具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请中的术语“第一”和“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或模块的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤或模块，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或模块。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

本申请实施例提供了一种上尿路尿路上皮癌类器官的培养方法，以下将进行详细说明。需要说明的是，以下各个实施例的描述先后顺序并不构成对具体实施先后顺序的限定。

请参阅图1，图1是本申请实施例提供的上尿路尿路上皮癌类器官的培养方法的流程示意图。该上尿路尿路上皮癌类器官的培养方法的具体流程可以如下：

101、将上尿路尿路上皮癌组织小块置于含有Ⅱ型胶原酶的抑制剂中进行第一消化处理，得到第一消化物。

在一些实施例中，在步骤将上尿路尿路上皮癌组织小块置于含有Ⅱ型胶原酶的抑制剂中进行第一消化处理，得到第一消化物之前，可以将获得的离体癌组织在无菌条件下用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)冲洗两次。

然后，再随机从该离体癌组织上剪取一小块放置在10％的中性甲醛中固定，用以组织病理学分析和免疫荧光染色，另外，还可以再随机剪取一小块用于基因组学测序，从而得到如图2、图3和图4。

之后，再将该离体癌组织的剩余部分在10cm的组织培养板中剪碎至小于2mm的上尿路尿路上皮癌组织小块。

需要说明的是，Ⅱ型胶原酶的浓度为5mg/ml。该抑制剂为ROCK抑制剂Y-27632。该抑制剂的浓度为10μM。

在本申请实施例中，第一消化处理可以为在环境温度为37摄氏度时，将上尿路尿路上皮癌组织小块置于含有Ⅱ型胶原酶的抑制剂中消化1小时。可以理解的是，该第一消化处理的时长可以根据实际情况进行设定，本申请实施例并未将第一消化处理的时长限定为1小时。

102、将第一消化物置于含有抑制剂的胰酶替代物中进行第二消化处理，得到第二消化物。

在一些实施例中，在步骤“将上尿路尿路上皮癌组织小块置于含有Ⅱ型胶原酶的抑制剂中进行第一消化处理，得到第一消化物”之后，还可以包括：

对第一消化物进行洗涤处理。

具体的，可以采用营养混合液Ad DMEM/F12对该第一消化物进行洗涤处理。

需要说明的是，该抑制剂为ROCK抑制剂Y-27632。该抑制剂的浓度为10μM。该胰酶替代物为TrypLE Express。

其中，该第二消化处理的时长的预设值可以为5min。该预设值可以根据实际情况进行设定，本申请实施例并未将第二消化处理的时长限定为5min。

103、对第二消化物依次进行第一中和处理、过滤处理和离心处理，得到单细胞沉淀。

具体的，当第二消化处理的时长达到预设值时，可以采用体积为第二消化物两倍的中和培养基进行第一中和处理，以使第二消化处理停止。然后，再将该第二消化物通过70um的细胞滤器进行过滤，以去除未消化的细胞团块，得到单细胞悬液。之后，可以对该单细胞悬液进行离心处理，从而得到单细胞沉淀。

其中，该中和培养基可以由培养基Advanced DMEM/F12、1％的Antibiotic-Antimycotic、1％的GlutaMAX、1％的HEPES、10μM的Y-27632ROCK抑制剂和20％的胎牛血清组成。

需要说明的是，该中和培养基中各组成部分的浓度可以根据实际情况进行调整。

104、将单细胞沉淀置于预设培养基和基底胶的混合基底中进行重悬处理，得到含有所有细胞的凝胶悬液。

具体的，可以在冰浴的条件下，将单细胞沉淀置于预设培养基和基底胶的混合基底中进行重悬处理，从而得到含有所有细胞的凝胶悬液。

其中，基底胶为Matrigel。

其中，该预设培养基可以由培养基Advanced DMEM/F12、1％的Antibiotic-Antimycotic、1％的GlutaMAX、1％的HEPES缓冲液以及特异性添加因子组成。该预设培养基可以有效降低上尿路尿路上皮癌类器官培养过程中的微生物污染风险并维持环境的pH稳定。

其中，该特异性添加因子可以包括成纤维生长因子(FGF-10)10ng/ml、成纤维生长因子9(FGF-9)100ng/mL、A83-01 500 nM/ml，SB202190 10μM/ml、Noggin重组蛋白100ng/ml、Rspondin-1重组蛋白250ng/ml、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)1.25mM、烟酰胺(Nicotinamide)10mM/ml、1×B27补充剂、Rho相关蛋白激酶(Rho-associated kinases,ROCK)抑制剂Y2763210uM。

需要说明的是，上述各组成部分的浓度可以根据实际情况进行调整。

105、将凝胶悬液按照预设方案进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官。

具体的，可以将凝胶悬液接种至六孔板中进行孵育，得到固化凝胶；然后将固化凝胶置入预设培养基中进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官。

在一些实施例中，步骤“将固化凝胶置入预设培养基中进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官”可以包括：

将固化凝胶置入预设培养基；

将预设培养基置入具有预设环境的培养箱中，以对固化凝胶进行培养；

每间隔第一预设时长对预设培养基进行更换；

当对固化凝胶培养第二预设时长后，得到上尿路尿路上皮癌类器官，第二预设时长大于第一预设时长。

需要说明的是，该预设环境可以为37摄氏度及5％的二氧化碳。该第一预设时长为2-3天。第二预设时长为4-10天。可以理解的是，第一预设时长和第二预设时长可以根据实际情况进行设定。

在一些实施例中，步骤“将凝胶悬液接种至六孔板中进行孵育，得到固化凝胶”可以包括：

将凝胶悬液以预设容积/每滴接种至六孔板中孵育第三预设时长；

当凝胶悬液成型后，将成型后的凝胶悬液进行翻转，并孵育第四预设时长，得到固化凝胶。

需要说明的是，在将凝胶悬液接种至六孔板中时，接种的环境温度为37摄氏度。该预设容积可以30μL。该第三预设时长可以为1-2min。该第四预设时长为8-10min。

可以理解的是，第三预设时长和第四预设时长可以根据实际情况进行设定。

在一些实施例中，在步骤“将凝胶悬液按照预设方案进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官”之后，还可以包括：

当上尿路尿路上皮癌类器官成长至预设规模时，从六孔板上刮下上尿路尿路上皮癌类器官；

对上尿路尿路上皮癌类器官进行第一预设处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞。

在本申请实施例中，该预设规模可以为肉眼可见，即是，当上尿路尿路上皮癌类器官成长至肉眼可见时，从六孔板上刮下上尿路尿路上皮癌类器官。

在一些实施例中，步骤“对上尿路尿路上皮癌类器官进行第一预设处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞”可以包括：

对上尿路尿路上皮癌类器官进行离心处理，以去除附着在上尿路尿路上皮癌类器官上的预设培养基；

将离心处理后的上尿路尿路上皮癌类器官置于含有抑制剂的胰酶替代物中依次进行第三消化处理，得到第三消化物；

对第三消化物进行第二预设处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞。

需要说明的是，该第三消化处理与第二消化处理相同，在此不再一一赘述。可以理解的是，含有抑制剂的胰酶替代物也与上述实施例中的含有抑制剂的胰酶替代物相同。

在一些实施例中，步骤“对第三消化物进行第二预设处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞”可以包括：

对第三消化物进行第二中和处理和离心处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞团；

捣碎上尿路尿路上皮癌类器官细胞团，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞。

需要说明的是，该第二中和处理与上述实施例中的第一中和处理相同。

具体的，在对第三消化物进行第二中和处理和离心处理之后，可以得到具有上尿路尿路上皮癌类器官细胞团的溶液。之后，再吸取具有上尿路尿路上皮癌类器官细胞团的溶液的上清，从而得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞团。

可以理解的是，在捣碎上尿路尿路上皮癌类器官细胞团的过程中，可以重复多次，直至上尿路尿路上皮癌类器官细胞团被捣碎。

在一些实施例中，在步骤“捣碎上尿路尿路上皮癌类器官细胞团，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞”之后，还可以包括：

将上尿路尿路上皮癌类器官细胞置于预设培养基和基底胶的混合基底中进行重悬处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞的凝胶悬液；

返回执行将凝胶悬液按照预设方案进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官的步骤，以对上尿路尿路上皮癌类器官进行传代培养。

需要说明的是，本实施例中的预设培养基和基底胶与上述实施例中的预设培养基和基底胶完全相同。

需要说明的是，在进行第一次传代培养之后，可以根据上尿路尿路上皮癌类器官的生长状况，每隔2-3周传代一次。

在一些实施例中，在步骤“对第三消化物进行第二中和处理和离心处理，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞团”之后，步骤“捣碎上尿路尿路上皮癌类器官细胞团，得到上尿路尿路上皮癌类器官细胞”之前，还可以包括：

将上尿路尿路上皮癌类器官细胞团置于细胞冻存液中进行重悬处理，并将细胞冻存液置于冻存管中，再将冻存管放置于冻存盒中；

将冻存管放置于冻存盒中的时长达到第五预设时长时，将冻存管放置于液氮中进行保存。

需要说明的是，该第五预设时长可以根据实际情况进行设定。比如，该预设时长可以为12小时、8小时、4小时等。其中，冻存盒所处的环境温度为-80摄氏度。

其中，该细胞冻存液为含10μM Y-27632的freezing cell recovery。该冻存管的体积可以为1.5ml。

需要说明的是，本申请实施例提供的培养方法不仅仅可以应用到上尿路尿路上皮癌类器官的培养中。该培养方法还可以应用到其他癌类器官的培养中。

比如，本申请实施例中的该上尿路尿路上皮癌组织小块可以替换为结肠癌组织小块、胰腺癌组织小块、肝癌组织小块或膀胱癌组织小块等等。即，在本申请实施例中，上尿路尿路上皮癌类器官可以替换为结肠癌类器官、胰腺癌类器官、肝癌类器官或膀胱癌类器官等。

综上，本申请提供的上尿路尿路上皮癌类器官的培养方法通过将上尿路尿路上皮癌组织小块置于含有Ⅱ型胶原酶的抑制剂中进行第一消化处理，得到第一消化物；将第一消化物置于含有抑制剂的胰酶替代物中进行第二消化处理，得到第二消化物；对第二消化物依次进行第一中和处理、过滤处理和离心处理，得到单细胞沉淀；将单细胞沉淀置于预设培养基和基底胶的混合基底中进行重悬处理，得到含有所有细胞的凝胶悬液；将凝胶悬液按照预设方案进行培养，得到上尿路尿路上皮癌类器官。通过本方案得到的上尿路尿路上皮癌类器官是具有与实体肿瘤类似的组织结构和功能的三维细胞团，高度保留了患者肿瘤内部的异质性，从而可以为化疗药物的使用及肿瘤的个性化治疗提供可靠的临床数据。

以上对本申请实施例所提供的上尿路尿路上皮癌类器官的培养方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。