具体实施方式

本发明提供了其中将寡核苷酸和修饰核酸连接的寡核苷酸变体。

本发明的寡核苷酸具有[TGG]_m[TTG][TGG]_n的序列。

在本文中，n可以为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、 1至3或1至2的整数。此外，n可以为1至10、2至9、3至8、4至7或5至 6的整数。

m可以为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。此外，m可以为1至10、2至9、3至8、4至7或5至6的整数。

本发明的寡核苷酸可以为下表1中列出的序列之一，但不限于此。

[表1]

本发明的寡核苷酸富含鸟苷以形成G-四链体结构，并且是对核仁素具有特异性的适体。

如本文所用的术语“核仁素”是在转化细胞中以高水平表达的蛋白质，并且已知大多数肿瘤细胞在其细胞质和细胞核中表达核仁素，以及将核仁素暴露于细胞表面。核仁素在细胞中具有多种功能，并且可以参与核糖体产生、细胞生长和DNA复制。

本发明的寡核苷酸可以更选择性地结合至癌细胞并通过细胞中的各种机制抑制癌细胞的生长。

可以将一种或多种修饰核酸结合至本发明的寡核苷酸，以稳定修饰核酸或防止修饰核酸在体内失活。

此外，当将一种或多种修饰的核酸结合至寡核苷酸时，不仅可以表现出寡核苷酸本身的细胞生长抑制作用，而且可以表现出修饰核酸的细胞生长抑制作用，从而改善抗癌作用。

如本文所用的术语“修饰核酸”可以为化学修饰的核苷或核苷酸。

修饰核酸可以是脱氧尿苷(dU)、脱氧胞苷(dC)、尿苷(U)或胞苷(C)，其中至少一个卤素或羟基结合至其5-位或2’-位。例如，修饰核酸可以选自由以下组成的组：5-氟脱氧尿苷、5-氟尿苷、5-氟脱氧胞苷、5-氟胞苷、5-碘脱氧尿苷、5-碘尿苷、5-碘脱氧胞苷、5-碘胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、2’,2’-二氟脱氧胞苷、卡培他滨和溴乙烯基脱氧尿苷，或其衍生物。

可以在寡核苷酸的5'和3'方向中的至少一个上，且优选在寡核苷酸的5'方向上连接修饰核酸。

可以通过接头在寡核苷酸的5'和3'方向中的至少一个上连接修饰核酸。

接头可以为[-(CH₂)_a-]、[-(CH₂CH₂O)_b-]、[丁酰胺甲基-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-]、[1',2’-二脱氧核糖-]或(PEG)_y。此处，a可以为1至10、2至9、3至8、 4至7或5至6的整数。b可以为1至10、2至9、3至8、4至7或5至6的整数。y可以为1至20、2至19、3至18、4至17、5至16、6至15、7至14、8 至13、9至12或10至11的整数。

当在寡核苷酸的3'方向上连接修饰核酸时，可以进一步在修饰核酸的3'方向上连接idT、LNA、PEG或2’OMeNu。

通过在修饰核酸的3'方向上进一步连接idT、LNA、PEG或2’OMeNu，可以保护寡核苷酸变体的3'端免受核酸酶的攻击，从而降低寡核苷酸变体的体内降解速率。因此，可以将修饰核酸与寡核苷酸结合更长的时间，从而增加修饰核酸的抗癌功效。

具体地，本发明的寡核苷酸变体可以为具有式1的结构的化合物：

[式1]

(N)_x-[TGG]_m[TTG][TGG]_n-(M)_y

在式1中，N和M是修饰核酸，并且N和M可以是相同或不同类型的修饰核酸。修饰核酸的细节与上述相同。

在式1中，x和y可以独立地为0至10的整数，x和y同时为0的情况除外。

例如，在式1中，x可以为0至10、1至9、2至8、3至7或4至6的整数，并且y可以为0至10、1至9、2至8、3至7或4至6的整数。然而，排除x 和y同时为0的情况。

在式1中，n可以为1至10的整数，并且m可以为1至10的整数。

在式1中，n可以为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、 1至3或1至2的整数。此外，在式1中，n可以为1至10、2至9、3至8、4 至7或5至6的整数。

在式1中，m可以为1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、 1至3或1至2的整数。对于另一个实例，式1中的m可以为1至10、2至9、 3至8、4至7或5至6的整数。

例如，具有式1的结构的寡核苷酸变体可以为具有下表2中列出的式的结构的化合物。

[表2]

根据一个实施方案，本发明的寡核苷酸变体可以为这样的一种，其中在包含如SEQID NO:10中所示的序列的寡核苷酸的5'和3'方向中的至少一个上结合吉西他滨(其可以表示为2’,2’-二氟脱氧胞苷)。例如，本发明的寡核苷酸变体可以为这样的一种，其中在包含如SEQ ID NO:10中所示的序列的寡核苷酸的5' 方向上结合10或更少个、9或更少个、8或更少个、7或更少个、6或更少个、 5或更少个、4或更少个、3或更少个或者2或更少个吉西他滨。

根据另一个实施方案，本发明的寡核苷酸变体可以为这样的一种，其中在包含如SEQ ID NO:11中所示的序列的寡核苷酸的5'或3'方向上连接至少一个吉西他滨。例如，本发明的寡核苷酸变体可以为这样的一种，其中在包含如SEQ ID NO:11中所示的序列的寡核苷酸的5'方向上结合10或更少个、9或更少个、8 或更少个、7或更少个、6或更少个、5或更少个、4或更少个、3或更少个或者 2或更少个吉西他滨。

用于连接寡核苷酸和修饰核酸的一种方法可以包括将上述修饰核酸与上述寡核苷酸的5'端和3'端中的至少一个结合的步骤。

用于连接寡核苷酸和修饰核酸的另一种方法可以包括：通过化学合成将接头与上述寡核苷酸的5'端和3'端中的至少一个连接；然后，将修饰核酸与上述接头结合。

用于制备寡核苷酸变体的修饰核酸的结合可以包括使用固相反应器。

此外，本发明提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述寡核苷酸变体或其药学上可接受的盐。

寡核苷酸变体与上述相同。

上述癌症可以是核仁素相关癌症，诸如实体癌症和白血病。例如，癌症可以选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、骨髓增殖性疾病、实体组织癌、肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、低氧性肿瘤、口腔鳞状细胞癌、咽喉鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、子宫癌症、膀胱癌症、造血系统癌症、头颈癌症、神经系统癌症和乳头状瘤，但不限于此。此外，核仁素相关癌症可以选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、乳腺癌症、肝癌症、胃癌症、卵巢癌、子宫颈癌、神经胶质瘤癌症、结肠癌症、肺癌症、胰腺癌症、前列腺癌症、肝细胞瘤、胃腺癌、子宫癌症、膀胱癌症、甲状腺癌症、卵巢癌症、黑色素瘤和子宫颈癌症，但不限于此。

用于预防或治疗癌症的药物组合物中包含的寡核苷酸变体或其药学上可接受的盐的含量可以是能够表现出对预防或治疗癌症的作用的量，并且可以根据受试者的病症和/或疾病严重程度适当地调节。

去端肽胶原分散液可以含有每100ml PBS溶液0.5g至5.5g、1g至4.5g或 2g至3.5g的去端肽胶原。去端肽胶原分散液的去端肽胶原浓度可以为0.5％至 5.5％、1％至4.5％或2％至3.5％。

取决于本发明的药物组合物中所包含的去端肽胶原的浓度，在药物的持续时间或治疗作用上可能产生差异。因此，组合物中应包含适当浓度的去端肽胶原。

本发明的药物组合物中所包含的去端肽胶原可以呈围绕组合物中所包含的寡核苷酸变体的形式存在。

本发明的去端肽胶原可以通过包括以下步骤的方法来制备：a)将新鲜的猪皮在醋酸中溶胀、去除脂肪层、压碎真皮部分并将其悬浮于醋酸中，然后将碱性蛋白酶、过氧化氢酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的至少一种添加至悬浮液以提取物质；b)首先过滤所提取的物质并通过向所获得的滤液中添加中性盐将其盐析，之后进行第二次过滤；c)将通过第二次过滤所获得的残留物溶解以使用气相二氧化硅吸附脂肪，之后进行第三次过滤；以及d)将通过第三次过滤所获得的滤液冻干，以获得高纯度去端肽胶原。

本发明的去端肽胶原可以通过包括以下步骤的方法来制备：a)用碱性蛋白酶、过氧化氢酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的至少一种处理含胶原的动物组织以提取物质；b)首先过滤所提取的物质；c)向通过第一次过滤所获得的滤液中添加中性盐并且将所提取的物质盐析，之后进行第二次过滤；d)将通过第二次过滤获得的胶原盐溶解以吸附脂肪，之后进行第三次过滤；e)将通过第三次过滤所获得的滤液冻干，并回收冻干粉；以及f)将冻干粉溶解于pH 4至pH 8的稀盐酸(dil-HCl)、稀醋酸或磷酸盐缓冲液中并浓缩以制备去端肽胶原溶液，将所制备的去端肽胶原溶液注射至填充有聚合物珠的柱中，并且将所述柱在pH 4 至pH 8的稀盐酸、稀醋酸或磷酸盐缓冲液中展开，从而按分子量回收去端肽胶原。

在用于制备去端肽胶原的方法中使用的中性盐可以是氯化钠溶液。

在用于制备去端肽胶原的方法中，可以将冻干粉以10mM的浓度溶解于稀醋酸中或以10mM的浓度溶解于磷酸盐缓冲溶液中。

在用于制备去端肽胶原的方法中，可以用MWCO 100K Dalton浓缩冻干粉。

在用于制备去端肽胶原的方法中，注入去端肽胶原溶液的聚合物珠可以是Sephadex G-200 Sephacryl。

在用于制备去端肽胶原的方法中，注射至填充有聚合物珠的柱中的去端肽胶原溶液的体积可以是柱床体积的5％至20％。

在用于制备去端肽胶原的方法中，可以将去端肽胶原溶液注射至填充有聚合物珠的柱中，然后用浓度为10mM的稀醋酸或浓度为10mM的磷酸盐缓冲液展开以回收去端肽胶原。

本发明的药物组合物可以在各种制剂中使用。

例如，制剂可以包括粉剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌可注射溶液、无菌粉剂、溶胶-凝胶形式、支架形式或贴剂形式(圆片形式)，但不限于此。本发明的药物组合物可以为去端肽胶原分散液制剂。

可以将本发明的药物组合物施用至需要治疗和/或抑制异常增殖细胞的受试者。

可以将药物组合物作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用。此外，当与其他治疗剂组合施用时，它们可以顺序或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。当施用本发明的药物组合物时，重要的是施用能够以最小的量确保最大作用而无副作用的量，所述量是本领域技术人员可以容易地确定的。

施用可以是口服或肠胃外施用，例如可以包括静脉内注射、皮下注射或肌内注射，但不限于此。

待施用的受试者可以是哺乳动物，诸如灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、马、牛、狗或猫，但不限于此。

此外，本发明提供了用于制备如上所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物的方法。

用于产生根据本发明的药物组合物的方法可以包括制备其中分散有上述寡核苷酸变体的分散液。

可以通过将寡核苷酸变体与PBS混合来制备其中分散有寡核苷酸变体的分散液。

用于产生根据本发明的药物组合物的方法可以进一步包括将其中分散有上述寡核苷酸变体的分散液与去端肽胶原分散液混合的步骤。

可以通过将寡核苷酸变体与PBS混合来制备其中分散有寡核苷酸变体的分散液。

可以通过将去端肽胶原添加至NaOAc/HAc(醋酸)缓冲溶液来制备去端肽胶原分散液。

可以通过每100ml缓冲溶液添加0.5g至5.5g、1g至4.5g或2g至3.5g 的去端肽胶原来制备去端肽胶原分散液。

缓冲溶液可以处于0.3M NaOAc和45％HAC的条件下。

添加至缓冲溶液的去端肽胶原可以是冻干的去端肽胶原。

将其中分散有寡核苷酸变体的分散液与去端肽胶原分散液混合的步骤可以包括每400μL的去端肽胶原分散液混合0.1mg至3mg的其中分散有寡核苷酸变体的分散液。

例如，可以以每400μL的去端肽胶原分散液0.1mg至3mg、0.5mg至2.5mg 或1mg至2mg的量混合其中分散有寡核苷酸变体的分散液。

在下文中，将详细描述实施例以具体描述本发明。然而，以下实施例仅仅是为了说明本发明，并且本发明的内容不受实施例限制。

实施例1，寡核苷酸变体的制备

实施例1-1.含吉西他滨的寡核苷酸的合成

设计并制备了28种类型的寡核苷酸。此外，将吉西他滨与所制备的寡核苷酸中的每一种结合以产生寡核苷酸变体。所设计的28种类型的寡核苷酸序列和 28种类型的寡核苷酸变体(其中将修饰核酸与寡核苷酸结合)在下表3中列出。在下面的描述中，吉西他滨也可以称为Gem。

[表3]

使用Mermade 12 DNA合成仪(BioAutomation Manufacturing，Irging，TX) 通过固相亚磷酰胺化学合成“含吉西他滨的寡核苷酸”(寡核苷酸变体)。

使用Biotage MPLC，C18 Cartridge进行脱盐。将化合物溶解于D.W.中之后，在Xbridge Oligonucleotide BEH C18 130A，1.7μm，2.1x50mm柱的条件下，在50℃柱温箱温度、流动相A溶剂(0.1M TEAA)、B溶剂(100ACN)下使用 Waters Acquity UPLC H-Class以0.3mL/min的流速对溶液进行分离和纯化。通过Waters G2-XS Q-TOF质谱仪确认分子量。根据内部方案进行所有寡核苷酸的合成。

1-2.不同类型的寡核苷酸变体的合成

根据以上1-1中所述的相同程序，合成((N)_x-[TGG]₄[TTG][TGG]_4或5)、 (([TGG]₄[TTG][TGG]_4或5-(N)_x)和((N)_x-[TGG]₄[TTG][TGG]_4或5-(N)_y)(参见下表4)。

[表4]

实施例2.寡核苷酸变体的体外稳定性的确认

吉西他滨(2,2’-二氟脱氧胞苷，dFdC)被血浆中的胞苷脱氨酶转化为非活性代谢物，即2,2’-二氟脱氧尿苷(dFdU)，并且在这种情况下，降低了体内抗癌功效。为了确认在将吉西他滨结合至寡核苷酸时胞苷脱氨酶对体内吉西他滨的降解抑制作用，测定血浆中dFdC和dFdU的浓度。

2-1.用于确定dFdC和dFdU的血浆浓度的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析

通过修改液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定以便确认小鼠血浆中作为吉西他滨的活性代谢产物的三磷酸吉西他滨(dFdCTP)以及dFdC、dFdU的浓度，建立了小鼠血浆和组织测定。从通过建立的LC-MS/MS测定方法获得的色谱图中，估算dFdC、dFdU和dFdCTP与内标物质的峰面积的峰面积比，之后根据先前创建的校准曲线计算小鼠血浆中的浓度和组织中的浓度。

2-1-1.四氢尿苷(THU)处理的血液的制备

收集1mL小鼠血液，并将其置于含有10μL(在DW中)10mg/mL四氢尿苷(THU)的1.5mLeppendorf管中。使用离心机在14,000rpm和4℃的条件下离心2分钟之后，仅取出血浆并且将其转移至另一个小瓶并储存在-80℃下。将 50μL血浆转移至1.5mL琥珀色eppendorf管中之后，添加150μL内标物质(在 ACN中1.29μg/mL的熔体)并涡旋10分钟。使用离心机在14,000rpm和4℃的条件下进行离心20分钟。将150μL样品从离心管转移至另一个1.5mL琥珀色eppendorf管中。使用GeneVac EZ-2自动蒸发系统(GeneVac Ltd.，Ipswich， UK)干燥有机溶剂。(GeneVac HPLC模式，最高温度35℃，1小时)。通过将125μL DW添加至1.5mL干燥的琥珀色eppendorf管来重构有机溶剂。涡旋5 分钟之后，使用离心机在14,000rpm和4℃的条件下进行离心5分钟。使用PTFE (亲水性)0.2μm注射器过滤器(Toyo Toshi，Japan)，将离心溶液的上清液以 100μL的量添加至用于LC-MS/MS的每个小瓶。具体地，将5μL上清液注射至每个LC-MS/MS中。

2-1-2.LC-MS/MS分析条件

对于质谱，使用AB SCIEX QTRAP 5500电喷雾离子模式(Sciex，Framingham， MA，USA)。定量条件列出在下表5中。

[表5]

使用Agilent 1200系列分离模块(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)进行色谱。此外，使用了Hypersil gold C18，1.9μm，100x2.1mm²柱 (ThermoScientific，Matriks，Oslo，Norway)。注入体积为5μL，流动相为梯度洗脱液系统[A：100％ACN，B：在DW中的0.1％甲酸]，并且总运行时间为20 分钟。将校准范围设置为20ng/mL至5,000ng/mL。色谱条件列于下表6中。

[表6]

图1示出了dFdC校准曲线和dFdU校准曲线。在图1(a)中，x是吉西他滨浓度，并且y是HPLC中的面积。此外，在图1(b)中，x是dFdU浓度，并且y是 HPLC中的面积。

2-1-3.LC-MS/MS分析结果

根据以上2-1-1和2-1-2处理每个样品，并且关于(Gem)_x-[TGG]_m[TTG][TGG]_n的化合物类型测量大鼠血浆中的dFdC/dFdU比率。测量结果列于下表7中(Gem ＝吉西他滨)。

[表7]

选择若干种具有高dFdC/dFdU比率的化合物(化合物10，在下文中也称为 IO101；以及化合物11，在下文中也称为IO101L)，随后进行额外实验以确定寡核苷酸变体的作用。此外，为了比较IO101和IO101L与其他寡核苷酸变体的作用，使用诸如以下的不同序列的寡核苷酸变体以及未结合至寡核苷酸的吉西他滨进行实验：[(Gem)₂-[TCC]₄[TTG][TCC]₄；IO101-Con(CRO)， (Gem)₂-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTGG；IO100和 (Gem)₂-CCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCCTCC；IO100-Con((Gem)₂-CRO))。

实施例3.寡核苷酸变体针对癌细胞系的体外功效的评估

3-1.IO101对胰腺癌细胞系的抗癌功效的确认

将BxPC3、PANC-1、Miapaca-2和Capan-1分别作为胰腺癌细胞系进行培养。当在若干次继代培养之后细胞稳定时，将1x10³个细胞接种在96孔板中以验证药物作用。第二天，将最高浓度为100μM的IO101、IO100、IO100-Con、IO101-Con 和Gem每孔按1/10稀释，并以4点浓度最高100nM制备。然后，使用以上制备的变体处理接种在96孔板中的细胞。48小时之后，将10μl WST-1溶液添加至孔，并在37℃培养箱中孵育1小时。随后，在微板读取器(VERSAMax)中在440nm下测量每个样品。计算测量值之后，绘制针对每种处理浓度的细胞存活率图。

在所有四种胰腺癌细胞系中，与IO100、IO100-Con、IO101-Con和Gem相比，观察到(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₄(IO101)以药物浓度成比例地有效抑制胰腺癌细胞生长(参见图2)。

在分别以1x10⁴个细胞/孔接种4种类型的胰腺癌细胞系，然后用IO101处理所述胰腺癌细胞系之后，用红色探针标记经处理的细胞系并在48小时内成像以观察癌细胞的细胞凋亡。图3至图6示出了根据IO101处理的4种类型的胰腺癌细胞的细胞凋亡的确认结果。强度值是死亡细胞指数，并指示为倍数变化。

3-2.IO101L对胰腺癌细胞系的抗癌作用的确认

以如上述3-1中的功效评估相同的方式，通过细胞活力测定验证 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅(IO101L)对胰腺癌细胞系的功效。结果，在所有四种胰腺癌细胞系中，与对照相比，胰腺癌细胞生长被IO101L有效地抑制(参见图7)。

实施例4.寡核苷酸变体的体内稳定性的确认

将吉西他滨(8mg/kg)静脉内注射在大鼠中，或者静脉内注射作为通过将吉西他滨与寡核苷酸结合制备的新药剂的(Gem)_x-[TGG]_m[TTG][TGG]_n(160 mg/kg，其相当于基于吉西他滨的8mg/kg)，从而比较吉西他滨与其代谢产物(即 2’,2-二氟脱氧尿苷(dFdU)花青素-3-葡萄糖苷)之间的药代动力学变化。

4-1.寡核苷酸变体或吉西他滨在大鼠中的静脉内注射

将Sprague-Dawley雄性大鼠用作为吸入麻醉剂的异氟烷进行诱导麻醉，然后将聚乙烯(PE)管(Clay Adams，Becton Dickinson，NJ，USA)插入颈动脉中 (用于血液收集)并用缝合线缝合，之后将缝合线的端部固定在颈部的后面。在手术期间，使用乙醚维持麻醉，并注射约0.5mL含肝素(20单位/mL)的生理盐水，以防止血液在插管中凝结。手术结束之后，将大鼠置于代谢笼中，并且使其分别从麻醉状态完全恢复(4至5小时)。此后，将动物分成(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组(N＝4)和吉西他滨施用组(N＝4)，并向这些组施用相应的药物。在电子天平(CP224S，Sartorius，GER)上将吉西他滨和(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅称重至一定剂量(8mg/kg和160mg/kg)之后，将每种药物在0.9％无菌生理盐水中溶解并制备。静脉内施用1ml/kg和2ml/kg 的药物。在临施用(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅和吉西他滨之前(0min)和在施用后1、5、15、30、45、60、120、360和720分钟之后，各自通过颈静脉收集0.3mL血液。此外，为了防止血液中的吉西他滨被胞苷脱氨酶代谢，将收集的血液放入先前放置有10μL蒸馏水的eppendorf管中，其中蒸馏水含有以每1mL 血液10mg/mL的浓度溶解的作为胞苷脱氨酶抑制剂的四氢尿苷(THU)。然后，立即离心eppendorf管中的血液，之后将血浆储存。由于已知吉西他滨可被光降解，因此将所有血浆样品以每管50μL置于棕色eppendorf管中，并储存在-80℃下，直到进行LC-MS/MS分析。

4-2.吉西他滨及其代谢物dFdU的血浆浓度的分析

在使用预先建立的乙腈血浆通过血浆蛋白沉淀进行预处理之后，使用Agilent1200系列分析仪(Agilent Technologies)在AB SCIEX QTRAP 5500电喷雾离子模式(Sciex，Framingham，MA，USA)中通过LC-MS/MS进行样品处理以及对吉西他滨和dFdU的血浆浓度的分析。所有分析程序均在屏蔽管的条件下实施。即，所有程序均在以下条件下进行：定量条件：SRM(选定的反应监测) 模式(参见上表5)；固定相条件：Hypersil gold C18，1.9μm，100x2.1mm²(Thermo Scientific，Matriks，Oslo，Norway)；以及流动相条件：含有0.1％甲酸的蒸馏水 (A)和乙腈(B)(参见上表6)。

4-3.创建血浆校准曲线

将吉西他滨和dFdU分别溶解于蒸馏水中以制备1mg/mL的储存溶液，冷冻储存并用三级蒸馏水稀释以制备具有200、400、800、2000、10000、20000和 100000ng/mL的吉西他滨浓度以及具有200、400、800、2000、10000、20000 和50000ng/mL的dFdU浓度的工作溶液，之后储存在冷藏器中。将二甲双胍作为内标物质(IS)溶解于乙腈中以制备645ng/mL的另一种工作溶液。将吉西他滨和dFdU工作溶液分别添加至大鼠的空血浆，并且制备标准血浆样品以使得吉西他滨和dFdU的血浆浓度分别为10、20、40、100、500、1000和5000ng/mL，以及10、20、40、100、500、1000和2500ng/mL。

4-4.血浆样品的处理方法

将150μL内标物(即二甲双胍)添加至50μL血浆(在乙腈中为645ng/mL) 并涡旋10分钟，之后在15,000rpm和-4℃下进行离心20分钟。此后，取150μL 上清液并转移至另一个eppendorf管，然后将有机溶剂在氮气流下干燥。然后，将125μL三级蒸馏水添加至干燥的eppendorf管，使其重新溶解。然后，将溶液涡旋5分钟，在15,000rpm和-4℃下离心5分钟。此后，将100μL上清液转移至用于LC-MS/MS的小瓶，注射5μL上清液并通过LC-MS/MS进行分析。

4-5.分析适用性的确定

为了确定分析过程的适用性，在样品处理期间针对每批分析样品分析用于创建校准曲线的样品，然后对用于分析适用性样品进行两次分析(对于吉西他滨，最低定量限：LLoQ，10ng/mL，低浓度：LoQC，30ng/mL，中浓度：MiQC， 900ng/mL，高浓度：HiQC，4000ng/mL；对于dFdU，最低定量限：LLoQ，10 ng/mL，低浓度：LoQC，30ng/mL，中浓度：MiQC，900ng/mL，高浓度：HiQC， 2000ng/mL)。6个合适样品中有至少67％(例如：6个样品中有4个)应在理论值的±15％内，并研究了相同浓度下50％或更多是否在理论值的±15％内。

4-6.药代动力学参数计算和统计处理

吉西他滨的药代动力学参数通过Winnonlin Professional程序(Pharsight，Mountain View，CA，USA)获得。血浆浓度-时间曲线(AUC_t)下的面积值，由在施用药物之后到最终定量时间的血浆浓度-时间曲线使用对数-线性梯形方程计算(具体地，在血浆浓度增加的部分中使用线性-梯形方程，而在血浆浓度减少的另一部分中，通过对浓度值进行对数变换来使用梯形方程)。在口服施用之后，根据血浆浓度-时间曲线确定最高血浆浓度(C_max)和达到最高血浆浓度的时间(T_max)。使用以下方程确定直至无限时间-时间曲线的血浆浓度下的面积值(AUC_inf)。根据血浆浓度的消除的斜率确定终末消除速率常数(γZ)和半衰期(t_1/2)。

AU_inf＝AUC_t+C_t/γZ(C_t：最终定量浓度，γZ：终末消除速率常数)

为了比较两组之间的药代动力学参数，使用SPSS(第19版，Chicago，IL， USA)进行独立的样本t检验。

4-7.吉西他滨与dFdU之间的体内药代动力学特性的比较

关于吉西他滨(8mg/kg)或(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅(160mg/kg，其相当于基于吉西他滨的8mg/kg)的静脉内注射，吉西他滨的血浆浓度示于图8中，而dFdU浓度的血浆浓度示于图9中。此外，在吉西他滨或 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅的静脉内注射中，吉西他滨和dFdU的药代动力学参数值作为平均值±标准偏差列于表8中。在下表8中，AUC_t是从0min至最后一次血液收集时间的曲线下面积，t_1/2是终末半衰期(血浆消除半衰期)，CL是全身清除率，Vd_ss是体内的分布体积，并且MRT是药物在体内的平均停留时间， T_max是中位数(范围)，并且代谢转化率值是通过用dFdU AUC_t值除以吉西他滨AUC_t值而计算出的值。

[表8]

实验的结果是，吉西他滨施用组在施用后立即达到最高血浆浓度，如静脉内注射药物后的一般药代动力学模式一样。然而，(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组在静脉内注射后5至30分钟达到了C_max。静脉内注射 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅之后的血浆吉西他滨浓度是指通过体内的核酸降解酶(“核酸酶”)从寡核苷酸，即[TGG]₄[TTG][TGG]₅释放的吉西他滨的浓度。初步实验的结果是，确认了在血浆样品处理(有机溶剂诸如乙腈或甲醇)的过程中，(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅不会以吉西他滨的形式释放。此外，由于吉西他滨是血浆蛋白结合率非常低的药物，因此在大鼠中静脉内注射 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅之后在血浆中测量的吉西他滨浓度指示通过体内核酸酶产生的吉西他滨游离浓度。(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组直至120分钟显示出比吉西他滨施用组显著低的吉西他滨血浆浓度。然而，在120分钟之后(360分钟、720分钟)，(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组显示出比吉西他滨施用组高的吉西他滨浓度(参见图8)。这意味着[TGG]₄[TTG][TGG]₅通过体内的核酸酶代谢为吉西他滨，而吉西他滨又缓慢释放至血浆中。结果， (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组中的吉西他滨的血浆消除半衰期(t_1/2)在统计学上显著增加了约两倍(177±28.5分钟相比于360±54.8分钟；参见上表8)。此外，可以理解的是，(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组中吉西他滨的Vd_ss(体内分布体积)(其指示药物与体内组织之间的亲和力)显著增加了多于两倍。 (1150±223mL/kg相比于2670±139mL/kg；参见上表7)。即，可以预测， (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组的吉西他滨在体内组织中具有更高分布，从而比吉西他滨施用组大得多地分布至组织中。在两组中，吉西他滨的AUC_t和 AUC_inf值是相似的并且未显示出统计学显著性。在(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组的情况下，直到施用后360分钟，检测到作为吉西他滨的无活性代谢物的dFdU的血浆浓度都低于吉西他滨施用组(参见图9)。由于结合至[TGG]₄[TTG][TGG]₅的吉西他滨未被代谢为dFdU，因此血浆中测量的dFdU浓度意指在静脉内注射(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅之后，当吉西他滨从 [TGG]₄[TTG][TGG]₅释放时通过血浆中胞苷脱氨酶产生的dFdU的浓度。360分钟之后，(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]5施用组显示出较高的dFdU血浆浓度，然而由于相对较短的采样时间限制而无法进一步确认。(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅施用组中dFdU的C_max值显示出降低的趋势(364±52.3ng/mL相比于477±87.9ng/mL)，但在两组之间未显示出统计学显著性(参见上表8)。为了比较两组中通过胞苷脱氨酶产生的dFdU的比率，通过将dFdU AUC_t值除以吉西他滨AUC_t值来计算出代谢转化率。从结果来看，两组显示出相似的值(0.190±0.019相比于0.181±0.0124)，没有统计学显著性。据预测，在(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅的情况下，结合至[TGG]₄[TTG][TGG]₅的吉西他滨缓慢释放至血浆中并大量分布至组织，但释放的吉西他滨不会影响通过血浆和组织中存在的胞苷脱氨酶产生的dFdU。

下表9示出了在施用吉西他滨和(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅之后吉西他滨随时间的血药浓度。

[表9]

下表10示出了在施用吉西他滨和(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅之后dFdU随时间的血药浓度。BLLoQ意指低于最小定量限的值，并且ND意指未检测到的值。

[表10]

实施例5.医用去端肽胶原的制备

5-1.猪皮制备步骤

将猪皮用自来水洗涤三次，用初级纯净水洗涤三次，分成3kg(20cm x 20 cm)，并储存在-20℃的冷冻器中。将冷冻的猪皮在4℃下静置2小时，解冻并精细切割成1.5cm x8cm的大小。此后，将7.5L 0.5M醋酸添加至猪皮，之后放置过夜并观察猪皮的溶胀。

5-2.脂肪去除步骤

取出溶胀的猪皮，切割成1.5cm x 1.5cm的大小，并再次添加7.5L 0.5M新鲜醋酸。然后，静置数小时后，仅将真皮通过筛过滤。将真皮用10L纯净水洗涤。将洗涤过程总共重复五次。在向洗涤过的真皮中添加20L乙醇之后，将混合物在4℃下搅拌过夜。在仅从过夜搅拌的样品中回收真皮之后，添加20L乙醇，之后在4℃下再次搅拌1小时。将真皮使用筛过滤并静置约1小时以去除乙醇。将已经去除脂肪的真皮细分成具有适当重量(500g)的部分，并储存在-80℃的低温冷冻器中。

5-3.真皮均化和研磨

将7.5L 0.5M醋酸添加至通过在4℃下放置而解冻的3kg冷冻真皮，然后静置30分钟。通过使用筛过滤去除醋酸之后，将真皮细分为250g部分。将250g 真皮和2L纯净水置入混合机中，之后研磨2分钟。然后，进一步添加2L纯净水，之后再次研磨2分钟。将4L 0.73M醋酸添加至研磨的组织。再次使用均化器将组织研磨3分钟。将研磨过程重复四次以研磨并共混1kg冷冻真皮。此外，向其中添加18L 0.73M醋酸，从而将最终醋酸浓度调节至0.5M。随后，确认了pH为约2.5至4。使用搅拌器将混合物低速搅拌3小时。

5-4.胃蛋白酶处理

将每kg真皮15×10⁷单位的胃蛋白酶添加至完成的真皮样品，之后使用搅拌器轻轻搅拌24小时。向胃蛋白酶处理的样品中添加10M NaOH并搅拌以达到 pH 8至9，并且进一步搅拌10分钟以使胃蛋白酶失活。通过碱处理使胃蛋白酶失活之后，添加4M HCl并搅拌以达到pH 3.4，之后进一步搅拌10分钟。使用离心机在7800rpm和4℃下将样品离心10分钟之后，去除上清液表面的脂肪，并且收集并储存剩余的上清液。

5-5.去端肽胶原中间体的盐析和产生

将5M NaCl以163ml的速率缓慢添加至1L的由真皮制备的上清液中，搅拌15分钟，然后使其在4℃下静置过夜以进行盐析。盐析之后，通过抽吸去除上清液，并将沉淀物离心(7800rpm，4℃，10分钟)以完全去除上清液。向沉淀物中添加30L乙醇，并且在4℃的条件下搅拌过夜的同时将混合物洗涤。离心(7800rpm，4℃，10分钟)之后，再次向沉淀物中添加30L乙醇，之后在4℃下搅拌6小时以进行第二次洗涤。离心(7800rpm，4℃，10分钟)之后，测量沉淀的去端肽胶原中间体的重量，并且将其细分并储存在-80℃的低温冷冻器中。

5-6.医用去端肽胶原的产生

在将2.8L 0.02M尿素添加至200g去端肽胶原中间体之后，将混合物搅拌过夜。使用Centramate(切向流过滤系统)进行去端肽胶原的渗滤，并在搅拌器中将回收的溶液搅拌的同时添加0.5M NaOH以达到pH 7。将所制备的中性去端肽胶原薄薄地且平坦地细分，之后将每个细分部分放入拉链袋中，并且将其储存在-80℃的低温冷冻器中。在冻干器中进行初步冷冻(-40℃)至少1小时之后，将储存在低温冷冻器中的去端肽胶原移至冻干器中并冻干。将冻干的医用去端肽胶原切割成合适的大小并真空包装，之后冷藏。

5-7.通过用缓冲溶液替代而具有鉴定的pH中性的去端肽胶原溶液的制备

5-7-1.将冻干的去端肽胶原溶解于醋酸钠缓冲溶液(0.3M醋酸钠(NaOAC)， 45％醋酸)中的步骤

为了制备0.3M NaOAC，45％醋酸缓冲溶液，将2.4g CH3CO2Na溶解于55 ml三级无菌水和45ml具有99％或更高纯度的醋酸溶液中。然后，使用pH计用醋酸滴定溶液以达到pH3.0。使用无菌镊子和剪刀将3g冻干的去端肽胶原精细切割，并将精细切割的片溶解于0.3MNaOAC，45％醋酸溶液中。具体地，将精细切割的去端肽胶原缓慢添加以便完全溶解，同时通过搅拌棒将其与溶液混合。

5-7-2.使用切向流过滤器(TFF)系统的渗析过滤和用PBS对去端肽胶原溶液的替代

如图所示，使用泵将3％去端肽胶原溶液泵送进入所制备的TFF系统(通过 TFF100K)，并且将过滤的醋酸钠缓冲溶液转移至废料而丢弃，同时将剩余的溶液通过渗余物管返回至储存容器。将1 x PBS缓冲溶液添加至储存容器以将 3.0％去端肽胶原溶液保持在预定水平，同时继续进行渗析过滤。具体地，使用体积相当于最初制备的去端肽胶原-醋酸钠缓冲溶液的10倍的PBS溶液继续进行渗析过滤，从而进行缓冲液交换。当缓冲液交换完成时，通过监测渗透溶液的pH以确定是否检测到中性pH来确认缓冲液交换的完成。在渗析和过滤之后，将3％去端肽胶原按10ml等分到灭菌管中，并储存在4℃的冷藏器中。

实施例6.寡核苷酸变体/去端肽胶原组合物的产生

6-1.去端肽胶原(AC)分散液的制备

分别将0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和3.0％的高纯度医用去端肽胶原(每100ml 缓冲液分别为0.5g、1.0g、1.5g、2.0g和3.0g去端肽胶原)置于NaOAc/HAc 溶液(0.3M醋酸钠，45％醋酸)中，保持在pH3.0下并在搅拌的同时完全溶解。使用切向流过滤(TFF)对该溶液进行渗析过滤，然后用10倍体积的1 x PBS 溶液对去端肽胶原溶液进行渗滤，从而制备在PBS溶液中的医用胶原蛋白分散液。

6-2.IO101/去端肽胶原溶胶-凝胶型和IO101L/去端肽胶原溶胶-凝胶型的产生

在将(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₄(IO101)或(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅ (IO101L)置于PBS中并且通过混合器在室温下将其完全溶解之后，以下述量向所述去端肽胶原分散液中添加将IO101或IO101L混合在PBS中的溶液：每 400μl去端肽胶原分散液0.5mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、4.0mg或8.0mg(分别地0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、3.0％)。

通过回旋套装置在室温下将以上溶液混合30分钟以制备混合物。呈液态的(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₄(IO101)/AC(溶胶-凝胶型)或 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅(IO101L)/AC(溶胶-凝胶型)当直接注射至体内肿瘤中时可以在37℃下固化(凝胶化)。此外，因为围绕 (Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₄(IO101)或(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅(IO101L)的去端肽胶原缓慢溶解，所以药物逐渐释放，因此能够实现有效的肿瘤治疗。

6-3.IO101/去端肽胶原圆片和IO101L/去端肽胶原圆片的产生

以与溶胶-凝胶型制造方法相同的方式使用以上制备的高浓度胶原分散液和(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₄(IO101)或(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅(IO101L) 制备混合物。

将所制备的混合物置于直径为1cm的圆柱形硅树脂模具中并扩散以形成0.5 mm的均匀膜，之后在-80℃下冻干。将完全冻干的样品在保持在-70℃的冻干器中再次冻干30小时以形成多孔薄膜。在下文中，将如上所述制备的薄膜表示为圆片或贴剂。

实施例7.寡核苷酸变体/去端肽胶原组合物在血浆中的稳定性的评估

对大鼠血浆中的吉西他滨和(Gem)_x-[TGG]_m[TTG][TGG]_n以及从高纯度去端肽胶原制剂中释放的吉西他滨和吉西他滨无活性代谢物(即dFdU)进行浓度分析。样品处理、校准曲线创建和LC-MS/MS分析条件与上述相同。

7-1.大鼠血浆中(IO101L)/去端肽胶原圆片稳定性的评估

为了评估吉西他滨/去端肽胶原圆片在血浆中的稳定性，用如下表12中列出那样分类的5个组进行实验。

将2组、3组、4组和5组的吉西他滨/去端肽胶原圆片添加至2mL大鼠血浆，以达到60μg/ml的血浆浓度，之后在CO₂培养箱中在37℃下孵育2小时。样品处理如下进行。2小时后，为了去除血浆中附着于吉西他滨/去端肽胶原圆片上的胶原，将500μL含有吉西他滨的血浆添加至Ultracell-3K，之后在15,000rpm 和20℃下进行离心30分钟。此后，取上清液然后在与以上相同的条件下再次离心。然后，取5μL浓缩液，并使用相同的大鼠血浆稀释10倍，以测量血浆中浓度(“血浆浓度”)。测量了在Ultracell-3K的上部部分中浓缩的吉西他滨的浓度，以及在下部部分过滤的血浆中吉西他滨的另一种浓度。此外，还测量在孵育2 小时之后从圆片中洗脱出的吉西他滨的浓度。以与校准曲线创建相同的方式进行以上样品处理，之后在相同的LC-MS/MS条件下进行样品分析。

分析大鼠血浆中的吉西他滨(dFdC)及其代谢物(即dFdU)的结果，最小定量限为10ng/mL。此外，由于发生串扰现象，吉西他滨(dFdC)的保留时间与dFdU不同，其中产生了dFdU峰，因此在吉西他滨(dFdC)分析中，在给予流动相梯度的同时进行测量以防止每个峰受到影响。因此，吉西他滨和dFdU的保留时间分别测量为2.1分钟和4.23分钟。分析标准血浆样品的结果是，所有样品均确定为具有在±15％内的准确度，使得如上确定的样品浓度是可靠的(参见下表11)。

[表11]

7-2.(IO101L)/去端肽胶原圆片的体内稳定性的评估

为了评价IO101L/去端肽胶原圆片制剂在大鼠血浆中的稳定性，用5个组(1-5 组)(参见下表12)进行实验。将正常胶原(SK Co.)用于与去端肽胶原进行比较。

[表12]

在CO₂培养箱中孵育2小时的结果是，2组和3组吉西他滨/去端肽胶原圆片中吉西他滨的浓度低于储备状态下的1组。作为(Gem)₂-[TGG]₄[TTG][TGG]₅/去端肽胶原圆片制剂的4组和5组被确定为具有低于仅含有胶原的2组和3组的浓度。初步实验的结果是，可以看出，IO101L/去端肽胶原圆片制剂在大鼠血浆中的释放速率是稳定且持续的。此外，与去端肽胶原结合的制剂显示，吉西他滨向作为吉西他滨的非活性代谢物的2’,2’-二氟脱氧尿苷的代谢速率相当低(参见下表13)。

[表13]

实施例8.寡核苷酸变体/去端肽胶原组合物的抗癌功效的评估

8-1.使用皮下胰腺癌症动物模型的IO101/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)的抗癌功效

使用植入有胰腺癌细胞系的皮下胰腺癌症动物模型验证IO101/去端肽胶原 (溶胶-凝胶型)的胰腺癌症治疗作用。

8-1-1.针对IO101含量的抗癌功效的评价

确认了，就胰腺癌症抑制功效而言，IO101/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)优于吉西他滨/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)。为了应对不同的临床情况，使用了用于局部注射治疗的溶胶型药物。注射之后，通过确定肿瘤大小的变化和组织化学变化来验证治疗作用。

换句话说，在推荐的培养基(RPMI，10％FBX，1％AA)中培养胰腺癌细胞系Capan-1细胞之后，将1x10⁶个细胞皮下注射至裸小鼠中。用卡尺测量肿瘤大小，并且选择具有达到0.5cm直径的肿瘤大小的小鼠作为治疗目标。对于统计分析，从每组5只或更多只的小鼠评价医学功效。将IO101/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)直接注射到肿瘤中后，测量肿瘤大小以确定治疗作用。在治疗的30 天结束时，处死动物并移出肿瘤以确定治疗作用。

通过分别将0.5mg、1.0mg、1.5mg和2.0mg的IO101分散液与去端肽胶原分散液(每400μL去端肽胶原分散液)混合，将具有不同剂量(IO101-0.5mg/AC、 IO101-1.0mg/AC、IO101-1.5mg/AC和IO101-2.0mg/AC)的IO101/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)皮下注射至患有胰腺癌症的小鼠中，之后30天后提取肿瘤然后比较大小。确认了，在IO101-2 mg/AC(溶胶-凝胶型)下肿瘤被最好地抑制(参见图10和图11)。

8-1-2.针对去端肽胶原浓度的抗癌功效的评估

在皮下注射IO101/去端肽胶原(溶胶-凝胶型)之后，评价动物的体重减轻和毒性，而将IO101的剂量设置为2mg/400μL去端肽胶原分散液。由于药物的持续时间及其治疗作用可能会根据去端肽胶原(AC)的浓度而变化，因此分别关于浓度为0.5％、1.0％和1.5％(每100ml缓冲液的g数量)的去端肽胶原进行比较实验。确认了，当使用1.5％浓度(每100ml缓冲液的g数量)的去端肽胶原时，在患有皮下胰腺癌症的小鼠中治疗作用最高(参见图12)。

8-2.在皮下胰腺癌细胞系移植动物中IO101/去端肽胶原(圆片)的体内抗癌功效

将胰腺癌细胞系BXPC3以2x10⁶个细胞皮下移植在BALB/C裸小鼠中。三天后，每组将3个圆片植入在肿瘤上。移植后，使用2x0.5(长轴x短轴)的卡尺每周两次测量小鼠的肿瘤体积，持续30天，并每周两次测量体重。可以看出，IO101/AC圆片比其他组更好地抑制了胰腺癌症。在圆片植入之后，在POD30 小鼠图像中观察肿瘤大小。可以在视觉上确认，IO101/AC圆片的肿瘤体积小于其他组。实际上，发现IO101/AC圆片的肿瘤体积相当小，且尤其是IO101-2 mg/1.5％至3.0％AC组具有最小的肿瘤体积(参见图13和图14)。

8-3.在原位异种移植胰腺癌症小鼠模型中IO101/去端肽胶原(圆片)的胰腺癌症 治疗功效

将通过替代特定载体而表达萤光素酶的5x10⁵个BxPC3癌细胞系以及生理盐水注射至Balb/c-裸小鼠的胰腺(雄性，6周龄，30只动物)中。在构建胰腺癌症小鼠模型的第2周，进行萤光素酶成像以确认肿瘤。为了减少自发荧光，在成像前1周提供无荧光饲料。腹膜内插入(使用手术进行腹腔内插入) IO101/AC圆片和比较药物。构建模型之后，立即通过体内IVIS光谱仪器进行萤光素酶成像以测量肿瘤和肿瘤大小。使用IVIS光谱仪器，按时间(第6、18、 21、23、25、28、31和35天)进行萤光素酶成像。在最后一次体内IVIS光谱成像之后，处死动物以对每个器官(包括肿瘤的脾脏、肝脏、心脏、肺、肾脏和胰腺)进行离体测量。测量所提取的肿瘤的大小，并通过卡尺进行比较。在将圆片药物插入实验动物中之后，立即通过萤光素酶成像随时间监测肿瘤大小的变化。此外，如下所述使用IVIS光谱确定萤光素酶成像的变化(参见图15)。在处死实验动物之后，离体测量肿瘤的实际大小。下表14列举了所提取肿瘤的实际大小变化，其以图表方式示出在图16中。

[表14]

此外，关于仅植入有AC圆片的组，确认了，肿瘤具有比其他组大的大小，并且大多数进展为腹膜内转移性癌症。肝脏、脾脏和肾脏显示出最多的转移，并且确认了肿瘤扩散遍及腹腔中的所有器官。即使在植入有Gem/AC圆片的组中，与AC圆片组相比，肿瘤大小没有显著差异，并且确认了腹膜内转移。在 IO101/AC圆片中，肿瘤大小的增加受到抑制，而观察到Gem/AC圆片和AC圆片植入物大部分转移至腹膜内肝脏和隔膜。然而，IO101/AC圆片未显示出腹膜内癌症转移(参见图17)。

8-4.在原位异种移植胰腺癌症小鼠模型中IO101/去端肽胶原(圆片)和IO101L/去 端肽胶原(圆片)的胰腺癌症转移抑制功效

将通过替代特定载体而表达萤光素酶的5x10⁵个BxPC3癌细胞系以及生理盐水注射至Balb/c-裸小鼠的胰腺(雄性，6周龄，30只动物)中。在构建胰腺癌症小鼠模型的第2周，进行萤光素酶成像以确认肿瘤。为了减少自发荧光，在成像前1周提供无荧光饲料。腹膜内插入(使用手术进行腹腔内插入) IO101/AC圆片或IO101L/AC圆片和比较药物。构建模型之后，立即通过体内 IVIS光谱仪器进行萤光素酶成像以测量肿瘤和肿瘤大小。使用IVIS光谱仪器，按时间(第6、18、21、23、25、28、31和35天)进行萤光素酶成像。在最后一次体内IVIS光谱成像之后，处死动物以对每个器官(包括肿瘤的脾脏、肝脏、心脏、肺、肾脏和胰腺)进行离体测量。观察器官是否有腹膜内转移。具体地，观察到AC圆片主要转移至腹腔内的肝脏、肾脏和/或隔膜。然而，在IO101/AC 圆片和IO101L/AC圆片中未观察到腹膜内癌症转移(参见图18)。

8-5.在植入IO101L/去端肽胶原(圆片)之后存活率的变化

在胰腺癌症的原位小鼠模型中，比较IO101L/AC圆片植入之后按浓度的存活率。在移植单独AC圆片之后，在32天后，5只动物中有2只存活。此外，在 IO101L-2mg(每400μL去端肽胶原分散液与IO101L 2mg混合)/AC圆片植入的情况下，5只动物中有4只存活到32天。此外，在IO101L-4mg(每400μL 去端肽胶原分散液混合IO101L 4mg)/AC圆片和IO101L-8mg(每400μL去端肽胶原分散液混合IO101L 8mg)/AC圆片的情况下，所有5只动物在第6天死亡(参见图19)。

8-6.在原位异种移植胰腺癌症小鼠模型中去除残留肿瘤之后IO101L/去端肽胶原 (溶胶-凝胶型)和IO101L/去端肽胶原(圆片)的肿瘤抑制作用和转移抑制作用

8-6-1.BxPC3胰腺癌症移植小鼠实验

在原位胰腺癌症小鼠中通过手术操作去除肿瘤之后，插入IO101L/AC溶胶- 凝胶型或IO101L/AC圆片药物，之后进行观察以确认是否抑制了残留的肿瘤以及是否抑制了残留的肿瘤至腹腔中其他器官的转移。具体地，在Balb/c裸小鼠 (雄性，6周大，21只动物)中制备通过替代特定载体而表达萤光素酶的5x10⁵个BxPC3癌细胞系(25μL)。通过切割腹膜内麻醉小鼠的腹部区域取出胰腺，之后将BxPC-3-Luc细胞注射至所制备的胰腺中。在构建胰腺癌症小鼠模型的第 2周，进行萤光素酶成像以确认肿瘤。这里使用的肿瘤细胞系是通过在BxPC3 细胞中替代特定载体而表达萤光素酶的BxPC-3-Luc细胞，并且使用萤光素来测量肿瘤。为了减少自发荧光，在成像前1周提供无荧光饲料。通过切开腹膜内麻醉小鼠的腹部区域去除胰腺肿瘤之后，将IO101L/AC溶胶-凝胶型、IO101L/AC 圆片、Gem/去端肽胶原溶胶-凝胶或Gem/去端肽胶原圆片移植至剩余的肿瘤部位(使用手术进行腹腔内插入)。通过萤光素酶成像确认肿瘤大小和转移，并且其结果示于图20中。

8-6-2.Capan-1胰腺癌症移植小鼠实验

当提供订购用于产生胰腺癌症原位小鼠模型的小鼠时，保持1周的期限以适应环境。在适应期期间，以1×10⁶个细胞/100μl制备capan-1细胞。将小鼠皮肤打开2mm，将脾脏折起并用注射器将以上细胞直接注射至胰腺中。4周后，通过MRI确认了肿瘤的直径为5mm至6mm。当癌细胞直径确定为5mm至6 mm时，打开腹部，然后尽可能多地去除胰腺肿瘤。去除之后，将IO101L/AC 圆片和去端肽胶原圆片(对照)插入剩余的肿瘤部分并密封(参见图21)。

1个月后，通过MRI监测肿瘤大小。在拍摄所有图像之后，在手术室中使用 CO₂室对小鼠进行安乐死。在每个组中确认腹膜内肿瘤转移，并且获得每个肿瘤组织并用10％福尔马林固定。通过使用H&E和相应的抗体进行免疫染色来确认组织病理。在插入IO101L/AC圆片的情况下在腹腔中没有发生转移，而在去端肽胶原圆片(对照)中发现了至腹腔中的脾脏和肝脏的转移(参见图22)。此外，在去端肽胶原圆片(对照)的情况下，在1个月后观察到至腹腔中的肝脏、隔膜、肾脏等的转移(参见图23)。

8-7.在使用患者源性胰腺癌细胞的患者源性异种移植(PDX)胰腺癌症小鼠模型中 的抗癌功效

8-7-1.使用患者源性胰腺癌细胞对PDX胰腺癌症小鼠模型的构建

使用在进行腹腔镜胰腺羊膜切除术的65岁女性患者中切除的胰腺肿瘤成功地建立了PDX模型。病理检查揭示，胰腺的导管腺癌具有3.2cm的大小，并显示出频繁的淋巴浸润。在搜索的七个淋巴结中发现一个转移性淋巴结(AJCC第 8版T2N1M0，IIB)。当通过H&E和核仁(nucleoline)免疫染色比较PDX和初始原发性肿瘤的组织学特征时，在原发性肿瘤与PDX肿瘤之间发现总体组织学相似性(参见图24)。

将雄性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠，即NOD/Shi-scid、IL-2RγKO小鼠 (NOG)(Central Lab Animal Inc.，Saeronbio Inc.，Seoul)和雌性nu/nu 无胸腺小鼠(Orientbio)在无病原体的条件下维持在12小时光照/12小时黑暗循环中。在手术时，将保存在患者原发性肿瘤(机构检查委员会号4-2017-0594) 中的10个新的胰腺肿瘤标本置于冰冷却的RPMI培养基中，并且将PDTX Cleanbench Department Laboratory AnimalResources(Yonsei Biomedical Research Institute，Seoul)的PDX SOP用冷PBS洗涤，并且将非坏死片段切成小片(2× 2×2mm)以去除血液或脂质部分。然后，在皮氏培养皿上对以上片段进行基质胶包被之后，通过Precision Trochar 10量规(MP182，InnovativeResearch of America)将单片植入6周龄小鼠的右侧和左侧，之后用5-0缝合线(VCP490G，ETHICON)缝合。当生长的肿瘤大小达到1500mm时，然后将供体小鼠(F1) 肿瘤以及相同的肿瘤和其余的肿瘤以液氮储存在含有5％二甲硫醚/95％胎牛血清的冷冻小瓶中，进而将其植入同期群组小鼠(F2)中。从F1小鼠切下皮下生长的肿瘤(1500mm³)，并将其亚传代至下一代同期群组小鼠(F2)。在每个隔室中来自同一患者异种移植物的约150-200mm³肿瘤花费约50天才达到可触及肿瘤。在2名患者中使用了一对原发性肿瘤(F0)和F1(第1代)和F2(第2 代)样品。当肿瘤达到可触及大小(平均大小＝266.5±58.0mm³)时，将小鼠 (n＝8至13/n＝4/患者)随机分成以下五(5)个组：1组(未治疗对照)；2组，其中每4周一次向小鼠腹膜内施用悬浮于PBS中的吉西他滨(100μg)；3组，其中每4周一次向小鼠腹膜内施用悬浮于PBS中的IO101(100μg)；以及4、5 和6组，其植入了三种类型的贴剂。还包括未经治疗的对照小鼠以进行比较。

在将从患有胰腺癌症的患者获得的肿瘤组织移植至NSG(NOD/SCID/IL-2Rg KO)小鼠中之后，对已经成功生长的动物模型进行多代移植，并通过球状细胞形成进行单独扩增，以便制备可用于评价治疗作用的PDX模型。对于未经操纵的皮下输注手术，在手术后1周、手术后2周、手术后3周、手术后4周、手术后5周和手术后6周确定肿瘤大小、肿瘤标记物(CA19-9、CFB)和重量，之后进行组织学检查并确认存活率。

8-7-2.IO101/AC圆片在使用患者源性胰腺癌细胞的PDX胰腺癌症小鼠模型中的肿瘤抑制作用的评估

在PDX小鼠中产生皮肤切口之后，将对照(未治疗)、Gem-IP(溶胶-凝胶型)、IO101-IP(溶胶-凝胶型)、IO101/AC圆片(2.0mg/3.0％)、IO101-Con/AC (2.0mg/3.0％)和Gem/去端肽胶原圆片(0.12mg/3.0％)分别通过皮下麻醉解剖而局部植入皮肤与肿瘤之间。通过卡尺测量(Mitutoyo，Absolute AOS Digmatic，Kawasaki，Japan)每周三次测量肿瘤大小，并如上所述计算体积。与载体治疗的小鼠相比，药物治疗的动物中的肿瘤生长表示为肿瘤生长速率(肿瘤体积/初始肿瘤体积)。数据的统计显著性是通过统计学版本23计算的。所有结果均表示为平均值±标准偏差，应用Mann-Whitney U来比较根据不同组的连续变量，并且认为小于0.05的P值是显著的(参见图25)。

圆片植入后1个月，处死小鼠，并且收集组织样品和血液。将所提取的肿瘤在平衡器上称重并用Nikon数码相机(Japan)记录。对于血液学测量，从含有 K2E(K²EDTA)的BDMicrotainer管采集血液样品，以便在血清收集BD Microtainer化学管SST(BD，USA)中进行抗凝和毒性测试。IO101/AC圆片的抗癌作用通过TUNEL分析验证。在对照中未发现肿瘤坏死或细胞死亡。在 Gem-IP组中，确认了细胞凋亡过程，并且在移植的癌组织中发现肿瘤中的TUNNEL阳性癌细胞。另一方面，IO101/AC圆片组显示出显著的细胞凋亡过程，但是发现沿着肿瘤表面的表层的TUNNEL阳性癌细胞(参见图26)。

8-7-3.在使用患者源性胰腺癌细胞的PDX胰腺癌症小鼠模型中植入IO101圆片之后在其他器官中的副作用的评估

显微镜检查确认了，没有证据表明在肝脏、肺、肾脏和脾脏组织中潜在的毒性(诸如炎症或坏死变化)(参见图27)。在IO101/AC圆片组中未观察到白细胞减少症、贫血和中性粒细胞减少症。另一方面，展示了与吉西他滨的全身性作用相关的IP-GEM组中的白细胞减少症(WBC)(3.2±2.9相比于5.4±2.9，P ＝0.028)、低血红蛋白水平(HB)(10.3±4.6相比于18.5±11.9)和中性粒细胞减少症(0.76±0.71相比于2.69±2.66，p＝0.010)中。下表15示出了血液测试结果。

[表15]

1)对照与贴剂I之间的Mann-Whitney U；2)IP-GEM与贴剂I之间的 Mann-WhitneyU

实施例9.对寡核苷酸变体的体外功效的筛选

对(N)_x-[TGG]₄[TTG][TGG]_4或5、[TGG]₄[TTG][TGG]_4或5-(N)_x和 (N)_x-[TGG]₄[TTG][TGG]_4或5-(N)_y针对BxPC3(胰腺癌症)、MD-MBA 231(乳腺癌症)、Uuh-7(肝癌症)、HT29(结肠癌症)和Mv4-11(AML)细胞系的细胞增殖抑制功效进行验证。

将2.5x10⁵至5.0x10⁵个细胞/孔(其是通过用于确定胰腺癌细胞系BxPC3 细胞(ATCC，IMDM+10％PBS)中的适当细胞浓度的细胞试验限定的细胞数) 接种在96孔板中并孵育一天。在将每个样品在95℃下加热5分钟之后，将温度缓慢降低至室温，然后立即按浓度对每个孔处理样品。将经处理的BxPC3细胞在5％CO₂培养箱中孵育3天，用20μL试剂溶液处理以进行MTT测定(Cell Proliferation KitII，Roche)，然后按钟点地(10分钟、30分钟、60分钟)进行孵育，之后通过ELISA由读取器测量490nm处的吸光度(参见图28和图29)。

还以与上述相同的方式验证针对其他细胞系MD-MBA 231(乳腺癌症)、 Uuh-7(肝癌症)、HT29(结肠癌症)和Mv4-11(AML)的细胞增殖抑制功效。下表16中列出了每种细胞系的细胞活力。

[表16]

<110> 因特欧力多公司

<120> 具有改善治疗功效的修饰核酸和含有其的抗癌药物组合物

<130> 18OP08013PCT

<150> US 62/747,807

<151> 2018-10-19

<150> KR 2019/130669

<151> 2019-10-21

<160> 28

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_1

<400> 1

tggttgtgg 9

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_2

<400> 2

tggttgtggt gg 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_3

<400> 3

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<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_4

<400> 4

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<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_5

<400> 5

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<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_6

<400> 6

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<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_7

<400> 7

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<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_8

<400> 8

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<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_9

<400> 9

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<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_10

<400> 10

tggtggtggt ggttgtggtg gtggtgg 27

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_11

<400> 11

tggtggtggt ggttgtggtg gtggtggtgg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_12

<400> 12

tggtggtggt ggtggttgtg gtggtggtgg 30

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_13

<400> 13

tggtggtggt ggtggttgtg gtggtggtgg tgg 33

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_14

<400> 14

tggtggtggt ggtggttgtg gtggtggtgg tggtgg 36

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_15

<400> 15

tggtggtggt ggtggtggtt gtggtggtgg tggtgg 36

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_16

<400> 16

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<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_17

<400> 17

tggtggtggt ggtggtggtt gtggtggtgg tggtggtggt gg 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_18

<400> 18

tggtggtggt ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtggt gg 42

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_19

<400> 19

tggtggtggt ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtggt ggtgg 45

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_20

<400> 20

tggtggtggt ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtggt ggtggtgg 48

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_21

<400> 21

tggtggtggt ggtggtggtg gtggttgtgg tggtggtggt ggtggtgg 48

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_22

<400> 22

tggtggtggt ggtggtggtg gtggttgtgg tggtggtggt ggtggtggtg g 51

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_23

<400> 23

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<210> 24

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_24

<400> 24

tggtggtggt ggtggtggtg gtggtggttg tggtggtggt ggtggtggtg gtgg 54

<210> 25

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_25

<400> 25

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<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_26

<400> 26

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60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_27

<400> 27

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60

<210> 28

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸_28

<400> 28

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tgg 63