来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于自由流电泳的等电点标准品，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于自由流电泳的等电点标准品，包括：等电点物质，所述等电点物质设有8种，且每个等电点物质对应不同等电点，所述等电点物质均带有可肉眼直接观察的颜色，所述等电点物质的等电点在3.8-10.1之间，所述等电点物质由超纯水稀释的小分子物质组成，所述等电点物质分子量在200-600KDa之间，均为苯环、杂环类物质。
优选的，所述等电点物质分别为4,6-二氨基偶氮苯-2,2-二羧酸、3'，3”-双[N-(4-羧基哌嗪基)甲基]-邻甲酚磺酞、3'，5'，3”5”-四(N-[4-羧基哌嗪]甲基)-酚磺基邻苯二甲酸、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-5'，5”-二氯酚磺酞、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-邻甲酚磺酞、2,4-二-(4-吗啉甲基)-6-硝基苯酚、2,4-双[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-6-硝基苯酚、2-硝基-4,6-双(1-哌啶甲基)苯酚。
优选的，所述等电点物质等电点分别为3.0、4.0、4.7、5.3、6.4、7.5、8.5、10.1。
优选的，所述等电点物质在420nm处均有光吸收，可以通过仪器直接检测420nm处光吸收进行检测。
本发明的技术效果和优点：本等电点标准品满足pH3-10、pH7-10和pH5-8体系标准，在异构体分离制备过程中可以对pH进行定位，极大的提高了异构体的定位，缩短异构体制备时间。
附图说明
图1为实施例1中的420nm光吸收图；
图2为实施例1中的等电点标准品分布图；
图3为实施例2中的420nm光吸收图；
图4为实施例2中的等电点标准品分布图；
图5为实施例3中的420nm光吸收图；
图6为实施例3中的等电点标准品分布图。
具体实施方式
实施例1
一种用于自由流电泳的等电点标准品，包括：等电点物质，所述等电点物质设有8种，所述等电点物质由超纯水稀释的小分子物质组成，所述等电点物质分子量在200-600KDa之间，均为苯环、杂环类物质，所述等电点物质分别为4,6-二氨基偶氮苯-2,2-二羧酸、3'，3”-双[N-(4-羧基哌嗪基)甲基]-邻甲酚磺酞、3'，5'，3”5”-四(N-[4-羧基哌嗪]甲基)-酚磺基邻苯二甲酸、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-5'，5”-二氯酚磺酞、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-邻甲酚磺酞、2,4-二-(4-吗啉甲基)-6-硝基苯酚、2,4-双[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-6-硝基苯酚、2-硝基-4,6-双(1-哌啶甲基)苯酚，且每个等电点物质对应不同等电点，分别为3.0、4.0、4.7、5.3、6.4、7.5、8.5、10.1，所述等电点物质均带有可肉眼直接观察的颜色，所述等电点物质的等电点在3.8-10.1之间。
采用pH3-10分离体系，对上述的等电点标准品的作用进行验证，所述pH3-10分离体系具体体系参数如表一所示：
表一
验证结果如下所示：图1为420nm光吸收图(等电点标准品中的等电点物质在420nm处均有光吸收，可以通过仪器直接检测420nm处光吸收进行检测)，不同等电点的标准品均匀聚焦在不同的分流孔内；图2中可以看到不同颜色的标准品均匀分散在不同的分流孔中。当蛋白质异构体分离制备过程中，可以根据不同标准品的位置定位异构体进行富集和制备。
实施例2
一种用于自由流电泳的等电点标准品，包括：等电点物质，所述等电点物质设有8种，所述等电点物质由超纯水稀释的小分子物质组成，所述等电点物质分子量在200-600KDa之间，均为苯环、杂环类物质，所述等电点物质分别为4,6-二氨基偶氮苯-2,2-二羧酸、3'，3”-双[N-(4-羧基哌嗪基)甲基]-邻甲酚磺酞、3'，5'，3”5”-四(N-[4-羧基哌嗪]甲基)-酚磺基邻苯二甲酸、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-5'，5”-二氯酚磺酞、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-邻甲酚磺酞、2,4-二-(4-吗啉甲基)-6-硝基苯酚、2,4-双[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-6-硝基苯酚、2-硝基-4,6-双(1-哌啶甲基)苯酚，且每个等电点物质对应不同等电点，分别为3.0、4.0、4.7、5.3、6.4、7.5、8.5、10.1，所述等电点物质均带有可肉眼直接观察的颜色，所述等电点物质的等电点在3.8-10.1之间。
采用pH7-10分离体系，对上述的等电点标准品的作用进行验证，所述pH7-10分离体系具体体系参数如表二所示：
表二
验证结果如下所示：图3为420nm光吸收图(等电点标准品中的等电点物质在420nm处均有光吸收，可以通过仪器直接检测420nm处光吸收进行检测)，不同等电点的标准品均匀聚焦在不同的分流孔内；图4中可以看到不同颜色的标准品均匀分散在不同的分流孔中。当蛋白质异构体分离制备过程中，可以根据不同标准品的位置定位异构体进行富集和制备。
实施例3
一种用于自由流电泳的等电点标准品，包括：等电点物质，所述等电点物质设有8种，所述等电点物质由超纯水稀释的小分子物质组成，所述等电点物质分子量在200-600KDa之间，均为苯环、杂环类物质，所述等电点物质分别为4,6-二氨基偶氮苯-2,2-二羧酸、3'，3”-双[N-(4-羧基哌嗪基)甲基]-邻甲酚磺酞、3'，5'，3”5”-四(N-[4-羧基哌嗪]甲基)-酚磺基邻苯二甲酸、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-5'，5”-二氯酚磺酞、3'，3”-双(4-吗啉甲基)-邻甲酚磺酞、2,4-二-(4-吗啉甲基)-6-硝基苯酚、2,4-双[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-6-硝基苯酚、2-硝基-4,6-双(1-哌啶甲基)苯酚，且每个等电点物质对应不同等电点，分别为3.0、4.0、4.7、5.3、6.4、7.5、8.5、10.1，所述等电点物质均带有可肉眼直接观察的颜色，所述等电点物质的等电点在3.8-10.1之间。
采用pH5-8分离体系，对上述的等电点标准品的作用进行验证，所述pH5-8分离体系具体体系参数如表三所示：
表三
验证结果如下所示：图5为420nm光吸收图(等电点标准品中的等电点物质在420nm处均有光吸收，可以通过仪器直接检测420nm处光吸收进行检测)，不同等电点的标准品均匀聚焦在不同的分流孔内；图6中可以看到不同颜色的标准品均匀分散在不同的分流孔中。当蛋白质异构体分离制备过程中，可以根据不同标准品的位置定位异构体进行富集和制备。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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