一种纳米颗粒及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种纳米颗粒及其制备方法和应用 (Nano-particles and preparation method and application thereof ) 是由 胡涛 张月 雷蕾 田雨婷 胥一尘 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纳米颗粒及其制备方法和应用,涉及龋病防治领域。本发明提供了一种抗龋的新的纳米材料,其包括携带变异链球菌vicR基因反义RNA的重组质粒和包覆载体,该重组质粒可以调控变异链球菌vicR基因的表达,可以降低vicR基因的表达水平,减少变异链球菌胞外多糖的合成,降低其生物膜的黏附聚集能力,通过转录后微调控的方式达到抗龋作用。重组质粒与包覆载体通过静电吸附结合。包覆载体由价格低廉且生物相容性好的精胺改性的淀粉材料制得。由于重组质粒带负电荷,而淀粉表面电荷为负,发明人通过精胺对淀粉材料进行表面改性,以使得淀粉的表面均带有正电荷,从而满足了重组质粒与精胺改性后的淀粉材料的静电结合。(The invention discloses a nano particle and a preparation method and application thereof, and relates to the field of caries prevention and treatment. The invention provides a novel anti-caries nano material, which comprises a recombinant plasmid and a coating vector, wherein the recombinant plasmid carries streptococcus mutans vicR gene antisense RNA, can regulate and control the expression of streptococcus mutans vicR gene, can reduce the expression level of the vicR gene, reduces the synthesis of streptococcus mutans extracellular polysaccharide, reduces the adhesion and aggregation capability of a biological membrane, and achieves the anti-caries effect in a post-transcriptional micro-regulation mode. The recombinant plasmid and the coated carrier are combined through electrostatic adsorption. The coating carrier is prepared from spermine modified starch material with low price and good biocompatibility. Because the recombinant plasmid is negatively charged and the surface charge of the starch is negative, the inventor modifies the surface of the starch material through spermine to ensure that the surface of the starch is positively charged, thereby satisfying the electrostatic combination of the recombinant plasmid and the starch material modified by the spermine.)
技术领域
本发明涉及龋病防治领域，具体而言，涉及一种纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
龋病俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。若不及时治疗，病变可能形成龋洞。龋病的特点是发病率高，分布广，是口腔常见病。龋病的发生与牙菌斑生物膜的形成密切相关。
目前公认的龋病病因学说是四联因素学说，主要包括细菌、口腔环境、宿主和时间。其基本点为：致龋性食物糖仅仅贴附于牙面，由唾液蛋白形成的获得性膜。这种获得性膜不仅得以牢固的附着于牙面，而且可以在适宜温度下，有足够的时间在菌斑深层产酸，侵袭牙齿，使之脱矿，并进而破坏有机质，产生龋洞。
变异链球菌是与龋病发生发展关系密切的主要致龋菌。它通过代谢口腔内的碳水化合物产酸、导致牙菌斑生物膜的pH值下降来抑制其他共生菌的生长，从而奠定自己在生物膜中的优势地位。变异链球菌通过生物膜的形成依靠细胞外基质的保护和其他信号传导通路来应对环境变化带来的压力。其分泌的葡糖基转移酶和果糖基转移酶可以有效合成细胞外多糖，一方面促进细菌与牙齿表面的黏附，另一方面为其他的细菌的定植提供结合位点，促进稳定生物膜的形成。变异链球菌的主要致龋毒力因子主要包括其产酸、耐酸、胞外多糖合成、生物膜形成能力等。
目前，龋病防治存在抗龋效果差的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米颗粒及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种纳米颗粒，其包括包覆载体和携带变异链球菌vicR基因反义RNA的重组质粒，重组质粒与包覆载体通过静电吸附结合，包覆载体的材料为精胺改性的淀粉材料。
发明人提供了一种抗龋的新的纳米材料，其包括携带变异链球菌vicR基因反义RNA的重组质粒，该重组质粒可以调控变异链球菌vicR基因的表达，可以降低vicR基因的表达水平，减少变异链球菌胞外多糖的合成，降低其生物膜的黏附聚集能力，通过转录后微调控的方式达到抗龋作用。
与重组质粒静电结合的是包覆载体。包覆载体由价格低廉且生物相容性好的精胺改性的淀粉材料制得。由于重组质粒带负电荷，而淀粉表面电荷为负，发明人通过精胺对淀粉材料进行表面改性，以使得淀粉的表面均带有正电荷，从而满足了重组质粒与精胺改性后的淀粉材料的静电结合。
需要说明的是，淀粉与精胺的组合是发明人经过长期摸索和大量试验筛选出的生物相容性好、易分解、安全性能高的材料组合，具有特殊的技术效果。
淀粉是自然界中常见的大分子，广泛存在于各种食物中，且价格低廉，较易获得。使用淀粉制备纳米颗粒用于龋病的治疗或预防时，可以便于唾液中的淀粉酶对淀粉进行降解，暴露出其连接的重组质粒，进而减缓致龋菌的生长速度，降低VicR蛋白的表达量，抑制生物膜形成能力和细菌的粘附能力，并减少变异链球菌胞外多糖的合成。
精胺是一种多胺类物质，其广泛存在于细菌和大多数动物细胞中，是促进细胞增殖的重要物质，具有良好的生物相容性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述重组质粒与包覆载体的质量比为1：2-10。发明人发现，在上述质量比范围内，精胺改性淀粉材料与质粒的结合能力处于较高水平。
在一种可选的实施方式中，重组质粒与包覆载体的质量比为1:8。重组质粒与包覆载体的质量比为1:8时，使用乳液双向法时，发现在1:8比例下制备的微球形态较好。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述精胺改性的淀粉材料是指：N,N'-羰基二咪唑处理后的淀粉与精胺反应后的产物；淀粉为淀粉酶酶解后的淀粉。N,N'-羰基二咪唑是作为活化剂将基团引入淀粉的羟基中。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述变异链球菌vicR基因反义RNA的重组质粒为pDL278AsvicR。该重组质粒由专利CN108130300B构建，构建方法同专利CN108130300B，变异链球菌为CCTCCM2017746。
本发明提供了一种纳米颗粒的制备方法，其包括：将精胺改性的淀粉材料与重组质粒混合。
在本发明应用较佳的实施方式中，采用乳液双向法将精胺改性的淀粉材料和重组质粒制备纳米颗粒；其包括：将精胺改性的淀粉材料与重组质粒混合制得分散相，以聚乙二醇为连续相，将分散相与连续相混合，收集沉淀；
在一种可选的实施方式中，分散相与连续相的混合体积比为1:4-8。分散相与连续相的体积比为1:8时，精胺改性淀粉材料与质粒的结合形成微球的能力较强。
在一种可选的实施方式中，连续相中聚乙二醇的浓度为100g-600g/L，聚乙二醇的分子量为8000-20000。
在一种可选的实施方式中，收集沉淀包括：将分散相与连续相混合后进行静置，然后离心收集沉淀；在一种可选的实施方式中，收集沉淀后采用乙醇洗涤沉淀。可选的，反复进行乙醇洗涤步骤。
上述静置是在0-8℃下静置24h以上。通过静置以便于更为充分的收集沉淀。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括精胺改性的淀粉材料的制备，其包括：先将N,N'-羰基二咪唑与淀粉酶酶解后的淀粉混合反应，然后将反应产物与精胺混合反应。
在一种可选的实施方式中，N,N'-羰基二咪唑与淀粉酶酶解后的淀粉混合反应时间为2-3h；反应产物与精胺混合反应是在油浴35±2℃反应18-24h；在一种可选的实施方式中，与精胺混合反应后依次进行透析、冷冻干燥制得粉末。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述N,N'-羰基二咪唑与淀粉中葡萄糖单位的摩尔质量比为1:2-6。例如可以是1:2、1:4、1:5或1:6。
发明人发现，当精胺与淀粉中葡萄糖单位的摩尔质量比为1:2-6时，精胺改性淀粉材料表面带正电荷。当摩尔质量比为1:2时，精胺改性淀粉材料具有更高的zeta电位。
在一种可选的实施方式中，精胺与N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为5-1:1。
在一种可选的实施方式中，淀粉是依次经过普鲁兰酶和α-淀粉酶处理后的淀粉。普鲁兰酶能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉。α淀粉酶可水解淀粉中的α-1,4糖苷键，形成分子量更小的淀粉。
本发明还提供了一种纳米颗粒或由上述的制备方法制得的纳米颗粒在口腔疾病防治药物或抑菌药物的应用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述口腔疾病包括不限于龋病、牙菌斑、牙龈出血或牙石。抑菌包括不限于产酸菌属和革兰性阳性菌；产酸菌属包括不限于变异链球菌、放线菌属和乳杆菌，只要能使得碳水化合物分解产酸导致牙齿无机质脱矿均在本发明的保护范围内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗龋的新的纳米材料，其包括携带变异链球菌vicR基因反义RNA的重组质粒，该重组质粒可以调控变异链球菌vicR基因的表达，可以降低vicR基因的表达水平，减少变异链球菌胞外多糖的合成，降低其生物膜的黏附聚集能力，通过转录后微调控的方式达到抗龋作用。
与重组质粒静电结合的是包覆载体。包覆载体由价格低廉且生物相容性好的精胺改性的淀粉材料制得。由于重组质粒带负电荷，而淀粉表面电荷为负，发明人通过精胺对淀粉材料进行表面改性，以使得淀粉的表面均带有正电荷，从而满足了重组质粒与精胺改性后的淀粉材料的静电结合。
本发明提供的抗龋的新的纳米材料对于口腔疾病防治药物或抑菌药物的开发具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1、3中合成精胺改性淀粉材料结合目的质粒形成微球材料的流程图以及微球材料的扫描电镜图；
图2为本发明实验例1精胺改性淀粉材料与质粒的结合能力中Zeta电位结果、琼脂糖凝胶电泳结果以及精胺改性的模式图；
图3为本发明实验例2精胺改性淀粉材料与质粒的结合能力的琼脂糖凝胶电泳结果、实验例2微球材料对质粒的释放作用及保护作用的琼脂糖凝胶电泳结果以及酶解的模式图；
图4为本发明实验例3微球材料的细胞毒性实验和cck8结果、本发明实验例4微球材料在变异链球菌中导入质粒并表达GFP蛋白的结果、微球材料作用模式图；
图5为本发明实验例5SMS-AS微球材料对变异链球菌vicR、dexA蛋白表达含量的检测结果、本发明实验例6SMS-AS微球材料对变异链球菌毒力相关基因表达检测结果；
图6为本发明实验例7微球材料影响变异链球菌胞外多糖合成的检测结果；
图7为本发明实验例7微球材料影响变异链球菌胞外多糖合成的荧光染色联合激光共聚焦检测结果；
图8为本发明实验例8微球材料影响变异链球菌致龋性的体内研究结果、本发明实验例9基因测序结果和动物实验流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了精胺改性淀粉材料(SMS)的合成方法，参照图1所示，具体包括如下依次进行的步骤：
(1)先进行大分子玉米淀粉的酶解：将20g玉米淀粉(玉米淀粉，索莱宝，中国)溶于400ml的PBS缓冲液中，配制成5％的淀粉溶液，将该溶液放置于80℃的油浴锅中加热30分钟，使淀粉糊化。将糊化淀粉于室温冷却至60℃，加入1g普鲁兰酶(普鲁兰酶，麦克林，中国)，油浴60℃反应14h。升温至95℃，保持30分钟，使普鲁兰酶失活。将淀粉溶液于室温中冷却至60℃，加入0.1gα-淀粉酶，60℃油浴反应30分钟，升温至95℃，保持30分钟，使淀粉酶失活。将溶液冷却至室温，10000rpm 10min离心浓缩，去离子水中透析3天(截留分子量为7000)。淀粉溶液冷冻干燥，粉末置于干燥器中备用。
(2)合成精胺改性淀粉分子(SMS)：将步骤(1)酶解后的玉米淀粉溶于无水二甲亚砜中，配制成浓度为20mg/ml的溶液。加入不同比例的N,N'-羰基二咪唑(CDI)(CDI与淀粉中葡萄糖单位的摩尔质量之比为1:2、1:4和1:6)，室温反应2h。加入不同摩尔比例的精胺(精胺(mol)/CDI(mol)＝1:1，精胺与葡萄糖单位的摩尔质量为1:2、1:4、1:6)，油浴35℃反应24h。反应产物在去离子水中透析3天(截留分子量为7000)，冷冻干燥，粉末置于干燥器中备用。
实施例2
本实施例提供了携带变异链球菌反义vicR和GFP基因的重组质粒的提取方法。
重组质粒来自课题组前期实验保存的大肠杆菌甘油菌(其保藏号为CCTCC NO:M2017746)，使用添加了壮观霉素(spe)的LB固体培养基培养48h后，挑取单菌落，使用添加了壮观霉素(spe)的LB液体培养基在恒温摇床(37℃，300rpm)中培养16-20h。所得菌液使用天根无内毒素大提试剂盒提取质粒(天根，中国)。
实施例3
本实施例提供了合成精胺改性淀粉材料结合质粒的微球(SMS-AS)方法。
乳液双向法合成精胺改性淀粉材料结合质粒的微球(SMS-AS)。
1、制备连续相：将聚乙二醇20000溶于去离子水中(4g/10ml)，水浴80℃一个小时,使其充分溶解，将PEG20000溶液分装到离心管中，50℃水浴备用。
2、制备分散相：将实施例1制备的精胺改性淀粉材料溶于灭菌去离子水中，配制成精胺改性淀粉溶液(50mg/ml)，50℃水浴20分钟，超声5分钟，使精胺改性淀粉分子充分分散。将实施例2制备的携带ASvicR的质粒与精胺改性淀粉溶液混合，混合质量比为1:8，振荡1分钟，使其充分混合，制备成分散相。
3、将分散相倒入连续相中，体积比为1:8，充分颠倒混匀，振荡10分钟，使分散相充分分散。所得液体放置于4℃冰箱中24h以上，5000rpm离心15分钟，倒掉上清。使用75％乙醇洗涤沉淀3次，无水乙醇将沉淀脱水，产物置于50℃烘箱中过夜，得到白色粉末(SMS-ASvicR纳米粒子材料，即为SMS-AS)，置于干燥器中。
制得的微球纳米材料分别在乙醇和去离子水中的扫描电镜图参照图1中的B所示。
实验例1
本实验例测试不同配比的精胺改性淀粉材料与质粒的结合能力。
使用马尔文纳米粒度电位仪测试精胺与葡萄糖单位的摩尔质量比分别为1:2、1:4、1:6时的三种精胺改性淀粉材料的Zeta电位，此时，控制CDI与淀粉中葡萄糖单位的摩尔质量之比为1:2。
具体结果如图2中的A所示，淀粉材料表面电荷为负，使用精胺对淀粉材料进行了改性之后，改性材料的表面均带正电荷。并且，在精胺/葡萄糖单位为1:2、1:4、1:6三种精胺改性淀粉材料中，1:2组的材料具有更高的zeta电位。精胺改性淀粉材料表面带正电荷，在使用1:2比例的精胺改性淀粉材料与目的质粒合成微球之后，SMS-AS微球材料的表面电荷为负，说明二者充分结合。
图2B为精胺改性淀粉材料的红外光谱图，图2C为精胺改性淀粉材料的NMR图谱。图2D为三种精胺改性淀粉材料的元素分析结果，图2E为精胺改性淀粉材料的模型图。
实验例2
使用琼脂糖凝胶电泳法评价不同配比的精胺改性材料与质粒的结合能力，配制1％的琼脂糖凝胶，恒压100V电泳30分钟，具体结果如图3中A所示，1:2组的精胺改性淀粉材料与质粒的结合能力最强。
本实验例测试了微球材料对质粒的释放作用及保护作用。
(1)使用α淀粉酶作用于实施例1制备的SMS-AS微球材料30min，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的释放情况，恒压100V，30min。具体结果如图3B所示，α淀粉酶可水解SMS-AS微球材料中的α-1,4糖苷键，使目的质粒被释放出来。
(2)使用DNaseI分别作用于SMS-AS微球材料和单独的质粒15min，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNaseI对质粒的分解作用，恒压100V,30min。具体结果如图3C所示，SMS-AS材料对目的质粒具有保护作用。
实验例3
本实验例测试微球材料的细胞毒性实验和cck8的细胞活力。
在补充10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM中于37℃和5％CO2条件下培养牙龈成纤维细胞。(1)细胞毒性测定：将处于对数生长期的细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中过夜。然后，用不同浓度(3.6、14.4和28.8μg/mL)的SMS-ASvicR纳米颗粒处理细胞。培养24小时后，使用Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒评估细胞活力，结果如图4中B、C所示，加入了纳米颗粒的细胞与空白组细胞的CCK8结果无统计学差异，细胞形态无明显变化。
(2)细胞死活染：将处于对数生长期的细胞以每孔20000个细胞的密度接种在24孔板中过夜。显微镜下观察细胞已贴壁生长后，然后，用不同浓度(3.6、14.4和18.8μg/mL)的SMS-ASvicR纳米颗粒处理细胞。培养24小时后，使用Calcein-AM/PI试剂盒评对细胞进行荧光标记，然后在荧光显微镜下观察细胞，结果如图4A所示，加入了纳米颗粒的细胞与空白组细胞相比，形态无明显变化。
实验例4
本实验例使用微球材料成功在变异链球菌内导入质粒，并表达GFP蛋白。
将变异链球菌UA159株接种于5mLBHI，过夜复苏后，按照1:20比例稀释于2mL新鲜配制含1％蔗糖的BHI培养基，放置于玻底皿中培养。于厌氧培养箱培养到OD＝0.5时，加入SMS-AS微球材料，再放入厌氧培养箱中培养3h，使用Alexa Fluor 555对变异链球菌胞壁进行染色。激光共聚焦显微镜激发光为555和488时观察变异链球菌内的GFP绿色荧光蛋白和胞壁。结果如图4D所示，添加了SMS-AS材料的变异链球菌表达绿色荧光蛋白，而空白组不表达。模式图如图4E所示。
实验例5
本实验例进行SMS-AS微球材料对变异链球菌vicR、dexA蛋白表达含量的检测。
变异链球菌总蛋白提取：变异链球菌UA159株接种于10mLBHI，过夜复苏后，按照1:10比例稀释于3mL新鲜配制含1％蔗糖的BHI培养基，于六孔板中培养，每隔4h分别加入(SMS-AS、SMS、质粒、PBS)，厌氧培养12h后，刮下生物膜，加入溶菌酶37℃放置30min，超声波破碎2min，4℃离心(4500rpm，10min)后收集上清，nanodrop测定蛋白浓度，加入蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor cocktail,Sigma)备用。VicR蛋白的Western Blot验证：
①SDS-PAGE电泳跑胶：蛋白胶(Precise4-20％Tris-HEPES Gels；Waltham,MA,USA)顺序：SMS-AS，SMS，质粒，PBS 160V分离样品70min左右。②转膜：电压70V，时间90min。③Tris-HEPES蛋白胶以考马斯亮蓝染色，摇床室温过夜后，脱色。④Nitrocellulose膜5％脱脂牛奶封闭，室温置于摇床2h。⑤孵育一抗：弃去用于封闭的脱脂牛奶，加入约15mL新鲜配制的脱脂牛奶，加入anti-VicR和anti-dexA单抗5μL，置于摇床上室温孵育2h后；弃去牛奶，用TSBT洗涤3次，每次10min，约15mL体积。⑥孵育二抗：加入约15mL新鲜配制的脱脂牛奶，按照1:10000的稀释比例为，加入anti-rabbit二抗1.5μL。置于摇床上室温孵育2h后；弃去牛奶，用TSBT洗涤3次，每次10min，约15mL体积。⑦显影：配制适量的Immobilon Western(Milipore，USA)HRP底物发光检测液。向NC膜上均匀的加上约200μL配制好的发光检测液，将NC膜包裹于洁净的保险膜中室温避光放置约3min，并固定于X光片暗盒中Electrophoresis system(Bio-Rad，USA)。在暗室中取出一张X光片置于NC膜上，合上暗盒压片约10min。将曝光的X光片置于事先配制好的显影液developer中3min，双蒸水轻荡洗，后置于定影液中5min。
结果如图5中B所示，SMS-AS组vicR蛋白的颜色较浅，dexA蛋白的颜色较深，说明SMS-AS微球材料处理过的变异链球菌组比PBS处理过的变异链球菌组的vicR蛋白的表达量更低，dexA蛋白表达量更高。
实验例6
SMS-AS微球材料对变异链球菌毒力相关基因表达检测包括如下步骤：
总RNA提取方法：变异链球菌UA159株接种于10mLBHI，过夜复苏后，按照1:10比例稀释于3mL新鲜配制含1％蔗糖的BHI培养基，于六孔板中培养，每隔4h分别加入(SMS-AS、SMS、质粒、PBS)，厌氧培养12h后，刮下生物膜，离心后收取细菌样本，重悬于PBS中备用，使用MasterPure RNA purification Kit(Epicentre)提取RNA,吸取2μL RNA样品，使用NanoDropTM 2000c Spectrophotometer(Thermo Scientific，USA)测量RNA样品的浓度和纯度。基因组DNA的除去反应：得到的RNA溶液加入2μl Turbo RNase-free DNase I(Ambion,Thermo Scientific,USA)，42℃作用2min去除总RNA溶液中残存的DNA。
细菌mRNA反转录方法:取以上步骤获得的总RNA溶液按照RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis(Thermo Scientific，USA)说明书提供的方法进行反转录反应，具体步骤如下：含有1μg RNA溶液中依次加入：1μL Random Primer,4μL 5×ReactionBuffer；1μL RiboLock RNase Inhibitor；1μL RevertAid M-MuLV RT；10μL RNase FreeH2O轻微涡旋振荡混匀后，总体积共20μL。依次按照25℃作用5min，42℃作用60min，完成cDNA合成后置于-20℃保存备用。
实时定量PCR：LightCycler 480SYBR Green I Master嵌合荧光法进行Real-timePCR扩增。根据LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche，Basel，Switzterland)说明书提供的方法进行反应体系加样和两步法PCR扩增程序进行目的基因的real-time PCR扩增，扩增后获得各目的基因Ct(cycle threshold)值。本实验采用相对定量的方法，通过2-ΔΔCt法对目的基因的相对表达水平进行计算分析，获得使用了不同材料(SMS-AS、SMS、质粒、PBS)的变异链球菌生物膜基因的表达差异，选取细菌gyrA基因作为内参。实验结果通过3个独立的real-time PCR扩增实验获得，RT-qPCR反应体系与使用引物如下：
Real-time PCR反应体系(20μl)
试剂
使用量
SYBR Green I Master
10μl
PCR Forward Primer(20uM)
1μl
PCR Reverse Primer(20uM)
1μl
cDNA模版
1μl
灭菌蒸馏水
7μl
Real-time PCR反应引物序列
结果如图5中A所示，结果显示加入SMS-AS纳米材料的变异链球菌组的vicR基因、gtfB基因以及gbpB基因下调，而dexA基因上调。
实验例7
本实验例探究微球材料影响变异链球菌胞外多糖合成的作用。
采用扫描电镜检测方法：
变异链球菌UA159株接种于10mLBHI，过夜复苏后，按照1:10比例稀释于50mL新鲜配制含1％蔗糖的BHI培养基，调整OD值，使OD600≈0.5，将细菌悬液添加12孔板中，每孔2ml，每孔加入1片无菌圆形盖玻片；每组3孔平行，每隔4h分别加入(SMS-AS(3.6μg)、SMS-AS(14.4μg)、SMS-AS(28.8μg)、PBS)，将24孔板置于厌氧培养箱中，混合气(80％N2，20％CO2)，37℃，静置培养12h。小心取出圆盖玻片，使用PBS缓冲液震荡洗涤生物膜3次，吸水纸吸干，室温静置数分钟，晾干生物膜样本。将生物膜玻片固定于2.5％戊二醛中，4℃避光放置4h；用30％、50％、75％、85％、95％、99％浓度的乙醇进行梯度脱水，每次脱水15min；置换，干燥喷金后在扫描电子显微镜(Inspect Hillsboro，USA)下进行观察并进行图像采集。
结果如图6所示，随着加入SMS-AS纳米材料量的增加，生物膜细菌周围包裹更稀疏，胞外基质的结构更单薄，比例更少。加入28.8μgSMS-AS纳米材料的组相比于空白对照组的胞外基质明显减少。
同时采用了荧光染色联合激光共聚焦检测方法，包括如下步骤：
变异链球菌UA159株接种于10mL BHI，过夜复苏后，按照1:10比例稀释于50mL新鲜配制含1％蔗糖的BHI培养基，调整OD值，使OD600≈0.5，将细菌悬液添加12孔板中，每孔2ml，每孔加入1片无菌圆形盖玻片；每组3孔平行，每隔4h分别加入(SMS-AS、SMS、质粒、PBS)，将24孔板置于厌氧培养箱中，混合气(80％N2，20％CO2)，37℃，静置培养12h。小心取出圆盖玻片，使用PBS缓冲液震荡洗涤生物膜3次，吸水纸吸干，室温静置数分钟，晾干生物膜样本。在生物膜晾干且呈湿润状态时，每个生物膜玻片滴加50μl Syto 9 Nucleic AcidStain(1:50稀释)以及Alexa647(终浓度为1μL/mL)荧光标记细菌细胞，室温孵育15min；用PBS缓冲液轻柔洗去残留染料，吸水纸吸干。室温晾干生物膜至湿润状态时，将生物膜玻片置于载玻片上，无荧光封片油封片，将样本尽快置于激光共聚焦显微镜(TSP SP2，Leica，Solms，Germany)下观察。
结果如图7所示，使用了SMS-AS纳米材料组的变异链球菌生物膜结构呈疏松弥散状，相比于空白对照组，生物膜厚度减小，胞外基质含量减少。
实验例8
本实验例进行微球材料影响变异链球菌致龋性的体内研究。
将变异链球菌标准株UA159过夜复苏后，按照1：20比例分别稀释于10mL新鲜配制的含1％蔗糖的BHIS培养基中，继续培养3小时使OD600≈0.5。使用无菌棉签将细菌涂布于大鼠磨牙牙齿表面并将0.2mL菌液接种于双侧大鼠下颌磨牙区，每日接种一次，连续接种一周。同时将等量材料(SMS-AS、SMS、质粒、PBS)0.2ml涂布于双侧大鼠下颌磨牙区，每天两次，连续处理两周，处理后2h暂停饮食供给。喂以Keyes2000#致龋饲料(四川成都达硕)和灭菌5％蔗糖水溶液。处理完成后连续饲养动物2周，CO2窒息法处死大鼠，取下颌骨标本，无菌PBS缓冲液冲洗3次。将样本放于4％多聚甲醛中，4℃避光固定24小时。冷却状态下使用超薄金刚砂片沿下颌骨磨牙牙合面近远中向半切，体视显微镜下观察患龋情况，并根据Keyes经典评分法对大鼠磨牙光滑面和窝沟龋损进行分级并评分。根据龋坏深度可分为：E级龋损仅限于釉质；Ds级龋损仅限于釉质；Dm级龋损累及超过牙本质厚度的1/4而未及3/4；Dx级龋损累及深度超过牙本质厚度3/4甚至全层。
结果如图8中A、B所示，使用MS-AS纳米材料组的大鼠下颌后磨牙患龋率更低，具有抑制龋病发生的作用。
实验例9
本实验例通过基因测序检测使用微球材料的安全性。
将变异链球菌标准株UA159、格式链球菌、血链球菌三种口腔常见菌株过夜复苏后，按照1：20比例分别稀释于10mL新鲜配制的含1％蔗糖的BHIS培养基中，继续培养3小时使OD600≈0.5。使用无菌棉签将细菌涂布于大鼠磨牙牙齿表面并将0.2mL菌液接种于双侧大鼠下颌磨牙区，每日接种一次，连续接种三天。使用无菌拭子取大鼠口腔内唾液。再将纳米材料SMS-AS0.2ml涂布于双侧大鼠下颌磨牙区，处理后2h暂停饮食供给。5h后使用无菌拭子取大鼠口腔内唾液。
将使用SMS-AS纳米材料前后所取的大鼠唾液进行基因测序，结果如图8C所示，使用SMS-AS纳米材料前后无明显变化。
综上，本发明实施例提供的精胺改性淀粉材料结合质粒微球(SMS-AS)可以调控变异链球菌vicR基因表达，并使得VicR蛋白的表达水平下降，使得dexA的基因表达以及dexA的蛋白表达上升，使得生物膜形成能力下降，细菌胞外多糖含量降低等致龋相关能力降低的作用，在体内实验中证明具有抑制龋病发生的作用，且生物安全性良好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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