具体实施方式

下列实施例用于进一步解释说明本发明，但是，它们并不构成对本发明范围的限制或限定。本发明所用的主要试剂与材料见表1，主要用的实验仪器见表2。

表1.主要试剂与材料

表2.主要实验仪器

实施例1

首先将DOX·HCL溶于DMSO，配置溶度为1mg/ml中，取DOX·HCL的DMSO溶液，加入2倍摩尔质量(DOX·HCL)的二乙胺混合脱盐2h，加入浓度为20mg/mL COS的DMSO溶液，充分搅拌5min后，在搅拌下缓慢滴入0.5mL 10w/w％的DF-PEG-DF水溶液在室温下反应12h；反应液装入透析袋(MWCO：3.5～5kDa)在去离子水中透析24h，以去除未反应的DOX及小分子，得透析保留液；在透析保留液中搅拌下缓慢滴加TPP溶液(2mg/L)，剧烈搅拌10min，反应液冷冻干燥后获得COS-DOX。图1为COS-DOX制备方案及示意图，按照表3中比例，获得COS-DOX1～COS-DOX8，用于后续实验研究。

表3

研究通过改变醛、氨基与三聚磷酸钠(TPP)的比例，优化了纳米粒子的粒径、药物包封率、装载率和Zeta电位，并采用透射电子显微镜(TEM)、傅立叶红外分光光度法(FT-IR)和热重分析(TGA)对材料进行了表征。结果表明通过改变阿霉素偶联壳寡糖纳米粒子各成分的比例，可以调控纳米粒子的粒径，进而会影响药物包封效率和传递效果。实验得到最小粒径为168.6±4.3nm的COS-DOX2纳米粒子，最高电位为35.1±1.9mV的COS-DOX1纳米粒子粒径为219.2±1.5nm，COS-DOX1的药物包封率和装载率为5.55±0.13％和88.81±2.00％。实验还研究了纳米粒子的体外释放性能和pH响应性。将COS-DOX与人结肠癌细胞(HCT-116)共培养，结果发现基于COS的载药纳米粒子增加了肿瘤细胞对药物的摄取，在一定浓度内显著增强了DOX对HCT-116细胞的细胞毒性。

实施例2

COS-DOX1～COS-DOX8在PBS中的尺寸和Zeta电位使用Zeta sizer Nano-ZS90仪测定。使用FEI Tecnai G2 F20透射电镜观察纳米颗粒的形态。将2μL的COS-DOX溶液滴涂在超薄碳涂层铜网上自然晾干后进行观察。

为了探究阿霉素偶联壳寡糖纳米粒子各成分的最佳比例，对制备的COS-DOX1～COS-DOX8进行了粒径和Zeta电位分析。所有纳米粒子的尺寸在100～250nm之间，表明它们均可以通过血管间隙向肿瘤部位渗透。从图2和表4可以看出，COS-DOX1、COS-DOX2、COS-DOX5和COS-DOX6的粒径小于COS-DOX3、COS-DOX4、COS-DOX7和COS-DOX8，这主要是由于更多的TPP添加后，更多的阴离子引入，导致更多的COS进行了交联，粒径增大。通过对比COS-DOX1与COS-DOX2，COS-DOX3与COS-DOX4，COS-DOX5与COS-DOX6，COS-DOX7与COS-DOX8的粒径，可以看出COS量的增加会引起粒径的增加，这主要是由于离子交联的静电相互作用主要发生在COS和TPP之间，而COS-DOX1的粒径小于COS-DOX5，COS-DOX2的粒径小于COS-DOX6，COS-DOX3的粒径小于COS-DOX7，COS-DOX4的粒径小于COS-DOX8是因为增加DOX的添加使更多的DOX接枝在了COS上。由实验结果可以得出，通过改变阿霉素偶联壳寡糖纳米粒子各成分的比例，可以调整最终纳米粒子的大小，这会影响药物包封效率和传递效果。

COS-DOX1～4的Zeta电位均大于20mV，COS-DOX1和COS-DOX2的表面Zeta电位达到了35.1±1.9mV和30.5±0.4mV，增加TPP的加入量后，COS-DOX3和COS-DOX4的电位下降至25.7±2.5mV和27.3±3.7mV，主要是由于TPP作为阴离子离子交联剂的引入，使更多的COS发生交联，降低了表面电位，这种趋势在COS-DOX5～8中也可以观察到，Zeta电位由COS-DOX5和COS-DOX6的29.6±2.8mV和26.3±3.2mV降低至COS-DOX7和COS-DOX8的20.8±1.6mV和24.6±4.3mV。故本后续实验选择TPP用量为4mL。

表4.COS-DOX1～8纳米粒子的粒径分布及Zeta电位

实施例3

以表3中COS-DOX1的COS与TPP比例制备未偶联DOX的单纯COS纳米粒子(COS/TPP)，以COS-DOX1中COS与DOX的比例制备未交联的COS/DOX聚合物，以COS-DOX1中COS、DOX、TPP的比例制备COS-DOX/TPP纳米粒子，分别置于透射电镜下观察产物形态的变化。如图3(a)所示，由于离子交联作用，在TPP存在下，COS的分子链发生聚集，形成了COS/TPP纳米粒子。COS与DOX偶联之后形成了含pH敏感苯亚胺键的雪花状的多枝聚合物(图3(b))，加入交联剂TPP后聚合物聚集形成大小均匀的COS-DOX/TPP纳米粒子(图3(c))。通过TEM图可以看出COS-DOX纳米粒子的成功制备纳米颗粒的尺寸和Zeta电位。

实施例4

通过计算药物包封率及装载率考察COS与DOX的最佳比例，结果如图4。COS-DOX1和COS-DOX4对DOX的LC分别为5.55±0.13％和5.26±0.04％，低于COS-DOX2和COS-DOX3的9.61±0.18％和8.55±0.34％，但COS-DOX1和COS-DOX4对DOX的EE为88.81±2.00％和84.08±0.63％，高于COS-DOX2和COS-DOX3的76.85±1.43％和68.41±2.72％。增加DOX的添加量，COS-DOX5和COS-DOX8对DOX的LC增加到7.62±0.22％和8.07±0.09％，但EE降低到64.80±1.90％和68.63±0.72％，而COS比例低的COS-DOX6和COS-DOX7对DOX的LC虽有10.60±0.56％和10.68±0.40％，但EE只有47.71±2.50％和48.07±1.81％，这可能是COS比例降低导致了接枝位点的减少。实验结果可以看出，COS-DOX成功偶联了DOX，且不同的COS、DOX、TPP比例会影响药物包封率及装载率。

实施例5

采用FT-IR对样品进行了测试，将样品与KBr颗粒混合并充分研磨，压片后从400到4000cm^-1扫描，记录峰的强度。

对COS、COS-DOX1～4进行红外光谱分析，结果如图5所示。约3430cm^-1的宽峰为O-H和N-H的伸缩振动，约900cm^-1处的双峰对应-CH-和-CH₂-基团的存在。COS的红外曲线中1634cm^-1和1528cm^-1的峰是由于氨基中N-H弯曲振动。COS-DOX1和COS-DOX4的峰强度明显高于COS-DOX2和COS-DOX3是因为COS比例的增加使DOX有了更多的接枝位点，导致更多官能团的引入。COS-DOX1～4的红外光谱中都出现了位于1645cm^-1的新峰，这也是苯亚胺键(-C＝N-)的特征吸收峰，说明成功制备了DF-PEG-DF接枝的COS-DOX，且在纳米粒子中引入了pH响应性。

实施例6

在TGA 2热重仪上对原壳寡糖和载药后壳寡糖进行了热重分析。在N₂气氛下，以10℃/min的升温速率加热样品，温度范围为35～600℃。

实验采用重分析法考察了COS和COS-DOX1～4的热稳定性，结果如图6所示。从COS失重曲线可以看出，100℃以下失重6.66％，这一阶段主要是物理吸附的水分和与羟基和氨基结合的部分氢键水的损失，升温至165℃时出现第二阶段失重，在165～300℃共失重38.75％，这一阶段失重是由于样品中糖环降解和大分子链解体的复杂过程，这一阶段的失重在COS-DOX1和COS-DOX4的热重曲线中也可以观察到，而COS-DOX2和COS-DOX3则在此温度保持稳定，因为COS比例的增加导致部分COS进行自交联或未接枝上DOX，引起了比COS-DOX2和COS-DOX3多一阶段的COS降解失重。COS-DOX的最大失重温度相比COS明显提高，可能是由于交联剂使聚合物链结合在一起，形成氢键，限制了它们的节段运动，因此降解需要更多的热能。COS-DOX1～4在355～440℃分别失重46.61％、55.21％、45.39％、39.24％，这一段重量的损失主要是碳的氧化和含氧基团的去除。这说明偶联降低了COS在高温下的失重，表明制备的COS-DOX具有良好的热稳定性。由于DOX的成功接枝，改变了COS的分子结构，分子质量、交联密度和分子链间相互作用的增加大大提高了聚合物的热稳定性。

实施例7

利用Bruker AvanceⅢ600M交叉极化魔角旋转对COS和COS～DOX进行固体核磁检测。

固体¹³C NMR是测定化合物结构最有效和准确的手段之一。图7为COS和COS-DOX1的固体¹³C NMR谱图。COS的特征碳信号出现在55～75ppm(C1:72.0ppm，C2、C6:62.5～56.5ppm，C3～C5:70.7ppm)。DOX偶联COS后产物的固态13C NMR谱在174.8ppm(C7：-C＝N)、98.7～89.1ppm(C8～C14：芳香环)和24.6ppm(C15、C25：-CH₃)出现了新的峰，且62.5～56.5ppm处的吸收峰强度明显增加，说明了化合物中引入了新的结构导致烷基基团的增加。这些变化都是由于DOX的成功接枝，固相¹³C NMR谱证实了本实验方法可以成功将DOX接枝到COS上，制备得到含有苯亚胺键的COS-DOX载药粒子。

实施例8

COS-DOX1～4分别分散于pH 7.4的PBS缓冲液和pH 5.2的ABS缓冲液中，浓度为0.5mg/mL，放入透析袋(MWCO：3.5～5kDa)中。透析袋置于100mL相同的缓冲介质中，37℃下震荡释药(80rpm)。每隔一段时间，提取2毫升透析渗出液进行紫外可见分光光度测量确定DOX浓度，同时补充等量缓冲液，计算药物释放率。

揭示DOX的体外释放行为对于理解药物与载体间的相互作用具有重要意义。采用透析法对COS-DOX1～4的体外释放效果进行了研究。分别用PBS(pH 7.40)和ABS(pH 5.0)模拟肿瘤细胞的生理循环系统和溶酶体环境。如图8所示，COS-DOX1～4的DOX释放都具有较强的pH依赖性，且随着pH值的降低释放DOX的速度加快。pH为7.4时，COS-DOX1的总释放率为28.05±1.69％，在18h后达到平台期，释放率约为16.17±3.54％；COS-DOX2的总释放率为19.90±1.89％，在12h后达到平台期，释放率约为15.99±2.55％；COS-DOX3的总释放率为17.88±1.54％，在18h后达到平台期，释放率约为15.16±1.55％；COS-DOX4的总释放率为23.10±1.58％，在24h后达到平台期，释放率约为20.00±2.14％。当pH为5.0时，COS-DOX1～4中的DOX持续释放，COS-DOX1～4累积释放分别为93.83±2.84％，94.37±1.61％，88.40±2.01％，91.97±3.48％，并都在约8小时后达到平台期。实验结果可以看出，COS-DOX的释药过程具有一定的pH响应性，这主要依赖于制剂中的苯亚胺键，而COS-DOX3和COS-DOX4由于过多的TPP加入，造成聚合物链更多的交联而聚集卷缩，不利于药物的释放，因此释放率低于COS-DOX1和COS-DOX2。

实施例9

采用MTT法评测定了COS-DOX1对HCT-116人结肠癌细胞的细胞毒性。

1)细胞复苏：将冻存的HCT-116细胞取出后置于37℃水浴锅中迅速解冻，细胞液经过1000rpm离心后取细胞沉淀，用新鲜Mccoy’s 5A培养基(含10％胎牛血清)置于培养瓶培养。

2)细胞培养和传代：倒置显微镜下观察细胞培养瓶中细胞密度达到90％时，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入2mL EDTA-胰酶消化2min，加入等量培养基终止消化，吹打均匀形成细胞悬液。

3)细胞计数：将细胞悬液进行稀释后取2μL滴在细胞计数板上进行记数。

4)接种：取对数生长期HCT-116细胞，将细胞接种于96孔板上，密度为6×10⁴个细胞/孔，每孔含180μL培养基，37℃，5％CO₂气氛孵育24h。

5)加样：加入20μL/孔的含有浓度0～100mg/L(以DOX浓度计)的COS、COS-DOX1和DOX培养24h。

6)存活率测试：各孔均加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h。弃去孔中的溶液后，每孔加入150μL的DMSO，混匀，用酶标仪在490nm处测定吸光值。以样品孔与未加样品处理的对照孔的吸光度的百分比计算细胞活力。

采用MTT法测定COS、游离DOX和COS-DOX1对HCT-116细胞的体外细胞毒性。如图9所示，浓度5～40μg/mL的COS对细胞的抑制作用不明显，在浓度40μg/mL时，COS共培养的HCT-116的细胞存活率仍在80％以上，说明COS具有相对较低的细胞毒性。而游离DOX和COS-DOX1均表现出剂量依赖性的细胞毒性。随着剂量从5μg/mL增加至40μg/mL，与游离DOX共培养的HCT-116细胞存活率从47.05±2.33％降低至8.13±0.81％，和COS-DOX1共培养的HCT-116细胞存活率从39.51±1.71％降低至8.30±0.71％。可以看出，在相同的小剂量下，COS-DOX1展现出了比DOX更高的细胞毒性，这说明基于COS的纳米载体在一定浓度内显著增强了DOX对HCT-116细胞的细胞毒性，增加了肿瘤对药物的摄取，提高了细胞内药物传递效率。

实施例10

1)接种：取对数生长期HCT-116细胞，将细胞接种于6孔板上，密度为0.5×10⁶个细胞/孔，每孔含1mL培养基，37℃，5％CO₂气氛孵育24h。

2)加样：在细胞孔中加入1mL PBS、DOX、和COS-DOX1，每组当量DOX浓度为10μg/mL，置于37℃的CO₂培养箱中分别孵育2、4和8h。

3)染色：弃去培养液，每个孔用PBS清洗3次，避光下加入1mL/孔Hoechst 33258(10μg/mL)，置于培养箱中染核25min，结束染色后弃去染色剂，用PBS清洗3次，在荧光倒置显微镜下观察。

用游离DOX和COS-DOX1与HCT-116细胞共培养2、4和12h，研究了药物在HCT-116细胞中的细胞摄取和细胞内释放行为。Hoechst 33258的蓝色荧光用于标记细胞核，DOX的红色荧光用于跟踪药物，两种荧光混合用于研究药物分布。

结果表明，在前2h内，只有少量的纳米颗粒能被细胞吸收，且极少量进入细胞核发挥作用。随后可以明显看出，在4h后，无论是细胞质还是细胞核中，COS-DOX1都有更强的红色荧光，这说明随着时间的延长，细胞中吞噬了更多的药物，且COS-DOX1中的DOX可以更好的进入细胞，粒子更容易被细胞吸收并释放DOX。将游离DOX和COS-DOX1与HCT-116细胞共孵育12h后，两者的红色荧光都有了更加明显的增强，且大部分药物进入了细胞核，但COS-DOX1依然展现出了比游离DOX更好的细胞摄取效果，可以更好的发挥抑制癌细胞的效果。因此，COS-DOX1作为一种新型载体，拥有较小的粒径，良好的药物释放性能，且可以加强肿瘤细胞摄取量，可以用于靶向输送药物。