具体实施方式

本文提供了用于清洁或再生色谱树脂的方法。本发明的方法可以用于小规模和大规模(例如，制造规模)色谱树脂的再生。目前接受的用于清洁色谱树脂的方法包括使用磷酸的酸性汽提步骤。本发明基于令人惊讶且出乎意料的发现，即可以在不使用烈性(harsh)试剂(例如，磷酸)的情况下将色谱树脂清洁。使用能够清洁基于二氧化硅或甲基丙烯酸酯的固定相上的污物但不能清洁基于琼脂糖的固定相上的污物的磷酸会导致由系统堵塞引起的压力增加，这可能导致产率衰减。

定义

如本文所用，术语“色谱法”是指一种动态分离技术，其将目标分子诸如目标蛋白(例如，免疫球蛋白或另一种含Fc蛋白)与混合物中的其他分子分离并且允许将其分离出。典型地，在色谱方法中，液体流动相将含有目标的目的分子的样品输送跨过或穿过固定相(通常为固体)介质。对固定相的分配或亲和力差异引起选定分子与固定相的暂时结合，而流动相在不同时间携带不同分子。

如本文所用，术语“亲和色谱法”是指一种色谱模式，其中有待分离的目标分子诸如蛋白质分子(例如，含Fc蛋白)通过其与固定在色谱树脂上的分子(例如，基于蛋白A的配体)的“锁与钥”相互作用而被分离出。这种特定的相互作用允许目标分子结合，而不希望的分子流过。改变流动相的温度、pH或离子强度然后使目标分子以高纯度释放。在本文所述的各种实施方案中，亲和色谱法涉及将含有目标分子(例如，免疫球蛋白或另一种含Fc蛋白)的样品添加到固体支持物上，所述固体支持物在其上携带蛋白A(称为蛋白A亲和色谱介质或树脂)的基于C结构域(或在一些情况下，经修饰的B结构域)的配体。用于亲和色谱仪的其他配体可以包括来自链球菌的蛋白G，其与免疫球蛋白的Fc区结合。

如本文所用，术语“蛋白A亲和色谱法”是指使用蛋白A分离(separation)或分离出(isolation)物质，蛋白A是在金黄色葡萄球菌(Staphylococcous aureus)细胞壁中发现的蛋白质，其能够在Fc区处与免疫球蛋白结合。蛋白A固定在固体支持物上并且与目的蛋白接触。

术语“固体支持物”通常是指配体所附接的任何树脂(多孔或无孔)。配体与固体支持物的附接可以通过共价键，诸如在接枝的情况下(经由醚、硫醚、碳-碳键或其他连接)，或通过包被、粘附、吸附和类似机制。用于本文所述方法的示例性固体支持物包括多糖、琼脂糖、聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。

本领域已知的蛋白A亲和色谱树脂的例子包括具有固定在可控孔度玻璃骨架上的蛋白A的那些，例如PROSEP^TM介质/树脂(EMD MILLIPORE)；具有固定在聚苯乙烯固相上的蛋白A的那些，例如POROS^TM MabCapture^TMA介质/树脂(APPLIED BIOSYSTEMS.INC.)；和具有固定在琼脂糖固体支持物上的蛋白A的那些，例如r蛋白ASEPHAROSE FAST FLOW^TM或MABSELECT^TM介质或树脂(GE HEALTHCARE)。

如本文可互换使用的术语“亲和树脂”或“亲和色谱树脂”或“亲和介质”或“亲和层析介质”是指与固体支持物附接的亲和色谱配体(例如，基于蛋白A)，例如像本文所述的那些(导致例如蛋白A亲和树脂或蛋白A树脂)。通常，术语“亲和树脂”和“亲和介质”在本文中可互换使用。亲和色谱树脂的其他例子包括具有能够与免疫球蛋白的Fc区结合的来自链球菌的蛋白G的树脂。还包括具有蛋白L的亲和树脂，蛋白L经由κ轻链结合免疫球蛋白。这些蛋白质可以用于亲和色谱法以纯化与这些亲和树脂特异性结合的免疫球蛋白或其他蛋白质。

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖天然修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；干预是例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义中还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖抗体和含有Fc结构域的多肽(例如，免疫粘附素)。

如本文可互换使用的术语“目标蛋白”或“目的蛋白”是指可以使用亲和树脂纯化的任何蛋白质，例如对于蛋白A的含有Fc的分子。在各种实施方案中，目标蛋白是含Fc蛋白，例如免疫球蛋白或Fc融合蛋白。

术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(本文可互换使用)是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)构成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3构成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)构成。VH区和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。重链可以具有或不具有C末端赖氨酸。除非本文另外指定，否则可变区中的氨基酸使用Kabat编号系统编号，并且恒定区中的氨基酸使用EU系统编号。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；以及全合成抗体。

免疫球蛋白或抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以例如以单体或聚合物形式存在。以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。与“抗体”结合使用的术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分(part)或部分(portion)，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基。片段可以通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理获得。片段也可以通过重组手段获得。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fc和/或Fv片段。有待纯化的抗体或片段可以是人的、人源化的或嵌合的。

应当理解，使用本文所述方法纯化的目标蛋白是含有Fc区并且因此适于通过蛋白A或来自链球菌的蛋白G来纯化的蛋白质。如本文所用，术语“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白分子的与蛋白A相互作用的那些氨基酸残基。Fc区是抗体的可结晶尾部区域，并且与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用。

术语“Fc结合”、“与Fc部分结合(binds to an Fc portion)”或“与Fc部分结合(binding to an Fc portion)”是指本文所述的亲和配体与抗体恒定结构域(Fc)结合的能力。在一些实施方案中，根据本发明的配体以至少10^-7M、或至少10^-8M、或至少10^-9M的亲和力结合抗体(例如，人IgG1、IgG2或IgG4)的Fc部分。

如本文所用，术语“一个或多个片段”还可以指全长含Fc蛋白(例如，免疫球蛋白)的一部分。片段的例子包括Fab片段、单链抗体分子、双体抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文对“约”值或参数的提及包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。提及“约X”的描述还包括“X”的描述。

当在本文和所附权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“或(or)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。应理解，本文所述的发明的各方面和变型包括“包含多个方面和变型”、“由多个方面和变型组成”和/或“基本上由多个方面和变型组成”。

本发明的方法

色谱树脂的清洁

本发明提供一种有效再生或清洁亲和色谱树脂的方法。使用本发明方法导致更有效的清洁过程，这进而导致树脂材料的寿命增加。本发明的更有效的清洁方法允许亲和树脂的扩展性能用于蛋白质产品的大规模生产。

如本文所用，术语“清洁”是指在纯化目标蛋白(例如，免疫球蛋白或另一种含Fc蛋白)的过程期间的步骤，其需要去除残留在例如在柱(例如，蛋白A柱)中的亲和色谱树脂上的杂质和污物以便保持树脂的性能。虽然清洁步骤从树脂上去除杂质，但在理想情况下它对树脂完整性的影响应最小，如使用结合能力(树脂可以纯化的目标蛋白的量)和/或分辨率(树脂将目标蛋白与不希望的实体分离的能力)测量的。通常，使用含有磷酸的溶液或使用NaOH的碱性溶液清洁可商购的亲和色谱树脂(例如，使用葡萄球菌蛋白A或其衍生物)。例如MabSelect SuRe^TM。用稀释的NaOH清洗蛋白A柱。另一方面，Prosep^TM。通常使用磷酸清洗蛋白A柱。

术语“结合能力”是指将与在限定条件下运行的柱中填充的限定体积的树脂或介质结合的分子的量。结合能力可以测量为静态结合能力或动态结合能力。在静态结合能力的情况下，确定当分子和树脂接触无限量的时间时与限定体积的树脂结合的分子的量。静态结合能力测量树脂可以结合的目标分子的最高量。在实践中，所述值通常是通过在最小或没有流动的情况下使过量的目标分子与树脂接触等于或长于4小时而获得的。在另一方面，动态结合能力是在设定的流速下树脂可以结合的目标分子的量/体积树脂。任何树脂的动态结合能力都高度依赖于基础条件。通常，流速越低，动态结合能力越高。随着流速接近零，结合能力接近最大可用能力-静态结合能力。在没有适当的清洁和卫生处理的情况下，亲和树脂的结合能力典型地在多次结合和洗脱循环后下降至低于初始值。当结合能力低于在色谱方法/过程开发期间设定的某个值时，显著量的目标蛋白可能“突破”或与含有杂质的流过级分共洗脱，导致产物损失。使用合适的化学品进行适当的清洁可以在延长的时间段内维持树脂的结合能力。

蛋白A亲和树脂的清洁通常在每次循环后实践，以确保树脂将在树脂的整个生命周期内一致地进行纯化，或者换句话说，以便保留树脂的结合能力。清洁对于蛋白A亲和色谱树脂尤为重要，原因有二：(1)与离子交换或疏水相互作用(HIC)树脂相比，蛋白A树脂具有高的初始成本；和(2)蛋白A色谱树脂典型地暴露于含有较高水平的杂质的澄清细胞培养物。因此，一些残余的杂质可能与蛋白A树脂结合，从而导致在重新使用树脂时结合能力的损失或洗脱池杂质的增加。这在制造环境中是非常不希望的，因为它导致降低的生产力(由于结合能力降低)和较差的产物纯度。因此，每个蛋白A结合和洗脱循环后的常规清洁对于确保一致的树脂性能至关重要，所述一致的树脂性能导致一致的产物纯度和过程吞吐量。

如本文所用，术语“循环”或“亲和循环”或“蛋白A亲和色谱法纯化循环”是指多步骤过程，其开始于使用亲和树脂的色谱柱与中性缓冲液的平衡；然后是将澄清的细胞培养物进料负载到柱中，其中澄清的细胞培养物进料含有有待纯化的目标蛋白。在蛋白A亲和树脂的情况下，目标蛋白可以是有待纯化的含Fc蛋白(例如，单克隆抗体)；然后是将柱用一种或多种(通常是三种)不同的缓冲液洗涤以去除松散结合的杂质，这不会干扰目标蛋白与配体的结合，或例如含Fc蛋白与蛋白A树脂的结合；然后是使用洗脱缓冲液(例如，具有2.5-4.5的pH)从亲和树脂上洗脱目标蛋白，例如从蛋白A树脂上洗脱含Fc蛋白质。这种平衡、负载、洗涤和洗脱的多步骤过程构成循环或结合和洗脱循环。循环之后典型地是清洁步骤，以在下一个循环之前去除柱上痕量水平的杂质。

在本文所述的一些实施方案中，使用包含乙酸和苯甲醇的第一洗涤缓冲液和包含氢氧化钠、柠檬酸钠和苯甲醇的第二洗涤缓冲液进行树脂清洁。如本文所用的与清洁相关的术语“洗涤缓冲液”是指在洗脱目标蛋白后流过固体支持物(例如，具有固定的蛋白A)的缓冲液。

在一些实施方案中，在每个循环后使色谱树脂与第一缓冲液和第二缓冲液两者接触。在其他实施方案中，在一个循环后使色谱树脂与第一缓冲液或第二缓冲液接触，使得在纯化活动中第一缓冲液和第二缓冲液以交替方式使用。在一些实施方案中，使色谱树脂与第二缓冲液接触并且然后与第一缓冲液接触。

本发明提供了用于本发明方法的缓冲液。本发明的第一缓冲液不含磷酸。在一个实施方案中，第一缓冲液可以包含例如约100-300mM乙酸、或约125-250mM乙酸、或约150-200mM乙酸、或约167mM乙酸。第一缓冲液还可以包含约2％-4％(v/v)苯甲醇、或约2.5％-3.5％(v/v)苯甲醇、或约2％-3％(v/v)苯甲醇、或约1.5％-2.5％(v/v)苯甲醇、或约1％-2％(v/v)苯甲醇、或约2％(v/v)苯甲醇。在一个实施方案中，第一缓冲液包含167mM乙酸和约2％(v/v)苯甲醇。

在另一个实施方案中，本发明提供了第二缓冲液，其用于减少微生物污染负担和任选地制备用于储存的树脂。本发明的第二缓冲液可以包含例如约50-400mM、或约100-350mM、或约150-300mM、或约100-300mM、或约100-300mM、或约200mM的氢氧化钠。第二缓冲液还可以包含约50-400mM、或约100-350mM、或约150-300mM、或约100-300mM、或约100-300mM、或约200mM的柠檬酸钠。第二缓冲液还可以包含约0.5-3％(v/v)、或约0.5-1.5％(v/v)、或约1-2％(v/v)、或约1.5-2.5％(v/v)、或约1％(v/v)的苯甲醇。第二缓冲液的非限定性例子是约200mM氢氧化钠、200mM柠檬酸钠和1％(v/v)苯甲醇。

在一个实施方案中，色谱树脂位于色谱柱内。在一些实施方案中，以至少两个、三个、四个或五个柱体积洗涤柱。在一些实施方案中，用第一缓冲液和第二缓冲液洗涤柱，直到没有或基本上没有杂质进一步从柱上洗脱下来。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约50个材料体积/h、40个材料体积/h或30个材料体积/h中的任一者。流速可以在约5个材料体积/h与50个材料体积/h、10个材料体积/h与40个材料体积/h、或18个材料体积/h与36个材料体积/h中的任一者之间。在一些实施方案中，流速是约9个材料体积/h、18个材料体积/h、25个材料体积/h、30个材料体积/h、36个材料体积/h、或40个材料体积/h中的任一者。

在一些实施方案中，流速小于约90个柱体积(CV)/小时；80CV/h；70CV/h；60CV/h；50CV/h；40CV/h或30CV/h中的任一者。流速可以在约5CV/h与50CV/h、10CV/h与40CV/h、或18CV/h与36CV/h中的任一者之间。在一些实施方案中，流速是约9CV/h、18CV/h、25CV/h、30CV/h、36CV/h、或40CV/h中的任一者。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约100cm/h、75cm/h、或50cm/h中的任一者。流速可以在约25cm/h与150cm/h、25cm/h与100cm/h、50cm/h与100cm/h、或65cm/h与85cm/h中的任一者之间。

此外，本发明的方法导致柱再生的时间节省。在一些实施方案中，与清洁缓冲液接触的时间从典型的75分钟减少到30分钟或甚至约9分钟，从而允许在短的时间段内使用相同的树脂进行另外的多次另外纯化。

污染物

在本文所述方法的一些实施方案中，至少一种污染物可以是以下中的任一种或多种：宿主细胞材料；浸出的蛋白A；核酸；所希望的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分；羧肽酶B；庆大霉素等。在一些例子中，污染物可以是宿主细胞蛋白(HCP)，所述宿主细胞蛋白来自例如但不限于细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞，鸟类细胞、真菌细胞。

浸出的蛋白A是从其结合的固相脱离或洗涤的蛋白A。例如，浸出的蛋白A可以从蛋白A色谱材料中浸出。可以例如使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白A的量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，浸出的蛋白A的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者。浸出的蛋白A的量可以减少约10％与99％、30％与95％、30％与99％、50％与95％、50％与99％、75％与99％、或85％与99％中的任一者之间。在一些实施方案中，浸出的蛋白A的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％中的任一者。在一些实施方案中，减少量通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中的浸出的蛋白A的量与在所述一个或多个纯化步骤之前的组合物中的浸出的蛋白A的量进行比较来确定。

宿主细胞蛋白(HCP)是来自产生多肽的细胞的蛋白质。HCP的量可以通过ELISA或Meso Scale Discovery(“MSO”)来测量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，在模拟洗脱中，洗出液中的HCP量最少。在一些实施方案中，在用和不用清洁方法的情况下或在清洁方法之前和之后比较来自模拟洗脱的洗出液中宿主细胞蛋白的水平。

测量DNA诸如宿主细胞DNA的方法是本领域已知的。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，DNA的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者。DNA的量可以减少约10％与99％、30％与95％、30％与99％、50％与95％、50％与99％、75％与99％、或85％与99％中的任一者之间。DNA的量可以减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一者。在一些实施方案中，减少量通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中的DNA的量与在所述一个或多个纯化步骤之前的组合物中的DNA的量进行比较来确定。

片段多肽可以是低分子量(LMW)蛋白质。在一些实施方案中，片段化多肽是目的多肽的片段。LMW蛋白质的例子包括但不限于Fab(片段抗原结合)、Fc(片段，可结晶)区或两者的组合或目的抗体的任何随机片段化部分。测量片段化蛋白(例如，LMW蛋白质)的方法是本领域已知的并且在实施例部分中进行了描述。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，LMW蛋白质的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％中的任一者。LMW蛋白质的量可以减少约10％与99％、30％与95％、30％与99％、50％与95％、50％与99％、75％与99％、或85％与99％中的任一者之间。LMW蛋白质的量可以减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％中的任一者。在一些实施方案中，减少量通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中的片段化蛋白(例如，LMW蛋白质)的量与在所述一个或多个纯化步骤之前的组合物中的片段化蛋白(例如，LMW蛋白质)的量进行比较来确定。

聚集的多肽可以是高分子量(HMW)蛋白质。在一些实施方案中，聚集的多肽是目的多肽的多聚体。HMW蛋白质可以是目的多肽的二聚体、最多达8X单体或更大。测量聚集的蛋白质(例如，HMW蛋白质)的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，模拟洗脱中的HMW水平是最低的；例如小于约5ppm、小于约4ppm、小于约3ppm、小于约2ppm或小于约1ppm。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，聚集的蛋白质的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％中的任一者。聚集的蛋白质的量可以减少约10％与99％、30％与95％、30％与99％、50％与95％、50％与99％、75％与99％、或85％与99％中的任一者之间。聚集的蛋白质的量可以减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％中的任一者。在一些实施方案中，减少量通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中的聚集的蛋白质(例如，HMW蛋白质)的量与在所述一个或多个纯化步骤之前的组合物中的聚集的蛋白质(例如，HMW蛋白质)的量进行比较来确定。

细胞培养基组分是指存在于细胞培养基中的组分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基组分是庆大霉素。庆大霉素的量可以通过ELISA测量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，细胞培养基组分的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任何一者。细胞培养基组分的量可以减少约10％与99％、30％与95％、30％与99％、50％与95％、50％与99％、75％与99％、或85％与99％中的任一者之间。在一些实施方案中，细胞培养基组分的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或98％中的任一者。在一些实施方案中，减少量通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中的细胞培养基组分的量与在所述一个或多个纯化步骤之前的组合物中的细胞培养基组分的量进行比较来确定。

多肽

本发明的方法可以用于清洁用于纯化多种多肽制剂的色谱材料。在一些实施方案中，色谱材料以大规模使用；例如，多肽诸如抗体或其片段的制造规模生产。在一些实施方案中，将色谱材料用于纯化第一多肽，诸如第一抗体，然后通过本发明的方法清洁所述材料，并且然后可以将色谱材料用于纯化第二多肽，诸如第二抗体。在一些实施方案中，清洁是有效的，使得包含第二纯化多肽的制剂基本上不含第一多肽。在一些实施方案中，包含第二纯化多肽(例如，第二抗体)的制剂包含小于1ppm的第一多肽(例如，第一抗体)。在一些实施方案中，第二纯化多肽包含小于1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm或100ppm中的任一者的第一多肽。

在一些实施方案中，本发明的方法用于重复使用用于纯化治疗性多肽的色谱材料。在一些实施方案中，多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，多肽是激动剂。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，多肽是带标签的表位。在一些实施方案中，多肽保留生物学和/或免疫学活性。在一些实施方案中，多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，多肽启动补体依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，多肽是抗体或免疫粘附素。

有待使用通过本文所述方法清洁的再生色谱材料纯化的多肽通常使用重组技术产生。用于生产重组蛋白的方法描述于，例如美国专利号5,534,615和4,816,567，将其特别通过引用并入本文。

多肽可以在真核细胞或原核细胞中重组产生。蛋白质可以源自基因工程植物、转基因动物，或者可以由适应在细胞培养物中生长的生产细胞分泌。生产细胞可以是细菌(例如，大肠杆菌、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)和芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.))、真菌(例如，曲霉属(Aspergillus))、源自无脊椎动物的(例如，昆虫)或哺乳动物。工业中常用的哺乳动物细胞的例子是CHO、VERO、BHK、HeLa、CV 1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠)、PC12和W138细胞。特别优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其广泛用于生产若干种复杂重组蛋白，例如细胞因子、凝血因子和抗体(Brasel等人,1996,Blood 88:2004-2012；Kaufman等人,1988,J.Biol Chem 263:6352-6362；McKinnon等人,1991,J Mol Endocrinol 6:231-239；Wood等人,1990,J.Immunol 145:3011-3016)。二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型突变细胞系(Urlaub等人,1980,Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220)、DXB11和DG-44是首选的CHO宿主细胞系，因为有效的DHFR可选择和可扩增的基因表达系统允许在这些细胞中进行高水平的重组蛋白表达(Kaufman R.J.,1990,MethEnzymol 185:527-566)。另外，这些细胞易于作为贴壁或悬浮培养物进行操纵，并且展现出相对好的遗传稳定性。CHO细胞和其中表达的重组蛋白已被广泛表征，并且已被监管机构批准用于临床制造。

可以从培养基或宿主细胞裂解物中回收有待使用通过本文所述方法清洁的再生色谱材料纯化的多肽。用于表达多肽的细胞可以通过各种物理或化学手段(诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂)来破碎。如果多肽是在细胞内产生的，则作为第一步骤，通过例如离心或超滤来去除作为微粒碎片的宿主细胞或裂解片段)。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于将分泌到大肠杆菌的周质空间的多肽分离出的程序。简而言之，将细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。如果多肽分泌到培养基中，则通常首先使用可商购的多肽浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可以使用通过本文所述方法清洁的可重复使用的色谱材料纯化的多肽的例子包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、融合蛋白、含Fe蛋白和免疫缀合物。

然后可以使用已知方法与本发明方法的组合从此类培养物或组分(例如，从培养基或细胞提取物或体液)中纯化或部分纯化所得表达的多肽。“部分纯化”意指已经进行了某个或多个分级程序，但是存在比所希望的蛋白质更多的多肽种类(至少10％)。“纯化”意指蛋白质基本上是同质的，即存在少于1％的污染蛋白质。分级程序可以包括但不限于一个或多个以下的步骤：过滤、离心、沉淀、相分离、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC；使用诸如苯醚、丁醚或丙醚的树脂)、HPLC、或上述的某种组合。可以使用本发明的方法清洁和再生上述任何色谱树脂。

所希望的最终纯度取决于多肽的预期用途。例如，当将体内施用多肽时，希望相对高的纯度。在这种情况下，将多肽纯化，使得在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时不可检测到对应于其他多肽的多肽条带。相关领域的技术人员将认识到，由于不同的糖基化、不同的翻译后加工等，可以通过SDS-PAGE可视化对应于多肽的多个条带。最优选地，本发明的多肽被纯化至基本同质，如通过SDS-PAGE分析时的单个多肽条带所指示的。可以通过银染色、考马斯蓝染色或(如果多肽被放射性标记)通过放射自显影术来可视化多肽条带。

通过以下实施例进一步说明本发明，不应将所述实施例视为进一步限制。将贯穿本申请引用的所有参考文献的内容均通过引用明确地并入本文。

实施例

树脂清洁是在维持用于mAb纯化的蛋白A柱的适当长寿命方面的关键要素。有效的树脂清洁对于维持材料的可持续成本也至关重要，因为蛋白A树脂是用于下游加工的成本最大的消耗品之一。

污垢的影响是通过以下方式影响柱寿命的：经由空间限制和总体颗粒内孔隙率的降低而降低结合能力，随着污物浓度的增加，使对mAb的吸附变得更加困难。较高的苛性物(caustic)浓度证明会去除积聚的污物，但因配体水解增加而牺牲能力。已证明苛性溶液中的添加剂在降低配体水解速率方面是效果轻微的，诸如乙二醇、丙二醇、硫酸钠和柠檬酸钠。

在新一代苛性稳定的蛋白A树脂的情况下寻求用于清洁解决方案的新配制品，其将增加总体生产力和有效性。

材料与方法

表1：原料列表

树脂和负载材料

用于实验的蛋白A柱是0.8cm内径x 5.0cm床高，在MiniChrom硬件(Repligen，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中填充有Mabselect SuRe LX树脂(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)。用于清洁研究的实验在Avant 150系统(GE Healthcare)上进行，其中以4.1至4.6g/L滴度的澄清细胞培养收获物作为负载材料。进行另外的实验，其用在1cm内径x 10cm床高Omnifit玻璃柱(Kinesis)中的相同的树脂，也在Avant 150系统(GE Healthcare)上进行，以4.1至4.6g/L滴度的澄清细胞培养收获物作为负载材料。

分析

用DropSense96紫外-可见分光光度计(Trinean，根特布吕赫(Gentbrugge)，比利时)使用在280nm处的紫外吸光度来确定捕获运行的产物浓度。使用Tecan液体处理系统(莫里斯维尔，北卡罗来纳州)以高通量方式进行用于定量残余CHO-HCP和rProA的ELISA。使用CHO HCP第3代试剂盒(Cygnus Technologies，绍斯波特(Southport)，北卡罗来纳州)定量HCP水平，同时使用Repligen Protein-AELISA试剂盒(Repligen Corporation，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)根据制造商的方案定量rProA。使用实时定量PCR(RT-qPCR)测量样品中的残余CHO DNA(rDNA)。使用Waters的Acquity H-Class Bio UPLC进行尺寸排阻色谱法(SEC)以测量产物池中的单体和聚集体含量。使用Empower软件(Waters Corp.)对单体、低分子量和高分子量物质进行定量。

色谱方法

MabSelect SuRe LX蛋白A柱以结合和洗脱模式操作。对每种清洁方案进行多个蛋白A循环，直到满足最终标准。标准是产率(<80％)和/或Δ柱压(>3.00MPa)。MabSelectSuRe LX蛋白A色谱操作的步骤、停留时间和缓冲液柱体积(CV)要求呈现在表2中。

表2：蛋白A色谱操作条件的总结

^a表3列出了CIP 1缓冲液

^b表3列出了CIP 2缓冲液

将蛋白A柱用3CV的20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2缓冲液平衡。然后将1M氯化钠注入柱中，并且继续用20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2缓冲液平衡2CV。平衡后，在2℃至8℃下以45g/L树脂的负载目标将澄清的本体负载到柱上。然后将柱用2CV的20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2缓冲液洗涤，然后用5CV的50mM碳酸盐、100mM氯化钠、0.5％聚山梨醇酯-80pH 10.0洗涤，并且然后用5CV的20mM柠檬酸盐磷酸盐pH5.1洗涤。将柱用20mM柠檬酸盐磷酸盐pH 3.4缓冲液洗脱。对于整个5CV收集洗出液，并且将每个循环的洗出液收集到单独的容器中。洗脱后，将蛋白A柱用3CV的CIP 1缓冲液就地清洁，用2CV的20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2缓冲液中和，并且然后用3CV的CIP 2缓冲液进行卫生处理。如果给定的清洁方案中不存在CIP 1，则对于该色谱方法不执行CIP 1和中和1。类似地，如果给定的清洁方案中不存在CIP 2，则对于该色谱方法跳过CIP 2和中和2两者。由于蛋白A柱要再次循环，因此将其用3CV的20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2缓冲液进行第二次重新平衡，然后进行负载和导致洗脱、就地清洁和卫生处理的随后步骤。在最后一个循环的CIP步骤之后，进行3CV的20mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.2的平衡步骤，然后将柱用3CV的2％(v/v)苯甲醇储存。

计算蛋白A步骤产率的等式为

Δ柱压或柱压差被描述为跨越柱的填充床的压降，即柱前压力[MPa]-柱后压力[MPa]。

表3：清洁缓冲液

表3：清洁缓冲液

用表3中的清洁方案12进行用1cm内径x 10cm床高MabSelect SuRe LX柱的另外循环研究。在此清洁方案中，每个CIP步骤(CIP 1和CIP 2)的停留时间是5分钟(而不是3分钟)，以允许每个CIP溶液在动态流动条件下15分钟的接触时间。平行进行两个循环研究，其在CIP 2步骤之后使用5或30分钟的静态保持，使CIP 2溶液的累积接触时间分别达到20分钟和45分钟。

结果与讨论

该研究的结果表明，产率和Δ柱压受到污物去除不充分与不相容的溶液组分(诸如磷酸)的组合的影响，所述溶液组分会加剧污垢程度并且影响Δ柱压。这种相互作用的机制尚不完全了解。图1显示了清洁方案1、2、3和6在指示的纯化循环过程期间的步骤产率。意在代表对照情况的清洁方案1具有渐进的产率下降，在大约第65次循环时急转向下。该案例在CIP 1步骤使用磷酸以及在CIP 2步骤使用低浓度氢氧化钠，因此可以推断污物的去除不充分并且导致柱降解。该案例因柱过压而结束，最有可能是由于CIP 1条件下提供的低pH环境。CIP 2步骤的去除(清洁方案2)显示出更差的过程性能，因为CIP 2清洗被完全去除并且除了CIP 1的磷酸/乙酸条件外不提供任何柱清洁，并且类似地，在大约第60个循环时看到陡峭的产率下转。清洁方案3从在清洁方案1中使用的CIP溶液中去除了苯甲醇含量，并且通过这种去除，显示出更持久的过程性能，直到在大约第120个循环时产率大幅下降。这表明苯甲醇也可能是对柱清洁效率和总体产率产生负面影响的潜在试剂。已显示有机溶液对肽、蛋白质和核酸具有沉淀作用，因此似乎可信的是，这种作用可能存在于由于去除不充分而具有残余的蛋白质污物材料的柱上。清洁方案6显示出渐进的产率下降，但在所执行的170个循环中不存在陡峭的下转。即使苯甲醇保留在此处使用的CIP溶液中，也证明去除磷酸和将氢氧化钠含量从20mM增加到200mM对步骤产率更有益。由较高浓度氢氧化物提供的污物清洁是维持过程性能的关键。

还使用1cm内径x 10cm床高MabSelect SuRe LX柱评估CIP 1步骤使用167mM乙酸、2％(v/v)苯甲醇并且CIP 2步骤使用100mM氢氧化钠、200mM柠檬酸钠、1％(v/v)苯甲醇的替代清洁方案(表3中的清洁方案12)。在该配制品中，使用中等浓度的氢氧化钠(100mM)以便削减配体降解的影响，同时仍提供对固定相的充分清洁。使用CIP 2溶液的20分钟和45分钟累积接触时间进行循环研究，以评估使用该清洁方案的树脂清洁和配体降解的程度。

图8显示了执行91个蛋白A循环的清洁方案12的产率趋势。总体而言，对于20分钟接触时间和45分钟接触时间的两个案例，趋势几乎呈线性下降。应注意，这两个案例与CIP2溶液的总体接触时间比清洁方案1至11的总体接触时间更长，清洁方案1至11的与其相应的CIP溶液的总体接触时间仅为9分钟(即，3分钟的停留时间，3个柱体积＝9分钟)。这种线性降低可能与固定相上配体由于暴露于烈性清洁溶液而降解有关。然而，100mM氢氧化钠配制品允许充分清洁和去除蛋白质污物材料。

图9示出了使用用于测试清洁方案12的柱单独进行的动态结合能力(DBC)曲线。这些曲线是使用来自过程中间物的预澄清mAb并且在柱上负载到超过100g/L树脂的负载量而捕获的。左边的这些突破曲线的总体偏移表明结合能力下降，这可能与配体降解有关，并且因此与mAb产物的亲和力降低。20分钟接触时间案例的这些曲线的特征形状确实表明，该柱中出现更多污垢，但与20分钟和45分钟接触时间案例的总体步骤产率相比，观察到的产率影响可忽略不计。

尽管清洁方案6呈现了9分钟接触时间的良好工作场景，但在制造环境中典型地需要更长的接触时间，以确保清洁试剂具有足够的杀细菌和杀真菌有效性。在清洁方案12的案例中探索的更长接触时间在这个意义上更现实，这就是为什么选择100mM氢氧化钠的中等值以便减轻苛性溶液对降解蛋白A配体的影响。

确定应用不同时间(接触时间)的不同溶液的微生物杀灭(LRV)(图7)。在15分钟的优选接触时间下测试的溶液中，发现167mM乙酸、2％(v/v)苯甲醇(CIP 1缓冲液)和200mM氢氧化钠、200mM柠檬酸钠、1％(v/v)苯甲醇(CIP 2缓冲液)是最有效的。

结论

清洁方案6的条件被确定为是所有评估的清洁方案中最稳健的。清洁方案6能够达到170个循环，而仍维持高产率(92.9％)(图1)，并且压力没有显著增加，表明清洁充分，没有显著的污垢或残余的蛋白A浸出。清洁方案1在出现重大问题之前只能达到69个循环。在69个循环时，产率下降至84.1％(图1)，并且Δ柱压增加至0.3MPa，表明清洁不充分(图4)。使用磷酸作为清洁条件之一的其他清洁方案都显示出大的产率衰减或Δ柱压的显著增加(图1和4)，除了CIP 2中存在较高氢氧化钠浓度的案例(清洁方案8；图4)。还观察到，没有CIP 2(苛性)条件的运行倾向于比确实具有CIP 2条件的运行更快速地结垢(图3)。这些运行中没有一个能够达到100个循环，而在CIP2条件下的七次运行中有六次能够超过100个循环(图1、2和4)。每10个循环测试清洁方案10和11的洗脱池的配体水解(图5)。对于清洁方案9和11的最后一个循环，测试所有回收和再生步骤的配体水解(图6)。洗脱池中的残余蛋白A水平在两次运行的正常规格内(图5)。然而，对于两个运行的最后一个循环，在CIP和中和步骤中，残余蛋白A水平明显更高(图6)。高残余蛋白A水平以及可察觉的产率下降表明，配体水解是CIP 2条件中氢氧化钠浓度较高的因素。