新型淬灭剂和报告基因染料组合
阅读说明：本技术 新型淬灭剂和报告基因染料组合 (Novel quencher and reporter dye combinations ) 是由 K·B·姆拉赫 B·伊梵斯 S·C·本森 张竹安 严雄伟 于 2019-03-01 设计创作，主要内容包括：公开了一种用于在生物测定中使用的探针。所述探针包含通过寡核苷酸接头与淬灭剂化合物结合的荧光染料。还公开了使用所述探针,如用于聚合酶链反应(PCR),如定量PCR反应(qPCR)中的方法,以及包含所述探针的试剂盒。(A probe for use in a bioassay is disclosed. The probe comprises a fluorescent dye bound to a quencher compound via an oligonucleotide linker. Also disclosed are methods of using the probes, such as in Polymerase Chain Reactions (PCR), such as quantitative PCR reactions (qPCR), and kits comprising the probes.)
技术领域
本说明书整体上涉及用于包含例如聚合酶链反应(PCR)(如实时或定量PCR(qPCR))在内的生物应用的包括淬灭剂和报告基因染料组合的FRET对。
背景技术
双标记寡核苷酸探针中的荧光能量转移(Fluorescent energy transfer，FRET)广泛用于基因分析的测定。FRET已被用于研究DNA杂交和扩增、蛋白质折叠动力学、蛋白水解降解以及其它生物分子之间的相互作用。核酸检测/扩增方法如在实时聚合酶链反应中使用双标记探针对靶核酸(如特定基因序列或表达的信使RNA序列)进行检测和/或定量。用于在这种方法中使用的荧光探针通常用报告基因和淬灭剂部分进行标记。在这种情况下，当两种染料通过探针与核酸模板的杂交和/或通过核酸外切酶活性从探针上去除淬灭剂或报告基因染料组分之一而被物理分离时，来自报告基因的荧光是未淬灭的。
荧光共振能量转移是分子能量转移(molecular energy transfer，MET)的一种形式，这是一种能量在供体分子和受体分子之间非放射性传递的过程。FRET源于某些化合物的性质；当通过暴露于特定波长的光而受到激发时，它们在不同波长的光下发光(即，它们发出荧光)。此类化合物被称为荧光团。在FRET中，能量在作为荧光团的供体分子和作为另一个荧光团或淬灭剂的受体分子之间的长距离(例如，10-100埃)上非放射性传递。供体吸收光子，然后将这种能量非放射性地转移给受体。
当激发和发射光谱重叠的两个荧光团非常接近时，一个荧光团的激发将使得第一个荧光团向第二个荧光团转移能量，进而使得第二个荧光团发出荧光。换句话说，第一(供体)荧光团的激发态能量通过共振诱导的偶极-偶极相互作用(dipole-dipoleinteraction)转移到相邻的第二(受体)荧光团。结果，供体分子的寿命缩短，其荧光淬灭，而受体分子的荧光强度被增强并去极化。当供体的激发态能量转移至非荧光团受体(如淬灭剂)时，供体的荧光被淬灭，随后受体不发出荧光。能够参与FRET的分子对被称为FRET对。为了发生能量转移，供体分子和受体分子通常必须非常接近(例如，高达70到100埃)。
检测核酸扩增产物的常用方法要求将扩增产物(即扩增子)与未反应的引物分离。这通常通过使用凝胶电泳来实现，凝胶电泳根据大小差异或者通过固定产物将扩增产物从引物中分离出来，从而允许洗去游离的引物。已经描述了在不从扩增子中分离引物的情况下监测扩增过程的其它方法。在这些方法中使用的示例性化合物包含
定量PCR(qPCR)的实时系统通过基于探针而不是基于嵌入剂的PCR产物检测得到了改进。一种用于在不与引物分离的情况下检测扩增产物的基于探针的方法是5'核酸外切酶PCR测定(也称为测定或水解探针测定)。这一替代方法提供了仅检测特定扩增产物的实时方法。在扩增过程中，当酶从上游引物延伸到探针区域时，探针(通常称为“TaqMan探针”)与其靶序列的退火产生被DNA聚合酶(如Taq)的5'核酸外切酶活性切割的底物。这种对聚合的依赖确保了只有当靶序列被扩增时，探针才会进行切割。
通常，TaqMan探针是附接到荧光报告基因染料(即，荧光团)和淬灭剂部分的不可延伸的寡核苷酸。当TaqMan探针完整无缺时，报告基因部分和淬灭剂部分非常接近，因此淬灭剂通过共振能量转移(resonance energy transfer，FRET)极大地减少了报告基因染料发出的荧光。通过发现在报告基因位于5'端和淬灭剂位于3'端的探针上观察到足够的淬灭，简化了探针的设计和合成。
在PCR的延伸阶段，如果靶序列存在，探针在一个引物位点的下游退火，并被具有这种活性的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5'酸外切酶活性切割，因为这一引物被延伸。探针的切割将报告基因染料与淬灭剂部分分开，从而增加了报告基因染料信号。切割进一步将探针从靶链上移除，从而允许引物延伸以继续至模板链的末端。因此，包含探针不会抑制整个PCR过程。在每个循环中，另外的报告基因染料分子从它们相应的探针上被切割下来，从而对与产生的扩增子数量成比例的荧光强度的增加造成了影响。
荧光探针相对于DNA结合染料(如SYBR)的优势在于，需要探针和靶标之间的特异性杂交来产生荧光信号。因此，在存在荧光探针的情况下，由于误引发或引物二聚体伪影引起的非特异性扩增不会产生信号。荧光探针的另一个优点是可以用不同的、可区分的报告基因染料进行标记。通过使用标记有不同报告基因的探针，可以在单个PCR中检测多个不同序列的扩增，通常称为多重测定。
目前对细胞和组织功能的分析通常需要从通常有限的材料中提取尽可能多的信息。例如，像肿瘤活检这样的样品很难收集，通常只能产生少量可用的核酸。单个靶分析物的PCR检测和测量(称为单重测定)一直是在核酸水平上分析临床研究样品的黄金标准，并且在超过二十五年的时间里，在扩展生物学知识的范围方面发挥了不可估量的作用。
然而，从临床研究样本中获得的有限数量的核酸常常迫使人们选择如何最好地利用这些珍贵的样品。此外，如果样品有限，可以分析的基因座数量也有限，从而减少了可以从样品中提取的信息的量。最后，建立多个单一测定反应所需的另外的时间和材料可能会显著增加复杂项目的费用。
核酸的多重PCR分析是这些问题的一个有吸引力的解决方案，这是一种从单个样品等分试样中扩增和定量多个靶标的策略。在多重PCR中，在单个PCR中用含有荧光染料的多个探针对样品等分试样进行查询。这增加了可以从所述样品中提取的信息的量。通过多重PCR，可以显著节省样品和材料。为了提高该方法的实用性，已经开发了使用几对基因特异性引物和探针来同时扩增和测量多个靶序列的多重PCR。多重PCR具有以下优点：1)效率：多重PCR通过将几个PCR测定结合到一个反应中，有助于保存样品材料并避免孔与孔之间的差异。多重可以更有效地利用有限的样品，如带有在不影响灵敏度的前提下无法拆分成多个等分试样的稀有靶标的样品；2)经济性：即使靶标被一致地扩增，通过使用具有独特报告基因染料的基因特异性探针来独立地检测每个靶标，以基于它们的荧光信号来区分扩增。优化后，多重测定比独立扩增的相同测定更具成本效益。
然而，目前在单一多重PCR测定中，可分析的靶标的数量有限。PCR反应的实验设计比单一反应更复杂。用于检测单个靶标的探针必须含有具有不同光谱的独特报告基因染料。实时检测系统的激发和发射过滤器的设置因制造商而异；因此，作为实验优化过程的一部分，必须为每种染料校准仪器。因此，多重PCR测定发展的一个限制是荧光团的数量，因此探针可以在单个反应中有效测量。例如，在多重PCR中，不同荧光报告基因之间的信号串扰会影响定量或导致假阳性。因此，选择光谱重叠最小的荧光团至关重要。此外，荧光团，特别是它们的发射和激发光谱，还必须与所用的PCR仪器兼容，特别是每个滤光片组的带通规格。
此外，使用淬灭良好的探针将信号串扰降至最低也很重要。设计荧光探针时，考虑到检测化学的类型，有必要确保荧光团和淬灭剂对是相容的。此外，当设计多重反应时，应最大程度的减少不同靶标的荧光团和淬灭剂之间的光谱重叠，以避免可能的串扰问题。以前，TaqMan探针最常见的染料/淬灭剂组合之一是带有TAMRA淬灭剂的FAM荧光团。如今，“暗淬灭剂”已经在很大程度上取代了TAMRA等荧光淬灭剂。暗淬灭剂发出的能量是它们从荧光团吸收的热量，而不是不同波长的光。“暗淬灭剂”倾向于产生具有较低背景的结果，并且在多重反应中特别有用，在所述反应中，重要的是避免淬灭剂发出的光与报告基因染料之一产生串扰信号。因此，高效的“暗淬灭剂”大大降低了背景荧光，从而导致灵敏度和终点信号增加。这对于多重反应特别有用，因为在同一管中有几个荧光团会产生更高的背景荧光。
一般而言，多重PCR反应仅限于4种探针组合，其中对于双重反应，最常用的组合是FAM和HEX对于三重反应，最常用的组合是FAM、HEX和Cy5或NED、FAM和
因此，需要提供另外的包括独特的荧光团/淬灭剂组合的探针，所述独特的荧光团/淬灭剂组合允许超出仅使用四个光谱通道(即，4重)的范围例如以用于5重和6重多重PCR测定的多重反应。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种探针，其包括以下的共价缀合产物：具有通式Ia、通式Ib、通式Ic或通式Id的染料；具有通式II的淬灭剂；以及连接所述染料和所述淬灭剂的接头。在一个实施例中，所述接头是寡核苷酸或包含寡核苷酸。
式Ia、Ib、Ic和Id如下：
当其存在时，R4、R13和R14以及R3中的每一个相同或不同并且选自由以下组成的组：H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合。在一个实施例中，所述经过取代的苄基是通过接头L附接的苯甲酸酯。R5、R6、R7、R8、R9、R10、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组。R2和R12中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组。X选自由以下组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-O-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并***、-苯并***、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并***、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺、NH(CH2CH2O)zCH2CH2N3和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂肪族或杂脂肪族基，z是1到5的整数、包含1和5，并且L选自由任选地被至少一个氧原子和/或硫原子取代的二价直链、交叉或环状烷基组成的组。在一个实施例中，X是含叠氮化物(N3)的基团。在一个实施例中，所述含叠氮化物的基团包括带有末端叠氮化物的脂肪族接头。在一个实施例中，所述具有末端叠氮化物的脂肪族接头选自NH-CH2-CH2-CH2-N3或NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N3。上述化合物进一步包括抗衡离子Kat，所述Kat是补偿花青带来的负电荷所需的一定量的Na+、K+、Ca2+、氨或其它一种或多种阳离子。在所述式中，m是从0到5的整数、包含0和5；n是从1到3的整数、包含1和3；o是从0到12的整数、包含0和12；并且p是从0到5的整数、包含0和5。
式II如下：
R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个相同或不同并且独立地选自H或SO3。Z是OR，其中R是H或烷基或NH-L，其中L是并且Y是H或与固体载体的连接。
本文提供的另一个方面是一种用染料和/或淬灭剂缀合或标记生物分子的方法，所述方法通过不含Cu的“点击反应”使用叠氮化物衍生的染料或淬灭剂来标记具有环辛炔部分的生物分子。在一个实施例中，所述生物分子是寡核苷酸。在一个实施例中，所述环辛炔部分是二苯并环辛炔(DIBO)。在一个实施例中，用于缀合或标记的方法产生本文所述的探针。
本文提供的另一个方面是通过聚合酶链反应(PCR)(如通过定量实时聚合酶链反应(qPCR))对样品中靶核酸分子的进行检测或定量的方法。在一个实施例中，所述方法包含：(i)使包括一个或多个靶核酸分子的样品与以下接触：a)至少一个探针，例如本文所述的对所述靶核酸分子具有序列特异性的探针，其中所述至少一个探针在所述一个或多个靶核酸分子扩增时发生可检测的荧光变化；以及b)至少一个寡核苷酸引物对；(ii)在足以扩增一个或多个靶核酸分子的条件下，将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起温育；以及(iii)通过测量所述探针的荧光来检测经过扩增的靶核酸分子的存在或不存在或对所述经过扩增的靶核酸分子的量进行定量。在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括5'核酸外切酶活性。在一些其它实施例中，所述DNA聚合酶是水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶。在一些实施例中，所述探针是水解探针，如TaqMan探针。
本文提供的另一方面是用于PCR(如定量实时聚合酶链反应(qPCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR))的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒包含探针(如本文所述的探针)、用于进行PCR的说明书以及以下中的一种或多种：缓冲剂、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、有机溶剂、酶、酶辅因子和酶抑制剂。在另一个实施例中，用于PCR的试剂盒包括所述染料和/或淬灭剂部分、用于将所述染料和/或淬灭剂部分缀合或标记到生物分子(如寡核苷酸)上的说明书、用于进行PCR的说明书以及以下中的一种或多种：缓冲剂、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、有机溶剂、酶、酶辅因子和酶抑制剂。
在本发明的又另一方面，提供了组合物(如用于聚合酶链反应的“主混合物(master mix)”)，所述组合物包括所述探针以及用于PCR的其它组分。在一些实施例中，制备主混合物，使得其在用于PCR之前需要小于3X的稀释度，例如2X稀释度、1.5X稀释度、1.2X稀释度等。
具体实施方式
水解探针测定利用某些DNA聚合酶(如Taq)的5'核酸外切酶活性，以在PCR过程中切割带标记的探针。水解探针的一个具体实例是TaqMan探针。在一个实施方案中，水解探针在探针的5'端含有报告基因染料，并且在探针的3'端含有淬灭剂部分。在PCR过程中，探针的切割将报告基因染料和淬灭剂部分分开，从而导致报告基因的荧光增加。PCR产物的积累是通过监测报告基因染料的荧光增加来直接检测的。当探针完整时，报告基因染料与淬灭剂部分的紧密接近主要通过型能量转移导致报告基因荧光的抑制(1948；Lakowicz，1983)。在PCR过程中，如果关注的靶标存在，探针在正向和反向引物位点之间特异性退火。Taq DNA聚合酶的5'至3'溶核活性仅在探针与靶标杂交时才在报告基因和淬灭剂之间切割探针。然后将探针片段从靶标上置换下来，并使链继续聚合。探针的3'端被封闭以防止探针在PCR过程中延伸。这一过程以连续的周期进行，并且不会干扰产物的指数累积。
不受这些参数的限制，设计TaqMan探针和引物的总体准则如下：设计引物时应使其尽可能靠近探针，但又不重叠；探针的温度Tm应该比引物的温度Tm高约10℃；选择给予探针C碱基多于G碱基的链；引物3'端的五个核苷酸应不超过两个G碱基和/或C碱基，并且应基于双阶跃热曲线(two-step thermal profile)运行反应，并且在60℃的相同温度下进行退火和延伸。
为了便于理解本公开，下面定义了许多术语。
如本文所用，“样品”是指含有或假定含有核酸的任何物质，并且可以包含细胞样品、组织样品或从一个或多个个体分离的流体样品。
如本文所用，“PCR”，除非特别定义，是指单重或多重PCR测定，并且可以是实时或定量PCR(其中检测在扩增过程中进行)、终点PCR(当检测在末端扩增进行时)或逆转录PCR。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探针、待检测的寡聚体片段、寡聚体对照和未标记的封闭寡聚体，并且是多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)和任何其它类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基(经修饰的嘌呤或嘧啶碱基)的N-糖苷)的总称。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间没有长度上的区别，这些术语可以互换使用。“核酸”、“DNA”、“RNA”和类似术语也可以包含核酸类似物。如本文所述，寡核苷酸不一定物理来源于任何现有的或天然的序列，而是可以以任何方式产生，包含化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
当两种不同的非重叠(或部分重叠)寡核苷酸与同一直链互补核酸序列的不同区域退火，并且一种寡核苷酸的3'端指向另一种寡核苷酸的5'端时，前者可称为“上游”寡核苷酸，而后者称为“下游”寡核苷酸。
如本文所用，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”和“关注的核酸”可互换使用，指待扩增、检测或两者兼有的所需区域。
本文所用的“探针”是附接到荧光报告基因染料和淬灭剂部分的不可延伸的寡核苷酸。
本文所用的“引物”可以指一个以上的引物，并且是指寡核苷酸，无论是天然存在的还是合成产生的，当置于在适当的温度下在足够的时间内并且在缓冲剂的存在下诱导了与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时(即在核苷酸和聚合试剂如DNA聚合酶的存在下)，所述寡核苷酸能够充当合成的起始点。此类条件可以包含例如在合适的缓冲液(“缓冲液”包含作为辅因子的取代基，或影响pH、离子强度等的取代基)中在合适的温度下存在至少四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸(如G、C、A和T)和聚合诱导剂(如DNA聚合酶或逆转录酶)。在一些实施例中，为了获得扩增的最大效率，引物可以是单链的。本文中的引物被选择为与待扩增的每个特定序列的不同链基本互补。这意味着引物必须具有足够的互补性才能与其相应的链杂交。非互补核苷酸片段可以附接到引物的5'端，并且引物序列的剩余部分与靶核酸的靶区互补或部分互补。通常，引物是互补的，除非非互补核苷酸可能存在于预定的序列位置，如所述的引物末端。
本文所用的核酸序列的互补物是指寡核苷酸，当其与核酸序列对齐时，使得一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对，处于“反平行缔合”。互补性不必是完美的；稳定的双链体可以含有不匹配的碱基对或不匹配的碱基。
核酸双链体的稳定性由解链温度或“Tm”来衡量。特定条件下特定核酸双链体的Tm是一半碱基对解离的温度。
术语“互补”在本文中用于与能与另一种特定核苷酸碱基配对的核苷酸相关。因此，例如，腺苷与尿苷或胸苷互补，并且鸟苷与胞苷互补。
术语“相同”是指两个核酸序列具有相同的序列或互补的序列。
如本文所用，“扩增”是指使用任何扩增程序来增加核酸序列混合物中特定核酸序列的浓度。
“聚合”，也可称为“核酸合成”，是指通过使用聚合酶和模板核酸延伸引物的核酸序列的过程。
如本文所用，术语“标记”是指可用于提供或帮助提供可检测(例如，可量化的)信号并可附接于核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色法、重量法、磁性、酶活性等检测的信号。提供可通过荧光检测的信号的标记在本文中也称为“荧光团”或“报告基因染料”或“染料”。
本文使用的术语“邻近”或“基本邻近”是指两个寡核苷酸在其模板核酸互补链上的定位。这两种寡核苷酸可以相隔0至约60个核苷酸，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。零核苷酸间隙意味着两种寡核苷酸直接相互邻接。换句话说，由两种寡核苷酸杂交的两个模板区域可以是连续的，即在两个模板区域之间没有间隙。可替代地，由寡核苷酸杂交的两个模板区域可以隔开1到约60个核苷酸。
如本文所用的，术语“重叠”是指两个寡核苷酸在其模板核酸互补链上的定位。这两个寡核苷酸可以重叠1到约40个核苷酸，例如约1到10个核苷酸。换句话说，由寡核苷酸杂交的两个模板区域可以具有与两个寡核苷酸互补的公共区域。
术语“热循环(thermally cycling/thermal cycling/thermal cycles)”是指从总变性温度到退火(或杂交)温度、延伸温度、再回到总变性温度的温度变化的重复循环。这些术语也指变性温度和延伸温度的重复循环，其中退火温度和延伸温度结合成一个温度。总变性温度将所有双链片段解结成单链。退火温度允许引物与核酸模板的分离链的互补序列杂交或退火。延伸温度允许扩增子的新生DNA链的合成。术语“单轮热循环”是指一轮变性温度、退火温度和延伸温度。例如，在一轮热循环中，可能存在退火温度和延伸温度的内部重复循环。例如，单轮热循环可包含变性温度、退火温度(即第一退火温度)、延伸温度(即第一延伸温度)、另一退火温度(即第二退火温度)和另一延伸温度(即第二延伸温度)。
本文使用的术语“反应混合物”、“扩增混合物”或“PCR混合物”是指从核酸模板中扩增至少一个扩增子所需的组分的混合物。所述混合物可以包括核苷酸(dNTP)、热稳定聚合酶、引物和多个核酸模板。所述混合物可以进一步包括Tris缓冲液、单价盐和/或Mg2+。每种组分的工作浓度范围在本领域是众所周知的，并且可以由普通技术人员根据需要进一步进行优化。
术语“主混合物”是一种预混合的浓缩溶液，含有实时PCR的所有成分，但不是样品特异性的。主混合物通常在针对PCR优化的缓冲液中含有热稳定的DNA聚合酶、dNTP、MgCl2和专有添加剂。
术语“扩增产物”或“扩增子”是指在扩增方法(如PCR)中使用一对引物通过聚合酶扩增的DNA片段。
如本文所定义，“5'→3'核酸外切酶活性”或“5'到3'核酸外切酶活性”或“5'核酸外切酶活性”是指切割反应或一组同源5'-3'核酸外切酶(也称为5'核酸外切酶)的活性，所述切割反应包含传统上与某些DNA聚合酶相关的5'到3'核酸外切酶活性(由此核苷酸以顺序方式从寡核苷酸的5'端去除(即，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段不具有这种活性)或5'到3'核酸外切酶活性(其中切割发生在自-5'端的一个以上磷酸二酯键(核苷酸)上)或两者，所述一组同源5'-3'核酸外切酶修剪分叉分子(即，在DNA复制、重组和修复过程中产生的支链DNA结构)。在一些实施例中，这种5'核酸外切酶可用于切割与靶核酸序列退火的带标记的寡核苷酸探针。
以下对报告基因(或荧光)染料(即荧光团和淬灭剂化合物)的描述提供了关于所述探针结构的总体信息。如本文所述，报告基因染料和淬灭剂化合物可以通过接头彼此共价结合。在一些实施例中，接头是或包含寡核苷酸。
报告基因染料
在一些实施例中，报告基因染料，也称为荧光团，可以是经过修饰的羰花青染料。例如，这些化合物可以具有至少一个经过取代的吲哚环系统，其中吲哚环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或缀合物质。其它示例性化合物掺入氮杂苯唑环部分和至少一个磺酸盐部分。
羰花青染料通常包括两个根据下式的通过聚次甲基接头结合在一起的杂环系统：
A-BRIDGE-B
其中A是第一杂环系统，所述第一杂环系统是任选地掺入一个或多个氮原子的经过取代的苯并唑环(氮杂苯并唑环)，B是第二杂环系统，所述第二杂环系统是被取代的苯并唑环或氮杂苯并唑环，并且BRIDGE是任选地经过取代的聚甲硅烷接头。第一和第二环系统和聚甲硅烷接头任选地被各种取代基进一步取代，或者稠合到任选地被进一步取代的另外的环上。在一个方面，羰花青染料含有化学反应性基团或附接在吲哚环系统的碳3上的缀合物质。在一个实施例中，羰花青染料进一步被磺基或磺基烷基取代一次或多次。
磺基是指磺酸或磺酸盐(磺酸盐)。类似地，“羧基”是指羧酸或羧酸盐。如本文所用，“磷酸盐”是磷酸的酯，并且包含磷酸盐。如本文所用，“膦酸盐”是指膦酸，并且包含膦酸盐。如本文所用，除非另有说明，烷基、烷氧基、芳基烷基、酰胺基、二烷基氨基、三烷基铵或全氟烷基等取代基的烷基部分是任选饱和的、不饱和的、直链或支链的，并且所有烷基、烷氧基、烷基氨基和二烷基氨基取代基本身任选被羧基、磺基、氨基或羟基进一步取代。
在一些实施例中，A部分具有下式：
其中Y代表形成一到两个稠合芳香环所必需的原子，所述稠合芳香环每个环中有6个原子，所述原子选自-CH、-C、-CR1和-N(R2)β，其中每个β是0或1，并且每个R1独立地是-L-Rx；或-L-Sc；或氨基、磺基、三氟甲基或卤素；或任选地被进一步取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基。稠环上掺入一个或多个非氢取代基可用于微调所得染料的吸收和发射光谱。在一个实施例中，存在至少一个非氢取代基，例如磺基、烷氧基或卤素；在一个实施例中，所述卤素是溴。
在一个实施例中，X是O、S、Se或NR5之一，其中R5是H或任选地被羟基、羧基、磺基、氨基、具有1-6个碳的烷基氨基或具有2-12个碳的二烷基氨基取代一次或多次的具有1-22个碳的烷基。可替代地，X是O、S或-CR3R4，其中R3和R4可以相同或不同，是烷基或芳基烷基，并且任选地被进一步取代。在一个实施例中，R3和R4各自相同或不同，并且选自由以下组成的组：氢、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合。在一个实施例中，经过取代的苄基是通过接头L附接的苯甲酸酯。例如，R3是-L-Rx或-L-Sc(定义如下)。
在一些实施例中，取代基R2、R4和R12独立地是-L-Rx；或-L-Sc；或C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其每个烷基部分任选地掺入至多六个选自N、O和S的杂原子，并且其每个烷基部分任选地被氟、氯、溴、碘、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵取代一次或多次；或者R3和R4结合形成被-L-Rx取代的五元或六元饱和或不饱和环；或-L-Sc。在一些实施例中，R4是任选地被氟、氯、溴、碘、羟基、羧基、磺基或氨基取代一次或多次的具有1-6个碳的烷基；例如，R4是甲基或乙基。在一方面，R4是甲基。可替代地，R4与R21结合形成6元环，如下所述；或R4与R3结合形成被-L-Rx或-L-Sc取代的饱和或不饱和环取代基。
在一些实施例中，R2和R12独立地是未被取代或被羟基、磺基、羧基或氨基取代一次的具有1-6个碳原子的烷基。当R2或R12被羟基、磺基、羧基或氨基取代时，取代基可以通过2-6个碳原子与吲哚鎓或其它苯唑鎓氮原子分开。当R2和R12是未取代的烷基时，它们可以是甲基或乙基。在一些实施例中，R2和R12是甲基。通常，R2和R12是相同的，并且是甲基、乙基、磺丙基或磺丁基。
在一些实施例中，B部分具有下式：
其中，W代表形成一个至两个稠合芳香环所必需的原子，所述稠合芳香环每个环中有6个原子，所述原子选自-CH、-C、-CR1'和-N(R12)β'，其中每个β'是0或1，并且每个R1'独立地是-L-Rx；或-L-Sc；或氨基、磺基、三氟甲基或卤素；或C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基、C2-C12二烷基氨基，其中每一个任选地被羧基、磺基、氨基或羟基进一步取代。当六元环形成氮杂苯并唑环体系时，它们通常掺入通常掺入与唑环稠合的第一个6元芳香环中的1-3个氮原子或1-2个氮原子。在一个实施例中，环系统W仅含有碳原子，并且是苯并唑环系统。
当A或B是氮杂苯唑鎓时，稠合芳香环通常掺入通常掺入与唑环稠合的第一个6元芳香环中的1-3个氮原子或1-2个氮原子。氮杂苯并唑部分的实施例包含但不限于以下结构(以及氮被R12季铵化的等效结构)：
当Y或W包含氮原子时，所述氮杂苯并唑氮原子中的至少一个被季铵化，从而产生形式正电荷。在一个实施例中，唑氮原子被季铵化，并且苯并氮原子未被取代。在一些实施例中，唑氮原子是未取代的，并且至少一个苯并氮原子被季铵化。通常，给定氮杂苯并唑上不超过一个唑氮被季铵化，即α为0或1，β为0或1，并且α+所有β＝1；并且δ为0或1，β'为0或1，并且δ+所有β'＝1。相对于在相同位置具有碳原子的染料，氮原子将发射光谱移动到更长的波长。另外的稠合6元环的存在(如上面最后一个结构)使波长移动得更远。
X和Z部分的选择也可能影响染料的吸收和荧光发射特性。X和Z任选相同或不同，并且所得染料的光谱性质可通过仔细选择X和Z来微调。在一个实施例中，Z是O、S、Se或NR15之一，其中R15是H或任选地被羟基、羧基、磺基、氨基、具有1-6个碳的烷基氨基或具有2-12个碳的二烷基氨基取代一次或多次的具有1-22个碳的烷基。可替代地，Z是O、S或-CR13R14，其中R13和R14可以相同或不同，是烷基或芳基烷基，并且任选地被进一步取代。通常，X和Z分别是-CR3R4和-CR13R14。
其中Z是-CR13R14，取代基R13和R14可以相同或不同，并且独立地是-L-Rx；或-L-Sc；或C1-C22烷基或C7-C22芳基烷基，其每个烷基部分任选地掺入至多六个选自N、O和S的杂原子，并且其每个烷基部分任选地被氟、氯、溴、碘、羟基、羧基、磺基、磷酸根、氨基、硫酸根、膦酸根、氰基、硝基、叠氮基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基氨基或C2-C12二烷基氨基或C3-C18三烷基铵取代一次或多次。在一个实施例中，R13和R14中的每一个相同或不同，并且选自由H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基组成的组，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合。在一个实施例中，经过取代的苄基是通过接头L附接的苯甲酸酯。可替代地，R13和R14组合形成任选被-L-Rx取代的五或六元饱和或不饱和环；或-L-Sc；或者R13或R14与次甲基取代基结合形成环，如下所述。在一些实施例中，R13和R14独立地是未被取代或被羟基、磺基、羧基或氨基取代一次的具有1-6个碳原子的烷基。在R13或R14被羟基、磺基、羧基或氨基取代的情况下，在一些实施例中，取代基可以与吲哚鎓或其它苯唑鎓氮原子隔开2-6个碳原子。在一方面，R13和R14是具有1-6个碳的烷基，例如甲基。在另一方面，R13和R14中的一个是甲基，另一个是被羧基或磺基或羟基或被-L-Rx或-L-Sc取代的具有1-6个碳的烷基。
在一些实施例中，BRIDGE部分具有下式：
其中a和b独立地为0或1。在氮杂羰花青染料的一个方面，a或b是1，而不是两者都是。杂环体系之间的聚甲硅烷桥的长度也影响染料的吸收和发射性质。其中Z是CR13R14，a和b＝0，并且吲哚鎓杂环不与另外的环稠合，所得的“吲哚菁”染料通常在550nm附近表现出最大吸收。当a＝1，b＝0时，“吲哚二碳氰”通常在650nm附近表现出最大程度的吸收。“吲哚三羰花青”染料，其中a和b两者都是1，通常在750nm附近表现出最大程度的吸收。
R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27中的每一个，当其存在时，独立地是H、F、Cl、具有1-6个碳的烷基、具有1-6个碳的烷氧基、芳氧基、氮杂芳香族部分或亚胺离子。可替代地，两个取代基R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27在结合时形成未被取代或任选被具有1-6个碳的饱和或不饱和烷基、卤素或羰基氧取代一次或多次的4元、5元或6元饱和或不饱和烃环。在又另一个实施例中，R21与R4结合形成任选地被具有1-6个碳的烷基取代的6元环。可替代地，R23(其中a和b都是0)、R25(其中a＝1和b＝0)或R26(其中a和b两者都是1)与R13和R14之一结合形成任选被具有1-6个碳的烷基取代的6元环。
通常，当其存在时，R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27中的每一个是H。当R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27中的一个是非氢时，其通常是BRIDGE中心碳上的取代基，即R22，其中a＝0，并且b＝0，R23是a＝1，并且b＝0，以及R24，其中a＝1，并且b＝1。类似地，当BRIDGE掺入了4元、5元或6元环时，其通常出现在BRIDGE部分的中心，例如如下所示的五次甲基染料：
一个实施例是下式的化合物：
和其盐，其中R2、R3、R4、R12、α、δ、W、Y和Z如前所定义。为简单起见，R21-23独立地如先前对R21-27所定义，并且n＝1、2或3。当n>3时，染料的光谱甚至进一步移至红外区。
染料的另一个实施例具有下式：
取代基R6-R9独立地选自H、具有1-6个碳的烷基、具有1-6个碳的烷氧基、氨基、具有1-6个碳的烷基氨基或具有2-12个碳的二烷基氨基、磺基、羧基、具有1-6个碳的全氟烷基或卤素。
在一方面，根据下式，A和B两者都是苯唑环：
其中取代基R16-R19独立地选自H、具有1-6个碳的烷基、具有1-6个碳的烷氧基、氨基、具有1-6个碳的烷基氨基或具有2-12个碳的二烷基氨基、磺基、羧基、具有1-6个碳的全氟烷基或卤素。
在一个或两个苯唑环上掺入一个或多个非氢取代基可用于微调吸收和发射光谱。在每个苯唑环上通常有至少一个非氢取代基，例如磺基、烷氧基或卤素取代基。通常，苯并环上的取代基是H或磺基。在一个实施例中，R6、R7、R8和R9之一，或R16、R17、R18、和R19之一是二烷基氨基，所述二烷基氨基是饱和的5或6元氮杂环，如哌啶。另外，R6-R9和R16-R19的任何两个相邻取代基任选地结合形成一个或多个稠合芳香环。如上所述，这些另外的环任选被R6-R9和R16-R19进一步取代，特别是被磺酸取代。
下面给出了具有另外的稠合芳香环的羰花青染料的实施例的选定实例(为简单起见，除了几个可能的取代基以外，所有取代基都显示为具有最短的聚甲基桥的氢)：
如本节所述，这些基本结构和它们的长波长类似物任选地被进一步取代。上面没有具体描述的另外的变型也在本公开的范围内。
在一方面，羰花青染料被磺化一次或多次。如果染料被磺基取代，它可以在R7或R17或其两者被磺化，或者在R2或R12或其两者被磺基烷基化，或者既被磺化又磺基烷基化。通常芳香环，当Y或W的含有一个或多个氮原子时，所述环不被磺化。通常，市售的活性羰花青染料被磺化三次(在对应于R7和R17的位置，并且在R2和R12之一作为磺基烷基)，从而留下R2和R12之一作为活性基团的位置。相反，通过在R3附接活性基团(或缀合物质)，羰花青染料的某些实施例可以被磺化至少四次(在R7，在R17，以及在R2和R12作为磺基烷基)。这种另外的磺化作用，以及附接位置的变化，使得活性染料和染料缀合物更亮，更易溶于水溶液，并且更能抵抗染料-染料堆积相互作用产生的荧光淬灭。然而，染料不需要被四种或更多种磺酸磺化就能具有优于那些不通过吲哚环的3位连接的结构相似的染料的光谱性质。
此外，染料的某些实施例被一个或多个化学活性基团(-L-Rx)或缀合物质(-L-SC)取代，如下所述。通常，-L-Rx或-L-SC部分在R2、R3、R4、R13或R14与染料结合。可替代地，-L-Rx或-L-SC可以在氮杂苯唑环或苯唑环的芳香族碳原子上与染料结合。在一个实施例中，R2和R12中的一个或多个是-L-Rx或-L-SC。在又另一个实施例中，R3、R4、R13和R14中的一个或多个是-L-Rx或-L-SC。可替代地，R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27中的一个或多个是-L-Rx或-L-SC。在一个实施例中，所述染料仅被一个-L-Rx或-L-SC取代。
示例性荧光染料包含但不限于：
化合物的许多实施例具有总电子电荷。应该理解的是，当显示这种电子电荷存在时，所述电子电荷被合适的可以被明确鉴定、也可以不被明确鉴定的抗衡离子Kat的存在所平衡。生物相容的抗衡离子在生物应用中是无毒的，并且对生物分子没有实质上的有害影响。当化合物带正电荷时，抗衡离子通常选自但不限于：氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、链烷磺酸盐、芳基磺酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、四芳基硼化物、硝酸盐和芳香族或脂肪族羧酸的阴离子。当化合物带负电荷时，抗衡离子通常选自但不限于：碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子、铵或经过取代的铵或吡啶离子。在一些实施例中，任何必需的抗衡离子都是生物相容的，使用时没有毒性，并且对生物分子没有实质上的有害影响。通过本领域公知的方法(如离子交换色谱法或选择性沉淀)可以容易地改变抗衡离子。
应该理解，本文公开的染料是以一种或另一种特定的电子共振结构绘制的。上面讨论的每一个方面都同样适用于用其它允许的共振结构正式绘制的染料，因为主题染料上的电子电荷在染料本身中是离域的。
在一个实施例中，所述染料包含多个磺酸盐基团。在一些实施例中，所述染料包含活性官能团或其用于将染料连接到另一种物质的保护形式。在一些实施例中，染料以受保护的形式提供，例如作为可用于在自动核酸合成过程中将染料缀合到分子(如寡核苷酸上)上的亚磷酰胺衍生物，如本领域已知的。本文所述的代表性羰花青染料结构如下所示。
活性染料的缀合物
在一个实施例中，所述染料含有至少一个基团-L-Rx，其中Rx是通过共价键L附接到所述染料上的活性基团。在某些实施例中，将染料附接到Rx上的共价键含有多个充当间隔物的中间原子。带有活性基团(Rx)的染料标记含有或被修饰成含有具有适当活性的官能团的多种有机或无机物质，从而导致缀合物质(Sc)的化学附接(用-L-Sc表示)。
如本文所用，“反应性基团”是指化合物上能够与不同化合物上的官能团化学反应形成共价键的部分。通常，反应基团是可以通过暴露于对应的官能团(分别是亲核试剂或亲电试剂)而形成共价键的亲电试剂或亲核试剂。可替代地，反应性基团是可光活化的基团，并且仅在用适当波长的光照射后才变成化学反应性的。通常，活性染料和待缀合物质之间的缀合反应使得活性基团Rx的一个或多个原子被掺入新的将染料附接到缀合物质Sc上的键L中。反应性基团和键的选定实例如下表1所示，其中亲电基团和亲核基团的反应产生共价键。
表1—到达有用共价键的一些途径的实例
*如本领域所理解的，活化酯通常具有式-COΩ，其中Ω是良好的离去基团(例如琥珀酰亚胺氧基(-OC4H4N3)；
磺基琥珀酰亚胺氧基(-OC4H3O2SO3H)、-1-氧代苯并***(-OC6H4N3)；或被吸电子取代基(如硝基、氟、氯、氰基或三氟甲基或其组合)取代一次或多次的用于形成活化的芳基酯的芳氧基或芳氧基；或由碳二亚胺活化以形成酸酐或混合酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb的羧酸，其中Ra和Rb可以为C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或C1-C8烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基，其可以相同或者不同)。
**酰基叠氮化物也可以重排成异氰酸酯
共价键L将反应性基团Rx或缀合物质Sc直接或结合稳定的化学键结合到化合物上(L是单键)，所述稳定的化学键任选地包含单碳-碳键、双碳-碳键、三碳-碳键或芳香族碳-碳键，以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和氮-铂键。L通常包含醚、硫醚、甲酰胺、磺酰胺、尿素、氨基甲酸乙酯或肼部分。示例性的L部分具有1-20个选自由以下组成的组的非氢原子：C、N、O、P和S，并且由醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳香族或杂芳香族键的任意组合构成。在一些实施例中，L是单个碳-碳键和甲酰胺或硫醚键的组合。键L最长的直链部分可以含有4-10个非氢原子，包含一个或两个杂原子。L的实例包含经过取代的或未取代的聚亚甲基、亚芳基、烷基芳基、芳基烷基或芳硫基。在一个实施例中，L含有1-6个碳原子；在另一个实施例中，L包括硫醚键。在又另一个实施例中，L是或掺入了式-(CH2)d(CONH(CH2)e)z、或-(CH2)d(CON(CH2)4NH(CH2)e)z'-、-(CH2)d(CONH(CH2)eNH2)z'-、-(CH2)d(CONH(CH2)eNHCO)z'-,其中d是0-5，e是1-5，并且z'是0或1。
用于将染料附接到待缀合物质上的反应基团的选择通常取决于待缀合物质上的官能团和所需共价键的类型或长度。通常存在于有机或无机物质上的官能团的类型包含但不限于：胺、酰胺、叠氮化物、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸盐、咪唑、肼、羟胺、二取代胺、卤化物、环氧化物、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯键或这些基团的组合。物质上可能存在单一类型的反应位点(多糖的典型位点)，或者可能存在多种位点(如胺、硫醇、醇、酚)，如蛋白质的典型位点。缀合物质可以与一种以上的染料缀合，这些染料可以相同或不同，也可以与另外被半抗原(如生物素)修饰的物质缀合。尽管通过仔细控制反应条件可以获得一定的选择性，但标记的选择性最好通过选择合适的活性染料来获得。
通常，Rx将与胺、硫醇、醇、醛或酮反应。在一些实施例中，Rx与胺或硫醇官能团反应。在一个实施例中，Rx为丙烯酰胺、反应性胺(包含尸胺或乙二胺)、羧酸的活化酯(通常为羧酸的琥珀酰亚胺酯)、酰基叠氮化物、酰基腈、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、卤代芳基、叠氮化物、氮丙啶、硼酸酯、羧酸、重氮烷烃、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包含酰肼)、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、磺酰卤或硫醇基。
当Rx是羧酸的活化酯时，活性染料可用于制备蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或半抗原的染料缀合物。当Rx是马来酰亚胺或卤代乙酰胺时，活性染料可用于与含硫醇物质缀合。
在一些实施例中，Rx是羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团、脂肪族胺、全氟苯甲酰胺、叠氮基氟苯甲酰胺基团或补骨脂素。在一些实施例中，Rx是羧酸、马来酰亚胺或碘乙酰胺的琥珀酰亚胺酯。在一个实施例中，Rx是羧酸的琥珀酰亚胺酯。
在一些实施例中，Rx包括叠氮化物，并且采用应变促进的叠氮化物-炔烃点击反应，这在叠氮化物与应变的环状炔烃(如二苯并环辛炔)之间提供了选择性的、生物正交的和无催化剂的连接。
在一些实施例中，Sc是核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，包含那些被修饰以具有用于附接染料的另外的接头或间隔物(如炔基键、氨基烯丙基键、或杂原子取代的接头或其它键)的核酸。
在另一个实施例中，缀合物质是通过非环状间隔物将嘌呤或嘧啶碱基连接到磷酸或多磷酸部分的核苷或核苷酸类似物。
在另一个实施例中，染料通常通过羟基与核苷酸或核苷的碳水化合物部分缀合，但也可能通过硫醇或氨基与所述碳水化合物部分缀合。通常，缀合核苷酸是核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸或二脱氧核苷三磷酸。将亚甲基部分或氮或硫杂原子掺入磷酸盐或多磷酸盐部分也是有用的。非嘌呤和非嘧啶碱基(如7-去氮杂嘌呤)和含有这些碱基的核酸也可以与染料偶联。通过将脱嘌呤核酸与胺、酰肼或羟胺衍生物进行反应制备的核酸加合物提供了标记和检测核酸的另外的手段。
在一些实施例中，核酸聚合物缀合物是带标记的、单链或多链的、天然的或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸、或DNA/RNA杂交体，或掺入不常见的接头(如吗啉衍生的磷酸酯(AntiVirals公司(AntiVirals,Inc.)，Corvallis Oreg.))或肽核酸(如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元)。当核酸是合成寡核苷酸时，其通常含有少于50个核苷酸，更通常少于25个核苷酸。肽核酸(PNA)缀合物可用于某些应用，因为它们的杂交速率通常更快。
在另一个实施例中，荧光核酸聚合物可以如通过使用聚合酶链反应或通过引物延伸或通过末端转移酶催化将带标记的核苷酸添加到核酸聚合物的3'端利用寡核苷酸引发的DNA聚合从带标记的核苷酸或寡核苷酸制备。在这一实施例中，荧光RNA聚合物通常通过转录由带标记的核苷酸制备。通常，染料通过酰胺、酯、醚或硫醚键通过一个或多个嘌呤或嘧啶碱基附接；或者通过酯、硫酯、酰胺、醚或硫醚的键附接到磷酸盐或碳水化合物上。可替代地，染料缀合物可以同时用半抗原(如生物素或地高辛)标记，或标记到酶(如碱性磷酸酶)，或标记到蛋白质(如抗体)。核苷酸缀合物很容易被DNA聚合酶掺入，并可用于原位杂交和核酸测序。
在另一个方面，寡核苷酸可以掺入脂肪族胺，所述脂肪族胺随后可以与胺反应性染料或硫醇或硫代磷酸酯缀合，后者又可以与硫醇反应性染料缀合。
在一个实施例中，寡核苷酸和核酸聚合物等生物聚合物的缀合物也用至少第二种荧光或非荧光染料标记以形成能量转移对。在一个实施例中，所述第二种非荧光染料是淬灭剂。在一些方面，带标记的缀合物起酶底物的作用，并且酶水解破坏能量转移。更具体地，在一个实施例中，核酸聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性切割寡核苷酸，从而从它们的邻近位置释放荧光团和淬灭剂，并由此消除或基本上消除淬灭剂对荧光团的淬灭作用。
淬灭剂
在一个实施例中，淬灭剂是3-和/或6-氨基呫吨的衍生物，其在一个或多个氨基氮原子上被芳香族或杂芳香族淬灭部分取代。在一个实施例中，所述淬灭化合物通常在530nm以上具有最大吸收，具有很少或没有可观察到的荧光，并有效淬灭宽光谱的荧光，例如由本文公开的荧光团发射的荧光。在一个实施例中，淬灭化合物是经过取代的罗丹明。在另一个实施例中，淬灭化合物是经过取代的红醛。在又另一个实施例中，淬灭剂是化学反应性化合物。化学反应淬灭化合物具有标记多种物质(包含生物分子(如核酸))的效用。这些被标记的物质对于各种能量转移测定和应用非常有用，特别是当与荧光团结合使用时。
如本文所用，每个淬灭部分Q是具有1-4个稠合的芳香族或杂芳香族环的芳香族或杂芳香族环系统，其通过单个共价键附接到氨基氮。当Q部分是全芳香族且不含杂原子时，Q包括1-4个稠合的六元芳香环。当Q部分为杂芳香族时，Q掺入至少一个5元或6元芳香族杂环，所述杂环含有至少1个和多达4个选自由O、N和S以任意组合组成的组的杂原子，所述杂环任选地稠合到另外的六元芳香环上，或稠合到一个含有至少1个和多达3个选自由O、N和S以任意组合组成的组的杂原子的5元或6元杂芳香族环上。
在一个实施例中，每个Q部分通过单个共价键在3-或6-氨基氮原子上与呫吨化合物结合。在一些实施例中，氨基氮取代基结合形成5元-或6-元杂环，所述杂环是哌啶、吗啉、吡咯烷、吡嗪或哌嗪，并且Q部分稠合到与呫吨氮相邻的所产生的杂环上，从而通过单键正式结合到氨基氮上。Q部分可以在芳香环或杂芳香环上与氨基氮原子结合，只要它附接在所述环的碳原子上。
通常，Q部分是经过取代或未取代的苯基、萘基、蒽基、苯并噻唑、苯并噁唑或苯并咪唑。当氨基氮取代基形成5元或6元杂环并且Q部分与所产生的杂环稠合时，所述杂环通常是吡咯烷环，而Q部分通常是稠合的六元芳香环。在一些实施例中，Q是苯基或经过取代的苯基。
在各个实施例中，每个Q部分任选且独立地被氢、卤素、氰基、磺基、羧基的碱金属或铵盐、羧基的碱金属或铵盐、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基氨基取代。
在一个实施例中，所述淬灭化合物具有下式：
其中K部分是O或N+R18R19。
对于所有淬灭化合物，R8、R9、R18和R19中的至少一个是Q部分。可替代地，R8与R9结合，或R18与R19结合，形成饱和的5元或6元杂环，所述杂环为哌啶，或与Q部分稠合的吡咯烷。通常，R8和R9之一以及R18和R19之一各自是相同或不同的Q部分。在另一个实施例中，R8、R9、R18和R19中的每一个都是可以相同或不同的Q部分。
其余的R8、R9、R18和R19独立地是H、C1-C6烷基、C1-C6羧基烷基、C1-C6磺基烷基、C1-C6羧基烷基的盐或C1-C6磺基烷基的盐，其中烷基部分任选地被氨基、羟基、羧酸、羧酸盐或C1-C6烷基的羧酸酯取代。可替代地，其中R8与R9结合，或R18与R19结合，或两者结合，形成饱和的5元或6元杂环，所述杂环为任选地被甲基、磺酸、磺酸盐、羧酸、羧酸盐或C1-C6烷基的羧酸酯取代的哌啶、吗啉、吡咯烷、吡嗪或哌嗪。可替代地，R8与R2结合、R9与R3结合、R18与R4结合、或R19与R5结合中的一个或多个形成饱和或不饱和且任选地被一个或多个C1-C6烷基或-CH2SO3X取代的5元或6元环，其中X是H或抗衡离子。
在一个实施例中，R1和R6是H，或者R1与R2的组合或R6与R5的组合中的一个或多个是稠合的六元芳香环。
在一个实施例中，取代基R2、R3、R4和R5独立地是H、F、Cl、Br、I、CN；或C1-C18烷基或C1-C18烷氧基，其中每个烷基或烷氧基任选地被F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐或C1-C6醇的羧酸酯进一步取代；或者-SO3X。
在一个实施例中，侧基R10是H、CN、羧酸、羧酸盐或C1-C6醇的羧酸酯。可替代地，R10是任选被F、Cl、Br、羧酸、羧酸盐、C1-C6醇的羧酸酯、-SO3X、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代一次或多次的饱和或不饱和、支链或无支链C1-C18烷基，所述烷基的烷基基团具有1-6个碳。在另一个实施例中，R10具有下式：
其中R12、R13、R14、R15和R16独立地是H、F、Cl、Br、I、-SO3X、羧酸、羧酸盐、CN、羟基、氨基、肼基、叠氮基；或C1-C18烷基、C1-C18烷氧基、C1-C18烷硫基、C1-C18烷酰氨基、C1-C18烷基氨基羰基、C2-C36二烷基氨基羰基、C1-C18烷氧基羰基或C7-C18芳基甲酰胺基，所述基团的烷基或芳基部分任选地被F、Cl、Br、I、羟基、羧酸、羧酸盐、C1-C6醇的羧酸酯、-SO3X、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基取代一次或多次，每个基团的烷基部分具有1-6个碳。可替代地，相邻的取代基对R13和R14、R14和R15、或R15和R16结合形成稠合的6元芳香环，其任地选被羧酸或羧酸盐进一步取代。
所述化合物任选地被活性基团(Rx)或缀合物质(Sc)取代，所述活性基团或缀合物质通过共价键L附接到所述化合物，如上所述。通常，所述化合物在R8、R9、R12、R13、R14、R15、R16、R18或R19中的一个或多个上被-L-Rx或-L-Sc部分取代，例如在R12-R16中的一个上，或在R12、R14或R15上，或作为Q部分上的取代基。可替代地，-L-Rx或-L-Sc部分作为烷基、烷氧基、烷硫基或烷基氨基取代基上的取代基存在。在一个实施例中，R8、R9、R12、R13、R14、R15、R16、R18或R19中的恰好一个是-L-Rx或-L-Sc部分。在另一个实施例中，R12、R13、R14、R15或R16中的恰好一个是-L-Rx或-L-Sc部分。在一个实施例中，R12、R14和R15中的一个是-L-Rx或-L-Sc部分。
在其中K部分是N+R18R19的实施例中，所述化合物是罗丹明，并具有下式
其中R8、R9、R18和R19中的至少一个是Q部分。在一些实施例中，R8和R9中的至少一个是Q部分，并且R18和R19中的至少一个是Q部分，它们可以相同或不同。
在K部分是O的实施例中，所述化合物是红醛，并具有下式
其中R8和R9中的至少一个是Q部分。
在一个实施例中，本发明化合物具有下式
其中J是O-R7或NR18R19，并且每个R1-R19如上定义。
淬灭化合物的前体通常不起到淬灭剂的作用，除非或直到环体系的芳香性恢复，与上述淬灭化合物一样。在这些前体中，R7是H、C1-C6烷基、C1-C6羧基烷基、C1-C6磺基烷基、C1-C6羧基烷基的盐或C1-C6磺基烷基的盐，其中烷基部分任选地被氨基、羟基、羧酸、羧酸盐或C1-C6烷基的羧酸酯取代。可替代地，R7是通过从羧酸、磺酸、磷酸或单糖或多糖(如糖苷)中除去羟基而正式衍生的单价基团。
在一个实施例中，R10如前所定义，并且R11是H、羟基、CN或具有1-6个碳的烷氧基。可替代地，R10与R11结合形成5元或6元螺内酯环，或R11与R12结合形成5元或6元螺内酯环，或5元或6元砜环。
这些前体化合物很容易通过化学、酶或光解方法转化为完全缀合的淬灭化合物。通常，无色前体被-L-Rx部分取代，或与所需物质(Sc)缀合。
示例性淬灭剂化合物包含但不限于以下：
在一个实施例中，所述淬灭剂是
在一个实施例中，所述淬灭剂包含一个或多个磺酸盐或SO3H取代基，如例如，
活性化合物的缀合物
在一个实施例中，化合物(淬灭化合物或前体化合物)被至少一个基团-L-Rx取代，其中Rx是通过共价键L附接到化合物上的反应性基团，如以上对于染料详细描述的。带有反应性基团的化合物(Rx)标记含有或被修饰成含有具有适当反应性的官能团的多种有机或无机物质，从而导致缀合物质(Sc)的化学附接(用-L-Sc表示)。
在一个实施例中，缀合物质(Sc)是天然或合成的核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，包含那些被保护或被修饰以具有另外的用于附接化合物的接头或间隔物(如炔基键、氨基烯丙基键或其它键)的核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物。在一些实施例中，缀合核苷酸是核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸或二脱氧核苷三磷酸。
尽管通常优选使用自动DNA合成仪将染料掺入到核酸上，但不能以脒盐形式获得或不能在苛刻的切割/去保护(C/D)条件下存活的染料通常通过其NHS酯衍生物合成后引入到胺官能化的寡核苷酸中。然而，由于竞争性的副反应，包含合成中残留胺杂质的水解和氨基裂解，这种标记反应通常需要大量过量的染料—NHS酯，例如，相对于核酸对应物的10至20倍的摩尔当量。
鉴于此，本发明人开发了一种使用叠氮基衍生的染料通过高效、无Cu的点击反应来标记具有应变环辛炔部分的核酸(如寡核苷酸)的替代策略。由于叠氮化物和环辛炔官能团之间形成***的特殊性质，很少有副反应与这些反应竞争或干扰。例如，花青染料的叠氮基衍生物在后C/D浓缩步骤中与含环辛炔的寡核苷酸反应，以利用在高浓度叠氮化物和辛炔部分下的更快的点击反应动力学。因此，与寡核苷酸相比，仅使用20％摩尔过量(或1.2当量)的染料就实现了含环辛炔的寡核苷酸向叠氮基衍生染料的近定量转化。
这种基于不含Cu的叠氮化物/环辛炔点击化学产生染料-寡核苷酸缀合物的替代性标记方案与通常使用的NHS酯/胺化学相比具有以下优点：1.缀合所需叠氮染料的摩尔当量低于其NHS酯对应物，这意味着试剂成本降低；2.由于叠氮基染料的化学惰性，其可以被重新配制并以比其的NHS酯对应物要长得多(或储存期更长)的即用溶液的形式储存；以及3.标记后清理工作流程可以进一步简化，以降低人工成本。
通过使用活化炔烃与叠氮化物的反应，叠氮化物和炔烃可以进行无铜(即无催化剂)的[3+2]环加成。这种无催化剂的[3+2]环加成可用于本文所述的将染料与生物分子(如寡核苷酸)偶联的方法中。炔烃可以通过环应变(如仅举例来说，将吸电子基团附加到此类炔烃环上的八元或九元环结构)活化，或者炔烃可以通过加入路易斯酸(如仅举例来说，Au(I)或Au(III))进行活化。已对由环应变活化的炔烃进行了描述，并且将其称为“无铜”或无Cu[3+2]环加成。例如，Agard等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc)》,126(46):15046-15047(2004)所描述的环辛炔和二氟环辛炔；Boon等人,PCT国际公开号WO 2009/067663 Al(2009)所描述的二苯并环辛炔；Debets等人,《化学通讯(Chem.Comm.)》,46:97-99(2010)所描述的氮杂-二苯并环辛炔；以及Dommerholt等人,《应用化学(Angew.Chem.)》,122:9612-9615(2010)所描述的环壬炔。对活化炔烃与叠氮化物的无Cu反应的另外的描述可以在PCT/US2006/042287、PCT/IB2007/003472和PCT/US2013/066765中找到。在本文所述方法的某些实施例中，所述染料可以具有叠氮化物部分，此时所述生物分子具有活化的炔烃部分；而在其它实施例中，染料可以具有活化的炔烃部分，并且生物分子具有叠氮化物部分。在各个实施例中，环辛炔选自环辛炔(OCT)、单氟化环辛炔(MOFO)、二氟环辛炔(DIFO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二苯并环辛炔(DIBO)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、双芳基环辛炔酮(BARAC)、双环壬炔(BCN)、2,3,6,7-四甲氧基-DIBO(TMDIBO)、磺酰化DIBO(S-DIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)和吡咯并环辛炔(PYRROC)。
示例性核酸聚合物缀合物是标记的、单链的、双链的或多链的、天然的或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸、或DNA/RNA杂交体，或掺入不常见的接头，如吗啉衍生的磷酸酯或肽核酸(如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元)。当核酸是合成寡核苷酸时，其通常含有少于50个核苷酸，更通常少于25个核苷酸。较大的核酸聚合物通常由带标记的核苷酸或寡核苷酸使用寡核苷酸引发的DNA聚合如通过使用聚合酶链反应或通过引物延伸或通过末端转移酶催化将带标记的核苷酸添加到核酸聚合物的3'端的来制备。通常，所述化合物通过酰胺、酯、醚或硫醚键通过一个或多个嘌呤或嘧啶碱基附接；或者通过酯、硫酯、酰胺、醚或硫醚的键附接到磷酸盐或碳水化合物上。可替代地，通过化学后修饰(如用铂试剂)或使用光活化分子(如缀合补骨脂素)将化合物缀合到核酸聚合物上。在一个实施例中，淬灭部分通过亚磷酰胺反应基团附接到核苷酸、寡核苷酸或核酸聚合物上，从而产生磷酸二酯键。
只要淬灭化合物和荧光团足够接近以发生淬灭，并且在荧光团的发射波长和淬灭化合物的吸收带之间至少发生一些光谱重叠，淬灭化合物可以接受来自多种荧光团的能量。如果存在足够的光谱重叠，这种重叠可能与在比淬灭化合物的最大吸收波长更低或甚至更高的波长发射最大值时发生的供体发射同时发生。在一些实施例中，淬灭化合物仅是微弱荧光，或者基本上无荧光，因此能量转移导致荧光发射很少或没有荧光发射。在一个方面，淬灭化合物基本上是非荧光的，并且具有小于约0.05的荧光量子产率。在另一方面，淬灭化合物的荧光量子产率小于约0.01。在又另一方面，淬灭化合物具有小于约0.005的荧光量子产率。
通常，淬灭通过供体和淬灭受体之间的FRET发生。供体受体对表现出的FRET程度可以用福斯特方程表示：
其中半径(Ro)表示供体和受体之间能量转移效率为50％的分离距离(即50％的受激供体被FRET去活化)；
κ2＝偶极定向因子(范围0-4，为随机定向供体和受体的κ2＝2/3)；
QYD＝不存在受体时供体的荧光量子产率；
n＝折射率；并且
J(λ)＝光谱重叠积分。
因为能量转移的程度取决于光谱重叠积分，所以可以容易地理解，供体和受体染料的光谱特性对观察到的能量转移有很大影响，如下式所示：
J(λ)＝∫εA(λ)·FD(λ)·λ4dλcm3M-1
其中εA(λ)是受体的吸收光谱，用摩尔消光系数εA表示。FD(λ)是供体的荧光发射光谱，并且荧光强度(FD)表示为总积分强度的分数。
应该容易理解的是，在FRET过程中的能量转移程度以及因此的淬灭高度依赖于荧光团和淬灭化合物之间的分离距离。在分子系统中，荧光淬灭的变化通常与荧光团分子和淬灭化合物分子之间的分离距离的变化密切相关。任何与淬灭化合物有足够光谱重叠的荧光团都是这些应用的合适供体。重叠程度越大，观察到的总体淬灭越大。
在一个实施例中，通过观察荧光团荧光的部分或完全恢复来检测包括所述荧光团和淬灭剂的分子结构的分解、切割或其它降解。在一些实施例中，与所述结构缔合的荧光团的最初淬灭的荧光在通过分子结构的分解、切割或降解从淬灭化合物附近被去除时变得不受影响。淬灭化合物任选地与荧光团的相同分子结构缔合，或者供体和受体与所述结构的相邻但不同的亚基缔合。除了其它系统之外，可以使用所描述的能量传递对对以下系统进行分析，以对结构分解进行检测和/或量化：
使用荧光底物对蛋白酶活性的检测(例如HIV蛋白酶测定)；对酶介导的蛋白质修饰的检测(例如碳水化合物/脂肪酸、磷酸盐、辅基的切割)；免疫分析(通过置换/竞争测定)；对DNA双链体解链的检测(例如解旋酶测定/拓扑异构酶测定/回旋酶测定)；核酸链置换；ds DNA熔化；核酸酶活性；脂质分布和转运；以及TaqMan测定。
当缀合物质暴露于关注降解条件下足以发生降解的时间段时，结构分解通常通过观察荧光的部分或完全恢复来检测。荧光的恢复表明荧光团和淬灭化合物之间的分离距离增加，因此缀合物质降解。
探针
各种制造商提供了能够检测多重PCR测定的仪器。作为一个实例，赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))提供了用于在赛默飞世尔科技公司仪器(如Vii7、Quant Studio等)上实时检测核酸靶标的4重TaqMan测定。这些实时qPCR仪器中的大多数都具有运行6重TaqMan测定的光学能力。在一些实施例中，TaqMan多重探针具有FAM、VIC、ABY和JUN报告基因染料和QSY7淬灭剂。QSY7淬灭剂不能有效淬灭荧光最大值>630nm的报告基因染料。因此，在一个实施例中，在实施第5和第6过滤器的PCR中用于检测的理想染料分别在665nm和700nm具有发射最大值。在一个实施例中，第5和第6报告基因染料应该以亚磷酰胺衍生物形式获得，这使得更容易以高质量和低成本合成TaqMan探针。在一个实施例中，所述一个或多个探针被包含在多重PCR测定中作为第5和/或第6探针，所述测定还包括包含以下染料/淬灭剂组合的探针：JUN/QSY、VIC/QSY、FAM/MGBNFQ和ABY/QSY。这些探针的染料的最大发射波长为：FAM：约517nm；VIC：约551nm；ABY：约580nm；以及JUN：615nm。在各个实施例中，所述探针还包含位于3'端的提高探针的熔化温度(Tm)并稳定探针-靶标杂交体的小沟结合物(minor groove binder，MGB)部分。在一些实施例中，MGB的使用允许探针比传统探针更短，这可以提供更好的序列区分性和灵活性以容纳更多的靶标。
此外，本发明人发现花青染料的吲哚的苄基取代在花青染料的发射最大值中产生了出乎意料的大红移。例如，与不含苄基衍生物的染料相比，下面的苄基取代的染料红移了8nm，发射位移从697nm到705nm。
发射波长的这种红移使得苄基染料明显更容易从发射相似发射波长的其它染料中分辨出来。由于光谱重叠减少，当用于多重(如6重)qPCR应用时，苄基衍生物花青染料可以减少在相邻波长发射的染料之间的串扰，并且可以最大程度的减少与其信号去卷积相关的噪声。通过允许使用更大的检测窗口，最大程度的减少噪声还可以促进更高的检测灵敏度。在各个实施例中，所述苄基取代的染料被掺入所述探针中，并且其允许多重qPCR方法，包含6重qPCR。
在一个实施例中，所述探针包括上述荧光团/报告基因染料中的一个和上述淬灭剂中的一个，其中所述荧光团和淬灭剂各自共价结合到寡核苷酸上。适用于多重PCR应用的探针的实例可以包含如本文所述的在合适的波长激发时在红色光谱区域发射的羰花青报告基因染料。在红色光谱区域发射的羰花青染料的代表性实例包含，例如，可从赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得的Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 676、DyLight 647或DyLight 677以及其衍生物。在一个实施例中，荧光团和淬灭剂共价附接到寡核苷酸的末端。完全组装的探针的代表性实例如下：
所述探针可以根据本领域已知的方法合成。例如，在一个实施例中，荧光团和淬灭剂使用上述缀合化学物质和反应基团共价结合到寡核苷酸的末端。在另一个实例中，可以将所述淬灭剂或探针与固体载体缀合，并且使用标准的寡核苷酸合成方法(如DNA合成器)从附接的淬灭剂或探针合成寡核苷酸，然后将淬灭剂或探针中的另一个共价附接到合成的寡核苷酸的末端。在实例中提供了将淬灭剂附接到固体载体上的示例性实施例。
方法和试剂盒
在另一个方面，提供了使用所述探针进行单重或多重聚合酶链反应(如qPCR、终点PCR或RT-PCR)的方法和试剂盒。终点PCR是所有PCR循环完成后的分析。与允许在模板加倍时进行定量(指数阶段)的qPCR不同，终点分析基于扩增的平稳阶段。RT-PCR将RNA的反转录结合到DNA中(称为互补DNA或cDNA)，并使用聚合酶链反应(PCR)扩增特定cDNA靶标。在各个实施例中，RT-PCR和qPCR的组合通常用于核酸分析，例如在研究和临床环境中确定基因表达和病毒RNA的定量。然而，可以在没有qPCR的情况下使用RT-PCR，例如，以实现分子克隆、测序或对RNA的简单检测，并且可以在没有RT-PCR的情况下使用qPCR，例如，以对特定片段的DNA的拷贝数进行定量。
特别地，一种用于扩增和检测多种靶DNA序列的方法包括：提供包括所述探针的组合物或反应混合物；使反应混合物经受热柱化方案，使得所述多种靶序列的扩增可以发生；以及通过在多个扩增循环中至少一次检测所述探针的荧光来监测扩增。在一个实施例中，所述方法包括其中所述探针允许对第5和/或第6个核酸靶标进行检测的5重或6重多重PCR测定。
信号的检测可以使用检测荧光团荧光变化的任何试剂或仪器来完成。例如，可以使用任何分光光度热循环仪执行检测。分光光度热循环仪的实例包含但不限于应用生物系统公司(AB)
所述方法的一种或多种核酸靶标可以是技术人员已知的任何核酸靶标。此外，所述靶标可以是低突变区域或高突变区域。例如，本文公开的方法的一个特别有价值的用途涉及靶向高度突变的核酸(如RNA病毒基因)或高度遗传变异的区域(如单核苷酸多态性(SNP))。在一些实施例中，所述靶标可以是碎片或降解的，例如来自法医样品和/或固定组织的材料。所述靶标可以为任何适合放大的尺寸。本文提供的方法和组合物的一个特别有价值的用途涉及鉴定短片段(如siRNA和miRNA)。另一个特别有价值的用途是用于可能具有片段化和/或降解的核酸的样品，如固定样品或暴露于环境中的样品。因此，所述方法可以用于例如活组织检查组织和法医DNA。所述靶标可以是经过纯化的或未经纯化的。所述靶标可以在体外产生(例如，cDNA靶标)，或者可以在生物样品中发现(例如，RNA或基因组DNA(gDNA)靶标)。生物样品可以不经处理而使用，或者可以对生物样品进行处理以去除可能干扰本文公开的方法的物质。
本文提供的探针可用于诊断方法(例如，SNP检测、特定生物标志物的鉴定等)，由此所述探针与传染性疾病因子(例如人类疾病，包含但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌)的序列(例如基因组)互补，从而诊断来自患者的具有核酸的样品中传染性因子的存在。靶核酸可以是基因组或cDNA或mRNA或合成的，人或动物的，或微生物的，等等。在其它实施例中，探针可用于诊断或预测不是由感染因子引起的疾病或病症。例如，探针可用于通过鉴定人或动物样品中突变、多态性或等位基因的存在来诊断或预测癌症、自身免疫疾病、精神疾病、遗传疾病等。在一些实施例中，所述探针包括突变或多态性。此外，所述探针可用于评估或跟踪疾病或病症的治疗进展。
还提供了包括所述探针的组合物，如反应混合物或主混合物。在一个实施例中，用于PCR的组合物(如用于实时或定量PCR、终点PCR或RT-PCR的组合物)包括至少一种所述探针。在一个实施例中，用于PCR(例如，qPCR、终点PCR或RT-PCR)的组合物或反应混合物或主混合物包括允许检测4个靶核酸的探针和允许检测第5和/或第6个靶核酸中至少一个的所述探针，所述探针中的每一个由FRET供体部分(即荧光团)和FRET受体部分(即淬灭剂)组成，其中荧光团具有介于650与720nm之间的最大发射。本文所述淬灭剂的最大吸光度在660-668nm之间。本文所述淬灭剂的吸光度范围为530-730nm。在替代实施例中，提供了用于将所述荧光团和淬灭剂与所选的寡核苷酸缀合的标记试剂。
此外，这种组合物或反应混合物或主混合物可以包括一种或多种选自以下列表的化合物和试剂：适用于聚合酶链反应的缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、至少一对或几对扩增引物和/或另外的探针。
在又另一方面，提供了包括所述一种或多种探针中的至少一种的试剂盒。此外，所述试剂盒可以包括一种或若干种选自以下列表的其它化合物和试剂：适用于聚合酶链反应的缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、至少一对或多对扩增引物。所述试剂盒还可以包括内部对照DNA或标准。关于RT-PCR，所述试剂盒可以进一步包含逆转录酶。上述公开的组分中的每一种可以储存在单个储存容器中，并单独或一起包装。然而，用于存储在同一容器中的组分的任何组合也是可能的。
实例
根据以下反应方案，可以将淬灭剂化合物附接到固体载体(例如珠粒)以提供用于使用寡核苷酸合成仪构建探针的底物：
下面的示例性合成程序可以容易地推广到上述任何淬灭剂。因此，上面的反应方案和下面的程序并不旨在限制所要求保护的主题的范围。
在一个实施例中，代表性的衍生淬灭剂(2)可以根据以下程序合成。
代表性淬灭剂(1)将NHS酯(100mg，0.123mmol)溶解在1mL无水DCM中。将溶解在1213μL DCM(5％溶液)中的1-O-DMT-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(61mg，0.14mmol)与二异丙基乙胺(32μL，0.19mmol)混合。在室温下将所得溶液滴加到代表性淬灭剂(1)NHS酯中，并在氮气下搅拌30min。将DCM溶液中的粗代表性淬灭剂(2)用DCM(50mL)稀释，并且用1％柠檬酸、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，然后蒸发至干燥。进一步高真空干燥过夜，得到125mg(88％产率)的淬灭剂(2)，为深蓝色固体。无需进行进一步纯化将产物用于下一步。1HNMR(400MHz，CD2Cl2)：δ8.14(1H，d)、7.83(2H，m)、7.60(2H，d)、7.50-7.10(22H，m)、6.80(4H，m)、4.40(2H，m)、4.25(2H，m)、3.75(6H，s)、3.62–3.50(4H，m)、3.30(6H，m)、3.05(2H，m)、2.51(2H，t)、2.40(1H，t)、1.72(2H，d)、1.50–1.20(7H，m)。[M+]的LC/HRMS(ESI+)的计算值为1113.48；实际测量值为1113.47。用40％到100％乙腈(相对于0.1M乙酸三乙基铵)以20分钟线性梯度进行洗脱。流速为1.0ml/min。以285nm和655nm进行检测。
在另一个实施例中，包含二甘醇接头(3)的代表性淬灭剂可以根据下面的程序合成。
将代表性淬灭剂(2)(125mg，0.109mmol)溶解在3mL无水DCM中。加入DIPEA(47μL，0.27mmol)，然后加入二甘醇酐(25mg，0.22mmol)。将溶液在氮气下搅拌30min。将反应溶液浓缩，将残留物重新溶解在1％TEA/DCM中，并使用5-15％MeOH/DCM/1％TEA洗脱液在硅胶柱色谱上纯化(在10％-1％TEA/DCM中预先平衡)。将经过纯化的池浓缩，然后用1％柠檬酸、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，蒸发至干燥，然后在高真空下进一步干燥，得到代表性淬灭剂二甘醇接头(3)(96mg，69％产率)，为深蓝色固体。1H NMR(400MHz，CD2Cl2)：δ8.14(1H，d)、7.85(2H，m)、7.60(2H，d)、7.52–7.10(22H，m)、6.79(4H，d)、4.35(2H，m)、4.25(2H，m)、4.05(3H，s/m)、3.80(2H，s)、3.72(6H，s)、3.28(6H，m)、3.00(2H，m)、2.90(2H，m)、2.50(2H，t)、2.32(1H，t)、1.65(2H，m)、1.50–1.10(7H，m)。[M+]的LC/HRMS(ESI+)的计算值为1229.49；实际测量值为1229.49。用40％到100％乙腈(相对于0.1M乙酸三乙基铵)以20分钟线性梯度进行洗脱。流速为1.0ml/min。以285nm和655nm进行检测。
可以按照以下程序将代表性淬灭剂(4)连接到固体载体(例如，聚苯乙烯珠)。
将代表性淬灭剂二乙醇酸酯接头(3)(357mg，0.20mmol)溶解在50mL无水DMF中。向其中加入氨基甲基聚苯乙烯(6.77g，0.223mmol，33umol/g胺)、DIPEA(194uL，1.12mol)和COMU或1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲氨基-吗啉代-卡宾六氟磷酸盐(287mg，0.669mmol)。将混合物振荡3小时。除去溶剂，并将树脂分别用50mL DMF、MeCN和DCM洗涤3次。树脂上任何剩余的胺基然后通过与混合有50mL 1-N-甲基咪唑的THF溶液的50mL乙酸酐/吡啶的THF溶液反应来封端并振荡1小时。除去溶剂，并将树脂分别用THF、MeCN和DCM洗涤3次。然后将树脂在高真空下干燥过夜，得到6.60g浅蓝色粉末代表性淬灭剂(4)。使用茚三酮试验测试树脂载体的任何残留胺基，发现为0.94umol/g胺(可忽略不计)。偶联到载体上的代表性淬灭剂的量通过用已知体积的0.1M甲苯磺酸在MeCN中切割代表性淬灭剂PS样品的称重等分试样的DMT基团来确定。获得了498时的吸光度，并使用消光系数(76,500M-1cm-1)、质量和体积，发现每克聚苯乙烯中代表性淬灭剂的负载量为22μmol/g。发现这一偶联条件的典型范围为20-27μmol/g。
作为一个实例，如上所述的从非苄基取代的花青染料具有从697nm到705nm的发射位移的苄基取代的花青染料可以使用本领域公知的合成技术如下合成：
将1和对溴甲基苯甲酸甲酯的混合物在乙腈中搅拌回流加热48小时。将反应冷却至环境温度，并通过真空过滤除去不溶性固体。通过旋转蒸发除去溶剂，并通过用乙酸乙酯和己烷(5:1)洗脱的柱色谱法纯化2。将化合物2悬浮在甲醇中，并加入5当量的6M氢氧化钠。将混合物在55℃下加热8小时，直到通过使用EtOAc/己烷/AcOH(1:2:0.1)的TLC分析消耗掉2。通过旋转蒸发除去甲醇。将烧瓶在0-5℃的冰水浴中冷却，在搅拌下滴加浓HCl，使pH为5。用CHCl3萃取含水混合物，分离有机层，并且经Na2SO4干燥。通过过滤除去Na2SO4，并且通过旋转蒸发除去溶剂。通过使用EtOAc:己烷:AcOH(2:8:0.1)的柱色谱法纯化油状产物3。将化合物3与0.8当量的6-肼基-1,3-萘二磺酸4在乙酸中混合，并在搅拌下回流12小时。通过旋转蒸发除去乙酸，并且通过使用CH2Cl2:MeOH:H2O:AcOH(6.5:3:0.2:0.1)的硅胶柱色谱法纯化5。将化合物5与3当量的1,3-丙烷砜和2当量的乙酸钠混合，并在110℃加热1小时。向回流了一小时的残留物中加入乙腈。将溶液冷却并进行AcCN倾析，真空干燥后得到粗产物6。
将化合物6悬浮在甲醇HCl 0.5N中，并在搅拌下回流1小时。通过旋转蒸发除去溶剂。将残余物悬浮在甲醇中，加入1.1当量的乙酸钠，并且搅拌10分钟。通过旋转蒸发除去甲醇，并将残余物在真空下干燥。将残留物悬浮在含有0.1％二异丙基乙基胺和5当量甲基碘的DMF中，并加热且搅拌8小时。通过使用CH2Cl2:MeOH:AcOH(80:20:1)洗脱的柱色谱法纯化化合物8。将化合物8和1当量的丙醛双(苯基亚胺)一盐酸盐悬浮在乙酸中，并加入0.1当量的三乙胺。将混合物在110℃加热1小时。将反应冷却，并加入EtOH(约2x AcOH体积)，并用***沉淀粗产物9，并通过过滤收集。通过使用CH2Cl2:MeOH:AcOH(80:20:1)洗脱的柱色谱法纯化化合物9。将化合物10(20mg)悬浮在DMF(2mL)中。在搅拌下加入1当量的化合物9。加入乙酸酐(3.5当量)，然后在搅拌下加入三乙胺(6.4当量)，并将反应在室温下搅拌两小时。通过旋转蒸发浓缩溶液。向浓缩物中加入EtOAc并搅拌4-12小时。通过抽吸过滤收集蓝绿色固体。将固体悬浮在0.2M LiOH的水溶液中(15mg/1ml)，在室温下搅拌3小时。加入Dowex H+树脂50W-X8，H+，20-50目(0.5克树脂/1ml LiOH)，搅拌15分钟至中性，滤出染料溶液。通过使用CH2Cl2:MeOH:AcOH(80:20:1)洗脱的柱色谱法纯化染料11。
应当理解，虽然已经通过说明和实例的方式详细描述了前述实施例，但是在不脱离所要求保护的主题的精神和范围的情况下，许多修改、替换和变更是可能的。本文引用的每个参考文献中都通过引用以其整体并入本文。
在以下编号的条款中阐述了本公开另外的方面：
条款1.一种探针，其包括以下的缀合产物：
a)具有通式Ia、通式Ib、通式Ic或通式Id的染料
其中
当其存在时，R4、R13和R14以及R3中的每一个相同或不同并且选自由以下组成的组：H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合；
R5、R6、R7、R8、R9、R10、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
R2和R12中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
X选自由以下组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-O-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并***、-苯并***、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并***、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺、-NH(CH2CH2O)zCH2CH2N3、-NR-L-NH-CO-CH2-I和含叠氮化物(N3)的基团，其中R是-H或脂肪族或杂脂肪族基，z是1到5的整数、包含1和5，并且L选自由任选地被至少一个氧原子和/或硫原子取代的二价直链、交叉或环状烷基组成的组；
Kat是补偿花青带来的负电荷所需的一定量的Na+、K+、Ca2+、氨或其它一种或多种阳离子；
m是从0到5的整数、包含0和5；n是从1到3的整数、包含1和3；o是从0到12的整数、包含0和12；并且p是从0到5的整数、包含0和5；
b)具有通式II的淬灭剂
式II
其中
R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个相同或不同并且独立地选自H或SO3；
Z是OR，其中R是H或烷基或NH-L，其中L是并且Y是H或与固体载体的连接；
以及
c)连接所述染料和所述淬灭剂的寡核苷酸接头。
条款2.根据条款1所述的探针，其中：
R5、R6、R9和R10是SO3；
R7和R8是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是SO3；
m、o和p是3；并且n是2。
条款3.根据条款1所述的探针，其中：
R10是SO3；
R5、R6、R7、R8和R9是H；
R4、R13和R14是甲基；
R12是H；
R2是SO3；
m和o是3；并且n和p是2。
条款4.根据条款1所述的探针，其中：
R10是SO3；
R5、R6、R7、R8和R9是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是SO3；
m、o和p是3；并且n是2。
条款5.根据条款1所述的探针，其中：
R9和R10是SO3；
R5、R6、R7和R8是H；
R4、R13和R14是甲基；
R12是H；
R2是SO3；
m和o是3；并且n和p是2。
条款6.根据条款1所述的探针，其中：
R9和R10是SO3；
R5、R6、R7和R8是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是SO3；
m、o和p是3；并且n是2。
条款7.根据条款1所述的探针，其中：
R5、R6、R7、R8、R9和R10是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是H；
m和p是1；n是2；并且o是3。
条款8.根据条款1所述的探针，其中：
R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是H；
m和p是1；n是2；并且o是3。
条款9.根据条款1所述的探针，其中：
R17和R18是SO3；
R15、R16、R19、R20、R21和R22是H；
R4、R13和R14是甲基；
R2和R12是SO3；
m、o和p是3；并且n是2。
条款10.根据条款1所述的探针，其中：
R5、R6、R9和R10是SO3；
R7和R8是H；
R4、R13和R14是甲基；
R3是-C-苯甲酸酯；
R2是SO3，并且R12是H；
m是3；p是1；并且n是2。
条款11.根据条款1所述的探针，其中R23、R25、R26、R27、R29和R30中的每一个是H，并且R24和R28中的每一个是SO3。
条款12.根据条款1所述的探针，其中R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个是H。
条款13.根据条款1所述的探针，其中Z是CO2R，其中R是NH-L，L是
条款14.一种通过聚合酶链反应(PCR)对样品中的靶核酸分子进行检测或定量的方法，所述方法包括：
(i)使包括一个或多个靶核酸分子的样品与以下接触：a)至少一个具有至少部分地与所述靶核酸分子互补的序列的探针，其中所述至少一个探针在所述一个或多个靶核酸分子扩增时发生可检测的荧光变化；以及b)至少一个寡核苷酸引物对；
(ii)在足以扩增一个或多个靶核酸分子的条件下，将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起温育；以及
(iii)通过测量所述探针的荧光来检测经过扩增的靶核酸分子的存在或不存在或对所述经过扩增的靶核酸分子的量进行定量，其中所述探针包括以下的缀合产物：
a)具有通式Ia、通式Ib、通式Ic或通式Id的染料
其中
当其存在时，R4、R13和R14以及R3中的每一个相同或不同并且选自由以下组成的组：H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合；
R5、R6、R7、R8、R9、R10、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
R2和R12中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
X选自由以下组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-O-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并***、-苯并***、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并***、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺、NH(CH2CH2O)zCH2CH2N3、-NR-L-NH-CO-CH2-I和含叠氮化物(N3)的基团，其中R是-H或脂肪族或杂脂肪族基，z是1到5的整数、包含1和5，并且L选自由任选地被至少一个氧原子和/或硫原子取代的二价直链、交叉或环状烷基组成的组；
Kat是补偿花青带来的负电荷所需的一定量的Na+、K+、Ca2+、氨或其它一种或多种阳离子；
m是从0到5的整数、包含0和5；n是从1到3的整数、包含1和3；o是从0到12的整数、包含0和12；并且p是从0到5的整数、包含0和5；
b)具有通式II的淬灭剂
式II
其中
R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个相同或不同并且独立地选自H或SO3；
Z是OR，其中R是H或烷基或NH-L，其中L是并且Y是H或与固体载体的连接；
以及
c)至少一个连接所述染料和所述淬灭剂的寡核苷酸接头。
条款15.根据条款14所述的方法，其中所述PCR是实时或定量PCR(qPCR)。
条款16.根据条款14或条款15所述的探针，其中所述聚合酶是Taq聚合酶。
条款17.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述探针是水解探针。
条款18.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述探针是TaqMan探针。
条款19.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括突变。
条款20.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测稀有等位基因或SNP。
条款21.一种用于聚合酶链反应(PCR)的试剂盒，所述试剂盒包括：
探针，其包括以下的缀合产物：
a)具有通式Ia、通式Ib、通式Ic或通式Id的染料
其中
当其存在时，R4、R13和R14以及R3中的每一个相同或不同并且选自由以下组成的组：H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合；
R5、R6、R7、R8、R9、R10、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
R2和R12中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
X选自由以下组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-O-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并***、-苯并***、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并***、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺、NH(CH2CH2O)zCH2CH2N3、-NR-L-NH-CO-CH2-I和含叠氮化物(N3)的基团，其中R是-H或脂肪族或杂脂肪族基，z是1到5的整数、包含1和5，并且L选自由任选地被至少一个氧原子和/或硫原子取代的二价直链、交叉或环状烷基组成的组；
Kat是补偿花青带来的负电荷所需的一定量的Na+、K+、Ca2+、氨或其它一种或多种阳离子；
m是从0到5的整数、包含0和5；n是从1到3的整数、包含1和3；o是从0到12的整数、包含0和12；并且p是从0到5的整数、包含0和5；
b)具有通式II的淬灭剂
其中
R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个相同或不同并且独立地选自H或SO3；
Z是OR，其中R是H或烷基或NH-L，其中L是并且Y是H或与固体载体的连接；
以及
c)至少一个连接所述染料和所述淬灭剂的寡核苷酸接头；以及
以下中的一种或多种：缓冲剂、纯化介质、靶标、有机溶剂、酶和酶抑制剂。
条款22.根据条款21所述的试剂盒，其中所述PCR是实时或定量PCR(qPCR)。
条款23.根据条款21或条款22所述的试剂盒，其进一步包括用于进行实时或定量PCR(qPCR)的说明书。
条款24.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中组分被包装在单独的容器中。
条款25.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中两种或更多种组分以主混合物形式包装在一起。
条款26.一种试剂盒，其包括至少一种具有通式Ia、通式Ib、通式Ic或通式Id的染料
其中
当其存在时，R4、R13和R14以及R3中的每一个相同或不同并且选自由以下组成的组：H、脂肪族、杂脂肪族、磺基烷基、具有末端SO3的杂脂肪族、苄基和经过取代的苄基，其中所述经过取代的苄基包括至少一个羧基、至少一个磺酸基、-F、-Cl、-Br或其组合；
R5、R6、R7、R8、R9、R10、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
R2和R12中的每一个相同或不同并且选自由H和SO3组成的组；
X选自由以下组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-O-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并***、-苯并***、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并***、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺、NH(CH2CH2O)zCH2CH2N3、-NR-L-NH-CO-CH2-I和含叠氮化物(N3)的基团，其中R是-H或脂肪族或杂脂肪族基，z是1到5的整数、包含1和5，并且L选自由任选地被至少一个氧原子和/或硫原子取代的二价直链、交叉或环状烷基组成的组；
Kat是补偿花青带来的负电荷所需的一定量的Na+、K+、Ca2+、氨或其它一种或多种阳离子；
m是从0到5的整数、包含0和5；n是从1到3的整数、包含1和3；o是从0到12的整数、包含0和12；并且p是从0到5的整数、包含0和5；以及
至少一种具有通式II的淬灭剂
其中
R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29和R30中的每一个相同或不同并且独立地选自H或SO3；
Z是OR，其中R是H或烷基或NH-L，其中L是并且Y是H或与固体载体的连接。
条款27.根据条款26所述的试剂盒，其进一步包括用于将所述至少一种染料和所述至少一种淬灭剂与寡核苷酸缀合的另外的组分。
条款28.根据条款26或条款27所述的试剂盒，其进一步包括用于将所述至少一种染料和所述至少一种淬灭剂与寡核苷酸缀合的说明书。
条款29.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中所述组分被包装在单独的容器中。
条款30.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述含叠氮化物的基团包括具有末端叠氮化物的脂肪族接头。
条款31.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述具有末端叠氮化物的脂肪族接头选自NH-CH2-CH2-CH2-N3或NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N3。
条款32.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述含叠氮化物的基团包括具有末端叠氮化物的脂肪族接头。
条款33.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述具有末端叠氮化物的脂肪族接头选自NH-CH2-CH2-CH2-N3或NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N3。
条款34.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中所述含叠氮化物的基团包括具有末端叠氮化物的脂肪族接头。
条款35.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中所述具有末端叠氮化物的脂肪族接头选自NH-CH2-CH2-CH2-N3或NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N3。
条款36.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中所述含叠氮化物的基团包括具有末端叠氮化物的脂肪族接头。
条款37.根据前述条款中任一项所述的试剂盒，其中所述具有末端叠氮化物的脂肪族接头选自NH-CH2-CH2-CH2-N3或NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N3。
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