一种引物纯化方法
阅读说明：本技术 一种引物纯化方法 (Primer purification method ) 是由 樊梓龙 刘俊 张钦 曹志旋 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种引物纯化方法,包括：步骤S1:将氨解后的核苷酸粗品采用有机溶剂进行第一次过柱洗涤,得到预产品；步骤S2：将所述预产品采用有机溶剂与水的混合溶剂进行过柱洗涤,得到纯化产品；其中,所述有机溶剂的体积百分比为87％～92％。与现有技术相比,本发明的有益效果在于：本发明采用先用纯乙腈作为洗脱液洗脱,在采用87％～92％的有机溶剂与水的混合溶液进行洗脱过柱,在有效的提高了合成产物的同时又确保了产物的产量。(The invention provides a primer purification method, which comprises the following steps: step S1, carrying out first column-passing washing on the aminolyzed crude nucleotide product by using an organic solvent to obtain a pre-product; step S2: carrying out column-passing washing on the pre-product by adopting a mixed solvent of an organic solvent and water to obtain a purified product; wherein the volume percentage of the organic solvent is 87-92%. Compared with the prior art, the invention has the beneficial effects that: the invention adopts pure acetonitrile as eluent for elution, and adopts a mixed solution of 87-92% of organic solvent and water for elution and column passing, thereby effectively improving the synthetic product and ensuring the yield of the product.)
技术领域
本发明属于引物合成领域，具体涉及一种引物纯化方法。
背景技术
当前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
合成后采用才接从固相载体上进行脱附，最后进行脱盐纯化。脱盐，又称为简易反相柱，氨盐可以被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，能有效的去除盐分，纯化后的寡核苷酸纯度可满足大多分子生物学实验需求，但是该方法不能有效去除比目的片段略短的引物小片段。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种引物纯化方法。
具体技术方案如下：
一种引物纯化方法，其不同之处在于，包括：步骤S1:将氨解后的核苷酸粗品采用有机溶剂进行第一次过柱洗涤，得到预产品；步骤S2：将所述预产品采用有机溶剂与水的混合溶剂进行过柱洗涤，最后用水进行过柱洗涤脱附产物，得到纯化产品；其中，所述有机溶剂的体积百分比为87％～92％。
进一步，所述有机溶剂为乙腈。
进一步，所述有机溶剂的体积百分比为90％。
一种引物合成方法，其不同之处在于，包括：
步骤A1：使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸；
步骤A2：将合成柱润湿后进行氨解，得到合成粗品；
步骤A3:将合成粗品按上述引物纯化方法进行纯化，得到纯化产品。
进一步，所述步骤A2中，采用润湿液对合成柱润湿，所述润湿液为由水与乙腈构成，乙腈的体积百分比为70％～80％。
进一步，所述氨解时间为90min，氨解温度为90℃。
进一步，所述步骤A1采用DNA合成仪完成；所述步骤A2中的氨解步骤采用氨解仪完成。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用先用纯乙腈作为洗脱液洗脱，在采用87％～92％的有机溶剂与水的混合溶液进行洗脱过柱，在有效的提高了合成产物的同时又确保了产物的产量。
(2)选取乙腈作为有机溶剂，极性大，纯化效果好，价格低廉，降低制备成本。
(3)本发明提供采用梯度纯化的引物合成方法，提高了纯度，同时，固相合成后，润湿后再进行氨解，进一步提高了产率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品
实施例1
本实施例提供一种固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸的方法，具体操作如下：
选择T10mers(TTTTTTTTTT(5’-3’))做为寡核苷酸的序列，通用合成柱为50nmol合成柱以及Mermade192E DNA合成仪进行合成，参数控制如下：
合成柱载量78nmol；CV值：9.1％；气阻值18-22mmHg；CPG Frits体积：50.20ul，品牌：深逗点生物技术有限公司。
实施例2
本实施例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将70％v/v乙腈和30％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul90％(v/v)乙腈+10％(v/v)高纯水进行第二次过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱，并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
实施例3
本实施例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将80％v/v乙腈和20％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul90％(v/v)乙腈+10％(v/v)高纯水进行第二次过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱，并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
实施例4
本实施例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将合成柱放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul90％(v/v)乙腈+10％(v/v)高纯水进行第二次过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱，并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
对比例1
本对比例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将80％v/v乙腈和20％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul100％乙腈进行第二次过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
对比例2
本对比例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将80％v/v乙腈和20％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
对比例3
本对比例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将80％v/v乙腈和20％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul80％(v/v)乙腈+20％(v/v)高纯水进行第二次过柱洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱，并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
对比例4
本对比例提供一种实施例1固相合成物的氨解基纯化方法，具体操作如下：
(1)将80％v/v乙腈和20％v/v水的润湿液加入合成柱中，加入体积大于合成柱的体积即可；并对合成柱进行抽真空处理，直至润湿液在合成柱中充分扩散润湿。
(2)放入气相氨解仪里，加入400pa的氨气与水蒸气，密封，反应时间90min，反应温度90℃。
(3)将氨解完成的合成柱，用200ul 100％乙腈第一次过柱洗脱，第二次用200ul50％(v/v)乙腈+50％(v/v)高纯水进行第二次洗脱，用离心机将残留液体甩干净后，用200ul体积的灭菌后的高纯水两次洗脱并回收寡核苷酸至96孔深孔板中。
将实施例2～4及对比例1～4的寡核苷酸采用紫外分光光度计在230nm与260nm的条件下进行检测，230nm条件下用来检测小分子等杂质的含量，260nm检测寡核苷酸产物含量，检测结果如表1所示：
表1 实施例2～4及对比例1～4的寡核苷酸230nm紫外分光光度计检测结果
寡核苷酸
A230
实施例2
4.368
实施例3
4.524
实施例4
4.823
对比例1
6.586
对比例2
5.093
对比例3
1.074
对比例4
0.810
表2 实施例2～4及对比例1～4的寡核苷酸260nm紫外分光光度计检测结果
本发明实施例与对比例1的区别在于，第二次洗脱溶液采用的有机溶剂与水的混合溶液，相较于对比例1，采用本发明的混合溶剂进行第二次洗脱，A230值降低至5以下。
本发明实施例与对比例2的区别在于，采用乙腈与混合溶剂进行了两次洗脱，降低了A230值。
本实施例与对比例3～4的区别在于，有机溶剂的体积百分比为87％～92％，对比例3有机溶剂的体积百分比为80％，对比例4的有机溶剂的体积百分比为50％，由表2测试结果可知，采用本发明的比例，可以在A230值降低至5以下的同时，维持A260的值在12以上，而对比例3～4虽然A230值大幅下降，但是A260的值也大幅下降，影响产物收率。
与此同时，在引物合成后，采用先润湿后氨解的方法，可以将A230的值下降至4.8以下，同时A260值提高至13以上，进一步，为润湿液的成分80％v/v乙腈和20％v/v水时，其产率进一步提高。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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