一类生物碱化合物的制备方法
阅读说明：本技术 一类生物碱化合物的制备方法 (Preparation method of alkaloid compound ) 是由 李丽梅 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了中国水仙鳞茎中一类新生物碱化合物的制备方法。本发明方法制备得到的两个具有免疫抑制活性的生物碱类化合物,可用于该类化合物的提取纯化,所得化合物亦可用于进一步的免疫抑制研究,也可以作为中间体,继续反应得到更多更好的相关活性化合物。(The invention discloses a preparation method of a new alkaloid compound in Chinese narcissus bulb. The two alkaloid compounds with immunosuppressive activity prepared by the method can be used for extracting and purifying the compounds, and the obtained compounds can also be used for further immunosuppressive research and can also be used as intermediates to continuously react to obtain more better related active compounds.)
技术领域
本发明涉及一类具有免疫抑制活性新化合物的制备方法，属多花水仙碱型生物碱化合物。
背景技术
中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，其鳞茎具有清热解毒、散结消肿功效。研究表明中国水仙鳞茎中主要含有生物碱、黄酮、黄烷及其衍生物和木脂素等成分，其中石蒜生物碱是其特有的次生代谢产物，结构类型丰富，根据环的类型不同分为石蒜碱类、网球花胺类、多花水仙碱类、水仙环素类和加兰他敏类等。
为了提高中国水仙药用植物资源的综合利用效率，发明人对其鳞茎部分的生物碱成分进行了系统研究，以期能够发现具有生物活性的提取物或化合物。
发明内容
发明人通过对中国水仙鳞茎部分生物碱进行提取纯化，最终获得了一类具有良好生物免疫抑制活性的生物碱类化合物。
具体地，本发明提供了如式I所述的化合物的制备方法，其特征在于：
其中，R选自H或甲基；
包括如下内容：
(1)水仙鳞茎，乙醇或甲醇提取，提取液除去溶剂后，在碱性水溶液中与正丁醇萃取，取正丁醇部位硅胶柱层析，氯仿-甲醇＝1:0-0:1梯度洗脱，薄层跟踪合并相似组分，依次得到A-G七个部分；
(2)取B部分上硅胶柱层析，以石油醚-丙酮＝15:1-1:1梯度洗脱，薄层跟踪合并相似组分，得到B-1～B-6六个部分；
(3)取B-5部分进行ODS反相柱层析，以甲醇-水＝0:1-1:1梯度洗脱，薄层跟踪合并相似组分，得到B-5-1～B-5-5五个部分；
(4)取B-5-2部分上半制备HPLC，以20％甲醇水洗脱，得到R为甲基的式I化合物；
(5)取G部分进行ODS反相柱层析，以甲醇-水＝0:1-1:0梯度洗脱，薄层跟踪合并相似组分，得到G-1～G-4四个部分；取G-1部分上氨基硅胶柱层析，以氯仿-甲醇＝40:1-20:1梯度洗脱，得到R为H的式I化合物。
其中，内容(1)中，碱性水溶液pH为9～11；氯仿-甲醇梯度洗脱时，每个梯度洗脱2-4个柱体积，例如2、3、4个柱体积。
其中，pH可以选自9、10、11或者其他碱性条件。
内容(2)中，石油醚-丙酮梯度洗脱时，每个梯度洗脱2-4个柱体积，例如2、3、4个柱体积。
内容(3)中，甲醇-水梯度洗脱时，每个梯度洗脱3-5个柱体积，例如3、4、5个柱体积。
内容(4)中，20％甲醇水中含有1-3‰三氟乙酸，例如1、2、3‰。
内容(4)中，采用1mL/min，收集保留时间约8min的部位，即得R为甲基的式I化合物。当然若采用其他流速，保留时间会有所变化，但仍可根据常规方法获知保留时间。
内容(5)中，甲醇-水梯度洗脱时，每个梯度洗脱3-5个柱体积，例如3、4、5个柱体积。
内容(5)中，氯仿-甲醇梯度洗脱时，每个梯度洗脱2-3个柱体积，例如2、3个柱体积。
内容(5)中，收集氯仿-甲醇＝30:1梯度段，即得R为H的式I化合物。
本发明内容(1)中，可以采用加热回流提取、超声提取、微波辅助提取、浸提等多种方式。
提取次数以尽可能完全提取植物成分为目标，一般可以使用1、2、3、4次提取。
本发明上述方法可以制备得到的两个具有免疫抑制活性的生物碱类化合物，可用于该类化合物的提取纯化，所得化合物亦可用于进一步的免疫抑制研究，也可以作为中间体，继续反应得到更多更好的相关活性化合物。
式I化合物的免疫抑制活性及有益效果如下：
下面结合细胞试验对本发明提供的两个生物碱类化合物在免疫抑制方面的效果进行评价。
1)T细胞分离与纯化方案
取健康献血员的外周血，Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。采用免疫磁珠分离法，通过阴性选择从PBMC中获得“未改变的”(untouched)CD4+T细胞。具体操作参照Miltenyi公司Pan T Cell Isolation Kit II(Human)说明书。纯化的CD4+T细胞，通过流式细胞术检测，细胞阳性率大于95％方可用于后续试验。
2)T细胞刺激方案
使用anti-CD3/CD28 mAbs刺激T细胞，具体试验步骤均按常规操作进行。
3)免疫抑制活性的检测
采用免疫磁珠分离法从人外周血单个核细胞(PBMC)获得T细胞。铺96孔板，2×105/孔。以anti-CD3/CD28 mAbs刺激T活化增殖，96hr后，该类生物碱化合物(1和2，浓度依次为0.2,1,5,25μM)，孵育72hr，CFSE染色结合流式细胞术检测样品，通过与阴性对照(DMSO)进行比较，判定样品对活化T细胞增殖的抑制作用。
4)试验结果
试验结果表明，该类生物碱化合物显示出很好的免疫抑制活性，其对T细胞增殖抑制活性的IC50分别为26.3,21.5μM(表1)，揭示了本发明提供的这类生物碱化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景。
表1
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为化合物1的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图2为化合物1的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图3为化合物2的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图4为化合物2的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图5为化合物1和2的主要HMBC相关；
图6为该化合物1和2的主要NOESY相关。
具体实施方式
实施例1
新鲜水仙鳞茎40公斤，用切菜机将其反复切碎，用甲醇60℃提取2次，提取液浓缩得到浸膏，用水分散，以氨水调节pH＝10，用等体积正丁醇萃取得到总生物碱(105g)，进行正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脱(每个梯度3个柱体积)，TLC分析合并相似组分，依次得到A-G 7个部分。
B部分(14g)进一步进行正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(15:1-1:1)梯度洗脱(每个梯度3个柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到B-1～B-6等6个部分。
B-5(3.3g)进一步进行ODS反相柱层析，以甲醇-水(0:1-1:1)梯度洗脱(每个梯度4柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到B-5-1～B-5-5等5个部分。
B-5-2(55mg)以20％甲醇水(1‰TFA)洗脱，半制备HPLC(C18柱10×250mm,10μm)得到化合物2(16mg,1mL/min,Rt＝8min)。
G部分(40g)进行ODS反相柱层析，以甲醇-水(0:1-1:0)梯度洗脱(每个梯度4柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到G-1～G-4等4个部分。
其中G-1(1.0g)进行氨基硅胶柱层析，以氯仿/甲醇40:1-20:1梯度洗脱(每个梯度2柱体积)，得到化合物1(10mg)(化合物1是在30:1梯度段中获得)。
所得化合物1、2的理化性质和光谱数据如下：
化合物1：白色无定型粉末，易溶于甲醇、氯仿；UV(MeOH)λmax(logε)：206(4.17),241(3.26),291(3.35)；1H and13C NMR数据见表1；HRESIMS m/z288.1236[M+H]+(calcd for C16H18NO4,288.1230)。命名为：3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine，化学名为(3S,4aS,6aR,13bS)-3,4,4a,5,6,6a-hexahydro-8H-[1,3]dioxolo[4',5':6,7]isochromeno[3,4-c]indol-3-ol
化合物2：白色无定型粉末，易溶于甲醇、氯仿；UV(MeOH)λmax(logε)：207(4.28),241(3.36),293(3.47)；1H and13C NMR数据见表1；HRESIMS m/z302.1392[M+H]+(calcd for C17H20NO4,302.1387)。命名为6a-deoxynortazettine，化学名为(3S,4aS,6aR,13bS)-3-methoxy-3,4,4a,5,6,6a-hexahydro-8H-[1,3]dioxolo[4',5':6,7]isoc hromeno[3,4-c]indole。
化合物1、2的结构式如下：
表2.化合物1和2的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据(in CD3OD)
新化合物的结构确认：
化合物1为白色无定形粉末，溶于甲醇；与改良碘化铋钾显色反应阳性，提示可能为生物碱类化合物；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z:288.1236[M+H]+(计算值为C16H18NO4,288.1230)，确定分子量为287。结合氢谱、碳谱推断分子式为C16H17NO4，不饱和度为9。1H-NMR(400MHz,CD3OD)在芳香质子区域给出两个单峰δH 6.72(1H,s)和δH 7.07(1H,s)，显示存在一个有对位氢的四取代苯环；给出一对顺式取代双键质子δH 6.38(1H,d,J＝10.0Hz)和δH 6.29(dd,J＝10.0,4.8Hz)；给出亚甲基质子信号δH 5.98(s)，结合碳谱δC103.1的亚甲基碳信号，显示该化合物具有亚甲二氧基。此外，13C-NMR谱(100MHz,CD3OD)和HMQC谱显示，此化合物中还有3个脂肪亚甲基，3个脂肪次甲基，4个芳香季碳，1个饱和季碳，初步推测为多花水仙碱型生物碱，与已知化合物nortazettine核磁数据对比(The Journalof Organic Chemistry,1968,33(8):3105-3109.)，化合物1少了1个饱和季碳(δC 101.4)多了1个脂肪次甲基(δC 78.5,δH 4.17)，另外还少了1个甲氧基，提示化合物1可能为3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine。在HMBC谱中，H-4a与C-6、C-6a相关，H-6a与C-12a相关，H-1与C-3、C-4a相关，H-3与C-4a相关，证明了以上推测的合理性(如图5所示)。在NOESY谱中，H-4a与H-6a、H-6β相关，H-3α与H-6α相关，确定了化合物1的相对立体构型与nortazettine相同(如图6所示)。因此，化合物1被鉴定为3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine。其1H NMR和13C NMR数据见表2。
化合物2为白色无定形粉末，溶于甲醇；与改良碘化铋钾显色反应阳性，提示可能为生物碱类化合物；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z:302.1392[M+H]+(计算值为C17H20NO4,302.1387)。结合氢谱、碳谱推断分子式为C17H20NO4，不饱和度为9。通过仔细比较，发现化合物2和1具有几乎一致的1H NMR和13C NMR数据，唯一的区别在于化合物2比1多了一个甲氧基。提示化合物2可能比化合物1在C-3位多了1个甲氧基。在HMBC谱中H-OMe与C-3相关，H-3与C-1、C-4a相关，证实了以上推测，其他HMBC相关及NOESY相关与化合物1一致(如图5、图6所示)，因此，化合物2被鉴定为6a-deoxynortazettine。
结论：本发明提供的这类生物碱化合物是首次被分离出来的新化合物，通过旋光、紫外、核磁共振和质谱测定方法确定了其为多花水仙碱型石蒜生物碱类化合物，并表征了具体结构。经免疫抑制活性检测试验，结果显示该化合物对T细胞增殖具有显著抑制活性，IC50分别为26.3,21.5μM，由此说明该类化合物具有较好的免疫抑制活性，揭示了该类化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景，亦可作为免疫抑制药物的先导化合物，有助于自身免疫性疾病和免疫排斥的治疗。
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