一种递送姜黄素的zein-AOS复合纳米颗粒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种递送姜黄素的zein-AOS复合纳米颗粒及其制备方法 (zein-AOS composite nano-particles for delivering curcumin and preparation method thereof ) 是由 马瑞 欧阳小琨 王松艳 黄依如 于 2021-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于递送姜黄素的zein-AOS复合纳米颗粒及其制备方法。本发明制备的zein-AOS复合纳米颗粒在适宜的pH及温度条件下,相对稳定,姜黄素的包封率达89.7％,该纳米颗粒在模拟胃液(SGF,pH 2.0)中能够减少姜黄素的释放(<33％),在模拟肠液(SIF,pH 7.4)中充分释放姜黄素,释放率达83.8％。(The invention provides zein-AOS composite nanoparticles for delivering curcumin and a preparation method thereof. Under the conditions of proper pH and temperature, the zein-AOS composite nano-particle prepared by the invention is relatively stable, the encapsulation rate of curcumin reaches 89.7%, the nano-particle can reduce the release (< 33%) of curcumin in simulated gastric juice (SGF, pH 2.0), and can fully release curcumin in simulated intestinal juice (SIF, pH 7.4), and the release rate reaches 83.8%.)
技术领域
本发明涉及姜黄素的递送纳米颗粒，具体涉及一种递送姜黄素的zein-AOS 复合纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
姜黄素(Cur)，存在于香料姜黄中，具有抗氧化、抗炎、抗溃疡、抗菌、抗病毒等活性。此外，姜黄素还具有良好的抗癌作用，对正常细胞没有毒性。然而，由于其物理化学稳定性差和口服生物利用度低，其应用受到了限制。
在过去的几十年，为了克服稳定性差及口服生物利用度低的问题，已经研究了许多种方法，这些方法包括制备脂质体结构或磷脂结构等等，例如， WO2007101551制备了一种磷脂和姜黄素的复合物，然而，所得产品是粘性蜡，这使得产品基本上不能包封，许多研究小组正在探索不同的途径是将姜黄素与辅剂组合，例如胡椒碱、槲皮素等。
现有技术尽管有一定的进步，但仍然非常需要改善姜黄素的包封率、生物利用度及稳定性。
发明内容
本研究团队通过多年的努力，利用傅里叶红外光谱仪、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、差示扫描量热仪对各种复合纳米颗粒进行了表征，考察了不同复合纳米颗粒在不同离子强度、pH值、温度条件下的稳定性，并对纳米颗粒的包封和释放性能进行了研究，意外发现一种稳定的、包封率高，适宜递送姜黄素的 zein-AOS复合纳米颗粒。
本发明的目的之一在于提供一种递送姜黄素的zein-AOS复合纳米颗粒，所述zein-AOS复合纳米颗粒由玉米醇溶蛋白(zein)，褐藻寡糖(AOS)组成，所述玉米醇溶蛋白与褐藻寡糖的重量比为2:1。
本发明另一目的在于提供一种递送姜黄素的zein-AOS复合纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
1)玉米醇溶蛋白原液的制备
将0.4g玉米醇溶蛋白溶于20mL 75％乙醇水溶液中，后将10mL玉米醇溶蛋白溶液缓慢滴入30mL去离子水中。用旋转蒸发器在40℃去除样品中的乙醇。最后用去离子水补充至40mL，储存在4℃冰箱中备用。
2)0.2％褐藻寡糖原液的配制
将一定量的褐藻寡糖溶解到去离子水中，得到0.2％的褐藻寡糖原液。
3)zein-AOS(2：1)纳米颗粒的制备
用去离子水将2.5mL褐藻寡糖原液稀释至18mL,后将2mL玉米醇溶蛋白原液缓慢滴入18mL褐藻寡糖水溶液中，磁力搅拌1h。后将zein-AOS复合纳米体系的pH值调整到4。3000rpm离心10分钟，保存上清液，最后将样品保存在4℃下备用。
另一方面，本发明提供了zein-AOS复合纳米颗粒在递送姜黄素中的应用。所述zein-AOS复合纳米颗粒在递送姜黄素中的应用，包括将姜黄素装载到 zein-AOS复合纳米颗粒中，形成Cur/zein-AOS复合纳米颗粒。
作为优选，所述Cur/zein-AOS复合纳米颗粒中Cur:zein:AOS的重量比为 1:100:50-4:100:50
本发明zein-AOS复合纳米颗粒可进一步作为脂溶性活性物质的载体。
本发明通过静电作用、氢键作用和疏水作用成功地制备了zein-AOS复合纳米颗粒。同时本发明研究了zein和AOS的比例对复合物纳米颗粒的粒径、电位和PDI均有影响，当zein和AOS的重量比为2:1时，制备得到的zein-AOS复合纳米颗粒均匀稳定，该复合纳米颗粒对离子强度(0-12.5)mmol/L、温度 (30℃-90℃)、pH(4-9)等均具有良好的稳定性。
本发明的Cur/zein-AOS具有胃肠道缓释的性能，本发明制备得到的 zein-AOS纳米颗粒可作脂溶性活性物质的理想载体。
附图说明
图1为不同zein和AOS比例的zein-AOS纳米颗粒的粒径和PDI(a)和zeta (b)电位。
图2为不同纳米颗粒的红外光谱，其中a为AOS纳米颗粒,b为zein纳米颗粒,c为zein-AOS纳米颗粒,d为Cur纳米颗粒,e为Cur/zein-AOS(e) 纳米颗粒。
图3为纳米颗粒的SEM及TEM图像，其中a为zein纳米颗粒的SEM图像， b为zein-AOS(2：1)复合纳米颗粒(b)的SEM图像,c为zein纳米颗粒的TEM 图像，d为zein-AOS复合纳米颗粒的TEM图像。
图4为纳米颗粒的DSC图谱。
图5为不同离子强度(a,b)、不同pH条件(c,d)、不同温度(e,f)下zein-AOS 纳米颗粒的粒径、PDI，电位。
图6为装载不同Cur时Cur/zei-AOS纳米颗粒的包封效率.
图7为Cur,Cur/zein,Cur/zein-AOS模拟胃肠道中Cur的释放速率。
具体实施方式
本发明使用的玉米醇溶蛋白(zein)购置于美国密苏里州Sigma试剂公司，褐藻寡糖AOS购置于山东结晶集团股份有限公司。
本发明采用马尔文电位仪测试纳米颗粒的粒径、多分散性(PDI)和zeta电位。测定前，用pH值为4的去离子水将样品稀释至适当浓度(计数率100-200kcps)，以备分析。
本发明采用傅里叶变换分光光度计在波长为400-4000cm-1，分辨率为4cm-1对Cur、Cur/zein、zein-AOS、Cur/zein-AOS的进行表征。
本发明采用差示扫描量热仪(DSC)对Cur、Cur/zein、zein-AOS、 Cur/zein-AOS的热变特性进行分析。约取5mg冻干样品置于密封的标准铝锅中进行测试。氮气流速设定为10℃/min，温度以5℃/min的速率从30℃升高到 120℃，同时以一个空锅作为对照。
本发明在200kV加速电压下，用透射电镜(TEM)对zein-AOS样品进行表征。在5.0kV加速电压下，用扫描电镜(SEM)表征zein-AOS的表面形貌。表征前将 zein-AOS液体样品滴在硅片上，样品在空气中干燥后，涂上金观察。
本发明为了评估Cur/zein-AOS纳米颗粒在胃肠道中的释放情况，我们用3.2 mg/mL的胃蛋白酶水溶液在pH值为2.0的条件下制备模拟胃液(SGF)。模拟肠液(SIF)的成分为6.8mg/mL K2HPO4、0.8mg/mL胰酶、20mg/mL胆汁提取物、 8.775mg/mL NaCl,pH值调至7.4。将30mL新鲜制备的Cur/zein-AOS分散液与30mL SGF混合，在37℃下以100rpm振荡90分钟。每隔一定时间(30min、 60min、90min)采集2mL样品，并补充2mL新鲜SGF。90min后，将全部SGF消化液倒入60mL SIF中。在120,150,180,210和240分钟收集2mL样品。再补充2mL新鲜SIF溶液。收集的溶液在10000×g下离心5min，去除不溶物。用UV-2600分光光度计在426nm处测量上清中的姜黄素。
本发明纳米颗粒中的姜黄素的包封率测试方法如下：将冷冻干燥的 Cur/zein-AOS纳米颗粒在80％乙醇水溶液(10mL)中超声辅助溶解。4000rpm离心10min后收集上清液。将沉淀再用80％乙醇水溶液洗3次，离心后收集上清液。以上清液中姜黄素含量与总姜黄素量的比值确定EE。用UV-2600分光光度计在426nm处测定上清中的姜黄素的含量。
5mg/mL玉米醇溶蛋白原液的制备
将0.4g玉米醇溶蛋白溶于20mL 75％乙醇水溶液中，后将10mL玉米醇溶蛋白溶液缓慢滴入30mL去离子水中。用旋转蒸发器在40℃去除样品中的乙醇。最后用去离子水补充至40mL，储存在4℃冰箱中备用。
2mg/mL褐藻寡糖原液的配制
将2g褐藻寡糖溶解到1L去离子水中，得到2mg/mL的褐藻寡糖原液。
不同姜黄素原液的配制
用无水乙醇溶解姜黄素，分别制备成1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL 原液。
Cur/zein原液的制备
将1mL姜黄素原液(1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL)分别缓慢滴入5mL玉米醇溶蛋白原液中，磁力搅拌(500rpm)2h。后将混合物溶液分别滴加到15mL去离子水中，避光环境下磁力搅拌(500rpm)2h。旋转蒸发除去乙醇。最后将样品用去离子水补充至20mL，储存在4℃冰箱中备用。
制备例1 zein纳米颗粒制备
将0.4g玉米醇溶蛋白溶于20mL 75％乙醇水溶液中，后将10mL玉米醇溶蛋白溶液缓慢滴入30mL去离子水中。用旋转蒸发器在40℃去除样品中的乙醇。最后用去离子水补充至40mL，储存在4℃冰箱中备用。
制备例2不同配比的zein-AOS纳米颗粒制备
用去离子水将一定量的褐藻寡糖原液稀释至18mL,后将2mL玉米醇溶蛋白原液缓慢滴入18mL褐藻寡糖水溶液中,使玉米醇溶蛋白与褐藻寡糖的用量比例分别为1:1,1:2,2:1,4:1,5:1,10:1和20:1，磁力搅拌1h。后将zein-AOS 复合纳米颗粒的pH值调整到4。3000rpm离心10分钟，保存上清液，最后将样品保存在4℃下备用。
制备例3不同配比Cur/zein-AOS纳米颗粒制备
将添加不同浓度的姜黄素原液(1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL)所制备的Cur/zein原液(2mL)分别缓慢加入到18mL的褐藻寡糖水溶液中(含2.5 mL褐藻寡糖原液)，磁力搅拌1h，然后分别将Cur/zein-AOS复合物纳米颗粒的 pH值调整到4。最后将样品保存在4℃下进一步研究。
实施例1不同配比的zein-AOS纳米颗粒的粒径、zeta电位和PDI测定
测定制备例4中不同配比的zein-AOS纳米颗粒的粒径、zeta电位和PDI测定，其结果如图1所示玉米醇溶蛋白(90nm)的粒径小于zein-AOS。由于带负电荷的褐藻寡糖不足以稳定玉米醇溶蛋白纳米颗粒，在zein-AOS重量比为20:1 时，可以观察沉淀析出，出现絮凝现象。随着褐藻寡糖量的增加(玉米蛋白与褐藻寡糖的比例从10:1增加到2:1)，玉米醇溶蛋白的粒径从128.7nm减小到116.5 nm。这种变化可能是由于zein与AOS之间的静电作用的改变所致。当zein与 AOS的比例从2:1增加到1:2时，zein-AOS的粒径从116.5nm增加到209.9nm。可能因为玉米醇溶蛋白纳米颗粒被多层褐藻寡糖覆盖。随着褐藻寡糖量的增加，zein-AOS纳米颗粒的电荷降低(玉米醇溶蛋白与褐藻寡糖的比例由10:1降低到 1:2，电荷由-23.2mV降低到-32mV)。表明zein-AOS复合纳米颗粒的电荷主要由带负电荷的褐藻寡糖控制。在zein-AOS重量比为2:1时，带负电荷的褐藻寡糖能有效地将纳米颗粒稳定，纳米颗粒粒径小且均匀(粒径116.5nm,PDI 0.16)。因此，我们选择2:1的比例进一步研究。
实施例2不同纳米颗粒FTIR研究
用红外光谱表征上述制备例中的zein、AOS、Cur、zein-AOS(2:1)、 Cur/zein-AOS(2:100:50)纳米颗粒，结果如图2所示，在3100-3500cm-1的波段内是O-H伸缩振动，zein-AOS和zein/Cur-AOS的O-H伸缩振动与zein、AOS 和Cur不同，可能由于zein、Cur和AOS之间形成了氢键。在图2b的光谱中， zein的特征峰为1655cm-1和1538cm-1，分别代表酰胺I(C＝O拉伸振动)和酰胺 II(N＝H弯曲振动)。添加Cur和AOS后，zein-AOS和Cur/zein-AOS光谱中的酰胺I分别移动到1646cm-1和1651cm-1,酰胺II分别移动到1530cm-1和1535cm-1，表明zein、AOS和Cur之间存在静电相互作用。AOS中1035cm-1处的特征峰,在 zein-AOS中移至1030cm-1，zein/Cur-AOS复合颗粒中移至1038cm-1处。如图 2d的光谱中，1423cm-1、1277cm-1、1162cm-1处的峰分别代表芳香环的伸缩振动、“酮”的一部分和环间链的伸缩振动。然而，这些特征峰在zein/Cur-AOS 的光谱中消失了，这表明在玉米醇溶蛋白、姜黄素和褐藻寡糖之间存在氢键和疏水作用，纳米颗粒有效地包裹了姜黄素。
实施例3不同纳米颗粒的SEM和TEM研究
用扫描电镜和透射电镜表征了制备例中的zein和zein-AOS(2：1)的形态。如图3所示：zein纳米粒是球形结构，但表面不光滑，颗粒之间有轻微的附着。这种现象是由于含硫氨基酸分子间二硫键使玉米醇溶蛋白具有一定的成膜性，所以随着溶剂的蒸发，微球之间有一定的粘附性。当玉米醇溶蛋白与褐藻寡糖结合时，纳米颗粒形貌为球形，纳米颗粒之间不粘附。zein-AOS纳米颗粒比zein更光滑、粒径更大。这是由于褐藻寡糖通过静电作用和氢键覆盖在玉米醇溶蛋白上。 TEM也显示了zein-AOS纳米颗粒比zein粒径更大。
实施例4不同纳米颗粒的DSC研究
采用差示扫描量热法(DSC)测定了制备例中的zein、Cur、Cur/zein(2:1)、 Cur/zein-AOS(2:100:50)的热变性。如图4所示，zein的分解温度为79.8℃。 Cur/zein纳米颗粒的分解温度(88.2℃)高于玉米醇溶蛋白。这可能是因为 Cur/zein纳米颗粒形成了一种新的包封结构。当Cur/zein与AOS结合时，检测到较高的分解温度(91.2℃)，表明褐藻寡糖与玉米醇溶蛋白分子间相互作用提高了分解温度。Cur/zein和Cur/zein-AOS纳米颗粒中姜黄素的特征分解峰 (179.2℃)消失，表明姜黄素以非晶体的形式很好地分散在纳米颗粒中。
实施例5不同环境条件下的稳定性研究不同盐离子强度的稳定性研究
在pH值为4的条件下，制备了不同浓度的NaCl(0,5,10,12.5,15,20 mM)。后将zein-AOS分散液与等体积不同浓度的NaCl溶液混合，得到一系列的样品。样品的粒径和电位由马尔文电位仪测定。
载药纳米颗粒要在人类胃肠道中面临各种环境挑战。因此，研究复合纳米颗粒在不同离子强度下的物理稳定性至关重要。如图5a,b所示，当NaCl浓度为 0mmol/L时，zein-AOS(2：1)复合物粒径为116.5nm。当离子浓度增加到10 mmol/L时，复合物纳米颗粒的粒径为278nm,PDI为0.21，此时复合物纳米颗粒相对稳定。但随着离子强度的增加，复合物纳米颗粒的粒径和PDI增大，在 12.5-20mmol/L范围内发生聚集和沉淀，复合纳米颗粒的电荷量减小。这可能是因为随着离子强度的增加，静电屏蔽效应降低了玉米醇溶蛋白的表面电荷，从而减弱了玉米醇溶蛋白与褐藻寡糖之间的相互作用。
溶液pH的影响
用1M HCl或NaOH调节zein-AOS分散液的pH值(pH 2至pH 8)。然后使用马尔文电位仪获得粒径和zeta电位。
复合纳米颗粒作为姜黄素的载体将会在胃肠道中面临pH值变化。因此，对复合纳米颗粒的pH稳定性进行研究至关重要。如图5c,d所示：在pH值为3 时,zein-AOS纳米颗粒是不稳定的(粒径为1424.3nm,PDI为0.47)，出现了聚集现象，可能是由于纳米颗粒表面电荷的少，绝对电位低，纳米颗粒之间的静电斥力的减少，纳米颗粒出现聚集现象。随着pH值的增加(pH 4-pH 9)，zein-AOS 颗粒的绝对电位增加，粒径小于135nm,PDI小于0.23。pH值为4-9时，纳米颗粒之间的静电作用力能使纳米体系保持稳定。因此，zein-AOS复合物纳米颗粒可以作为的理想载体。
温度的影响
将zein-AOS分散液在30-90℃加热30min，冷却至室温后测样品的粒径和电位。
温度对zein-AOS复合物纳米颗粒的影响如图5e,f所示：在30-90℃加热30 min后，复合物纳米颗粒的粒径(129.9nm-136.5nm)、PDI(0.16-0.19)和电荷 (-29.5mV--30.5mV)变化不大，表明复合物纳米颗粒具有良好的温度稳定性。这一结果可以解释为玉米醇溶蛋白的热变性在100℃左右。
实施例6装载不同Cur的包封率(EE％)对比研究
zein-AOS(2；1)复合物纳米颗粒的包封率如图6所示：在本研究中，将不同量的姜黄素(1mg,2mg,3mg,4mg)装载到zein-AOS复合物纳米颗粒中。随着姜黄素的增加，Cur/zein-AOS的EE逐渐降低。其中，当姜黄素从1mg增加到4mg时，包封率从92.11％降低到59.6％，表明过量的姜黄素，超过了zein-AOS 复合物纳米颗粒的负载能力。因此，在进一步的研究中，将2mg的姜黄素包裹在zein-AOS纳米颗粒中，此时姜黄素、玉米醇溶蛋白、褐藻寡糖三者的比例为 2:100:50。
实施例7模拟胃肠道环境消化对比实验
将上述制备例中的Cur、Cur/zein(2:25)、Cur/zein-AOS(2:100:50)纳米颗粒用于模拟胃肠道中的释放率，结果如图7所示，在模拟胃液(SGF)中， Cur、Cur/zein、Cur/zein-AOS中姜黄素释放率分别为60.5％，39.9％，32.9％。游离姜黄素的释放率明显高于Cur/zein、Cur/zein-AOS，表明玉米醇溶蛋白对姜黄素有控制释放的作用。
在模拟肠液(SIF)中，Cur/zein和Cur/zein-AOS均表现出突释效应，这可能是由于SIF中的胆盐和多肽有助于溶解姜黄素，此外，覆盖在玉米醇溶蛋白表面的AOS也被溶解。Cur/zein释放率比Cur/zein-AOS高。这可能是因为褐藻寡糖层可以对玉米醇溶蛋白起到一定的保护作用，可以阻止玉米醇溶蛋白被快速酶解。Cur/zein-AOS在胃中对姜黄素有控制释放的作用，在肠液中可以大量释放姜黄素，因此，zein-AOS纳米颗粒可作为脂溶性药物的理想载体。
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