一类新型昆虫激肽类似物及其在蚜虫防治中的应用
阅读说明：本技术 一类新型昆虫激肽类似物及其在蚜虫防治中的应用 (Novel insect kinin analogs and application thereof in aphid control ) 是由 杨新玲 周源琳 张怡萌 赵英儒 徐伟龙 冯浩原 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一类新型昆虫激肽类似物及其在蚜虫防治中的应用。其结构式如式A所示。本发明采用模拟肽学的策略和方法,发明了一类新型的昆虫激肽类似物,对活性激肽类似物的活性构象VI型β转角的转折点Phe～(2)进行取代修饰,即在关键性位点Phe～(2)侧链芳香环取代,同时引入酯基、醚键、脂肪环以及脂肪链等进行取代修饰,经固相多肽方法制备获得式A化合物。新化合物的杀蚜虫活性非常明显,优于对照商品化药剂吡蚜酮,尤其对多种蚜虫具有很好的防效,可以应用于农业蚜虫的防治中。(The invention provides a novel insect kinin analogue and application thereof in aphid control. The structural formula is shown as formula A. The invention adopts the strategy and method of mimic peptide science, invents a novel insect kinin analog, and aims at the transition point Phe of the active conformation VI type beta corner of the active kinin analog 2 By substitution, i.e. Phe at the critical position 2 The side chain aromatic ring is substituted, ester group, ether bond, aliphatic ring, aliphatic chain and the like are simultaneously introduced for substitution modification, and the compound of the formula A is prepared by a solid phase polypeptide method. The novel compound has very obvious aphid killing activity, is superior to that of a contrast commercial pesticide pymetrozine, particularly has good control effect on various aphids, and can be applied toPreventing and treating agricultural aphids.)
技术领域
本发明涉及一类新型昆虫激肽类似物及其在蚜虫防治中的应用，属于农业领域。
背景技术
蚜虫是农业上主要的害虫之一，对植物造成非常严重的危害，同时给农业生产带来了巨大的经济损失。蚜虫主要通过吸取植物汁液对植物造成危害，与此同时，蚜虫会传播各种植物病毒，这种传播病毒的危害远超过蚜虫本身带来的危害。因此，蚜虫的防治在农业上是极其重要的。蚜虫的防治目前来说主要采取化学农药防治的方法，由于蚜虫对传统化学杀蚜剂产生抗药性而使其用药量不断增加，一些化学杀蚜剂对非靶标生物如蜜蜂的毒性问题，导致传统化学杀蚜剂对环境安全和生态安全产生较大的风险。因此，以生态友好为前提，开发作用机制和结构新颖的高效蚜虫控制剂显得尤为重要。
昆虫激肽(Insect Kinins，IKs)是一种具有丰富的生理功能的小分子活性肽，由昆虫脑内特异性神经细胞周期性的合成、分泌并通过神经或体液传递。IKs具有调节消化酶的释放、水盐平衡、肌肉收缩、参与果蝇蜕皮前气管间隙和充气，参与昆虫体温的调控，通过进食来调节蜕皮前期的运动等众多生理功能，从而能够调节昆虫生长发育。由于昆虫激肽具有的这一系列重要的生理功能，它们被认为是一类潜在的害虫控制剂。昆虫激肽具有高活性、结构简单、易于用化学方法修饰改造、同时对环境友好等特点，因此被广泛认为可以作为一类害虫控制剂先导。以上说明，昆虫激肽包含很多优点：(1)活性高；(2)环境友好，易降解为氨基酸不会造成污染(3)安全性好，对人畜无毒；(4)结构简单，易于进行化学修饰和改造。昆虫激肽是以保守的五肽H-Phe1-Xaa2-Yaa3-Trp4-Gly5-NH2为C末端，其中Xaa可以是Tyr、His、Ser、Phe或Asn；Yaa可以是Ser、Pro或Ala，该五肽是保持生物活性所需的最小片段，称为核心五肽。目前己从17种动物中分离出了40多种不同的昆虫激肽。但是因为天然的昆虫激肽稳定性较差，因此，为了发现具有实际应用价值的新型害虫控制剂，需要对天然的昆虫激肽用模拟肽学的手段和方法进行结构修饰和改造，从而克服缺陷，同时保持优异的生物活性。
近年来，人们尝试以昆虫激肽核心五肽为先导，开发新型害虫控制剂。国内外学者先后在分子中引入具有位阻效应的非天然氨基酸，对其进行了结构修饰和改造，得到了具有良好抗酶解活性兼有较好生物活性的昆虫激肽类似物。一些昆虫激肽类似物已公开于下列文献中：如Nachman,R.J.等Diuretic activity of C-terminal group analogues ofthe insect kinins in Acheta domesticus.Peptides(Tarrytown,N.Y.)1995,16,809-13.；Nachman,R.J.等Aib-containing analogs of the insect kinin neuropeptidefamily demonstrate resistance to an insect angiotensin-converting enzyme andpotent diuretic activity.Peptides(Tarrytown,N.Y.)1997,18,53-57.；Nachman,R.J.等C-terminal aldehyde insect kinin analog enhances inhibition of weight gainand induces significant mortality in Helicoverpa zea larvae.Peptides 2003,24,1615-21.；Nachman,R.J.等Stereochemistry of insect kinin tetrazole analoguesand their diuretic activity in crickets.Acta Biochim.Pol.2004,51,121-127.；Nachman,R.J.等An active insect kinin analog with 4-aminopyroglutamate,a novelcis-peptide bond,type VIβ-turn motif.Biopolymers 2004,75,412-419.；Zubrzak,P.等β-Amino acid analogs of an insect neuropeptide feature potent bioactivityand resistance to peptidase hydrolysis.Biopolymers 2007,88,76-82.；Nachman,R.J.等Toward the development of novel pest management agents based uponinsect kinin neuropeptide analogues.Ann.N.Y.Acad.Sci.2009,1163,251-261.；Smagghe,G.等Antifeedant activity and high mortality in the pea aphidAcyrthosiphon pisum(Hemiptera:Aphidae)induced by biostable insect kininanalogs.Peptides(New York,NY,United States)2010,31,498-505.；Nachman,R.J.等Biostable analogs of insect kinin and insectatachykinin neuropeptides:areview of novel classes of antifeedants and aphicides.Pestycydy 2011,23-34.；Nachman,R.J.等Active diuretic peptidomimetic insect kinin analogs thatcontainβ-turn mimetic motif 4-aminopyroglutamate and lack native peptidebonds.Peptides(New York,NY,United States)2012,34,262-265；Zhang C.L.等Design,synthesis and aphicidal activity of N-terminal modified insect kininanalogs.Peptides(N.Y.,NY,U.S.)2015,68,233-238；Zhang C.等Synthesis,aphicidalactivity and conformation of novel insect kinin analogues as potential eco-friendly insecticides.Pest Management Science,2020,76(10):3432-3439；Yang X,LiX,Zhang Z等.Aclass of insect kinin analogues and their applications:CN108276473A[P]；Yang X,Zhang C.L,Ling.Y.等.Novel insect kinin analogues andtheir applications:CN105061556A[P].上述文献通过用位阻较大的非天然氨基酸或羧酸修饰天然昆虫激肽而得到相应的类似物，能够提高它们的抗酶解活性，同时具有一定的生物活性。但是这些激肽类似物的生物活性仍不十分突出，作为农药分子直接应用于农业生产中仍然有一定的局限性。
发明内容
本发明针对活性激肽类似物的活性构象VI型β转角的转折点即关键性位点Phe2进行了取代修饰，采用线性、成环、酯化、及空间位阻、走向限定的天然氨基酸或非天然氨基酸等基团对Phe2进行了取代修饰，发明了一类新型的昆虫激肽类似物，并经过生物活性测试发现该类化合物不仅具有很好的杀大豆蚜的活性，对豌豆蚜和桃蚜也具有一定的活性。
本发明提供的一类新型的昆虫激肽类似物，其结构通式为式A：
其中，Raa为天然氨基酸或非天然氨基酸，所述天然氨基酸或非天然氨基酸可选自：谷氨酸-5-环己酯、叔亮氨酸、烯丙基甘氨酸、2-氨基-5-苯基戊酸、氨基环丙烷羧酸、3-(2-呋喃基)-L-丙氨酸、1-氨基-1-环己基甲酸、环丁基丙氨酸、蛋氨酸、2-氨基-5-甲基己酸、1-氨基环丁甲酸、3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸、谷氨酸1-烯丙酯、天冬氨酸-1-苄酯、谷氨酸甲酯、天冬氨酸-4-环己酯、O-乙酰基-L-苏氨酸、谷氨酸-5-苄酯、O-苄基-L-丝氨酸、O-叔丁基-L-苏氨酸、S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸、谷氨酸-1-苄酯、L-天冬氨酸-1-烯丙酯、O-叔丁基-L-丝氨酸、O-苄基-L-苏氨酸。
具体地，所述天然氨基酸或非天然氨基酸可优选自谷氨酸-5-环己酯、叔亮氨酸、烯丙基甘氨酸、氨基环丙烷羧酸、环丁基丙氨酸、2-氨基-5-甲基己酸、1-氨基环丁甲酸、3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸、谷氨酸1-烯丙酯、天冬氨酸-1-苄酯、谷氨酸甲酯、天冬氨酸-4-环己酯、O-乙酰基-L-苏氨酸、谷氨酸-5-苄酯、O-苄基-L-丝氨酸、O-叔丁基-L-苏氨酸、S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸、L-天冬氨酸-1-烯丙酯、O-苄基-L-苏氨酸。
本发明所提供的式A所示化合物均按照多肽固相合成方法制备得到(参考文献：Chan WG,White PD.Fmoc solid phase peptide synthesis A Practical Approach,Oxford UnIersity Press,2000；pp.9-74.)。
本发明进一步提供了上述式A所示化合物在害虫防治中的应用。
所述害虫可为蚜虫。
所述蚜虫具体可为大豆蚜(Aphis glycines Matsmura)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)和桃蚜(Myzus persicae(Sulzer))中的至少一种。
一种药物(如杀蚜剂)，其活性成分为上述式A所示化合物，也属于本发明的保护范围。
本发明化合物对蚜虫的杀虫活性测定采用leaf-dipping法(参考文献：Busvine,J.R.,Recommended methods for measurement of pest resistance topesticides.1980.)。生测结果表明：本发明的化合物对大豆蚜具有非常明显的毒杀活性，并且对豌豆蚜和桃蚜也具有较好的活性。部分化合物活性优于商品化药剂吡蚜酮，具有作为蚜虫控制剂进一步应用开发的价值。
本发明的有益效果：本发明采用模拟肽学的策略和方法，发明了一类新型的昆虫激肽类似物，对活性激肽类似物的活性构象VI型β转角的转折点Phe2进行取代修饰，即在关键性位点Phe2侧链芳香环取代，同时引入酯基、醚键、脂肪环以及脂肪链等进行取代修饰，新化合物的杀蚜虫活性非常明显，优于商品化药剂吡蚜酮，尤其对多种蚜虫具有很好的防效，可以应用于农业蚜虫的防治中。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、AI-1所示化合物的制备(Raa来自谷氨酸-5-环己酯)
检查多肽合成仪气密性后，取Rink Amide-Am树脂(0.3mmol)置于5mL DCM中活化2h，而后用DMF洗涤5次后，加入5mL 20％哌啶的DMF溶液反应20min以脱除树脂上Fmoc保护基团；配制5mL含Fmoc-Gly-OH(1.2mmol)、HBTU(1.2mmol)、HOBt(1.2mmol)、DIEA(1.2mmol)的DMF溶液，活化5min后与树脂于室温下反应2h得到Fmoc-Gly with Rink Amide-Amresin。继续脱除Fmoc基团，以相同方法依次接入Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-谷氨酸-5-环己酯和肉桂酸。最后利用三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：水＝90:5:2.5:2.5的混合溶液与树脂反应4h得到目标物。过滤，除去TFA，加入适量的冰冻乙醚沉淀，离心去除上层清液，所得固体冷冻干燥后即得到粗产物。粗产品经过反相C18半制备高效液相色谱分离后得纯品，色谱条件为：流动相是50％乙腈的水溶液(含0.1％的TFA)，流速是10mL/min，检测波长为215nm，HPLC保留时间在12min左右。结构鉴定数据见表1，经高分辨质谱确证结构正确。
其它目标化合物均按照上述方法制备得到。
实施例2、AI-2所示化合物的制备(Raa来自叔亮氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-2所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-叔亮氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例3、AI-3所示化合物的制备(Raa来自L-烯丙基甘氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-3所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-L-烯丙基甘氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例4、AI-4所示化合物的制备(Raa来自L-2-氨基-5-苯基戊酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-4所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-L-2-氨基-5-苯基戊酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例5、AI-5所示化合物的制备(Raa来自氨基环丙烷羧酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-5所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-氨基环丙烷羧酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例6、AI-6所示化合物的制备(Raa来自3-(2-呋喃基)-L-丙氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-6所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-3-(2-呋喃基)-L-丙氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例7、AI-7所示化合物的制备(Raa来自1-氨基-1-环己基甲酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-7所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-1-氨基-1-环己基甲酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例8、AI-8所示化合物的制备(Raa来自环丁基丙氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-8所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-环丁基丙氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例9、AI-9所示化合物的制备(Raa来自蛋氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-9所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-蛋氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例10、AI-10所示化合物的制备(Raa来自2-氨基-5-甲基己酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-10所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-2-氨基-5-甲基己酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例11、AI-11所示化合物的制备(Raa来自1-氨基环丁甲酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-11所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-1-氨基环丁甲酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例12、AI-12所示化合物的制备(Raa来自3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AI-12所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例13、AII-1所示化合物的制备(Raa来自谷氨酸1-烯丙酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-1所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-谷氨酸1-烯丙酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例14、AII-2所示化合物的制备(Raa来自天冬氨酸-1-苄酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-2所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-天冬氨酸-1-苄酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例15、AII-3所示化合物的制备(Raa来自谷氨酸甲酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-3所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-谷氨酸甲酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例16、AII-4所示化合物的制备(Raa来自天冬氨酸-4-环己酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-4所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-天冬氨酸-4-环己酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例17、AII-5所示化合物的制备(Raa来自O-乙酰基-L-苏氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-5所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-O-乙酰基-L-苏氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例18、AII-6所示化合物的制备(Raa来自谷氨酸-5-苄酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-6所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-谷氨酸-5-苄酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例19、AII-7所示化合物的制备(Raa来自O-苄基-L-丝氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-7所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-O-苄基-L-丝氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例20、AII-8所示化合物的制备(Raa来自O-叔丁基-L-苏氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-8所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-O-叔丁基-L-苏氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例21、AII-9所示化合物的制备(Raa来自S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-9所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例22、AII-10所示化合物的制备(Raa来自谷氨酸-1-苄酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-10所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-谷氨酸-1-苄酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例23、AII-11所示化合物的制备(Raa来自L-天冬氨酸-1-烯丙酯)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-11所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-L-天冬氨酸-1-烯丙酯。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例24、AII-12所示化合物的制备(Raa来自O-叔丁基-L-丝氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-12所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-O-叔丁基-L-丝氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
实施例25、AII-13所示化合物的制备(Raa来自O-苄基-L-苏氨酸)
按照与实施例1相同的步骤制备AII-13所示化合物，仅将Fmoc-谷氨酸-5-环己酯替换为Fmoc-O-苄基-L-苏氨酸。结构鉴定数据见表1，经验证，结构正确。
式A所示化合物的结构、高分辨质谱数据及纯度列于表1中
表1
实施例27、本发明化合物对大豆蚜(Aphis glycines Matsmura)的生物活性
本发明化合物对蚜虫的杀虫活性测定采用浸液法(leaf-dipping法)。将目标化合物配成200mg/L的测定液。再用1-5ml移液枪取1mLDMSO加入称量瓶，加入9mL含有0.1％曲拉通X-100的水溶液，充分混匀，得200mg/L的测定液，然后再用含有0.1％曲拉通X-100的水溶液逐级稀释，充分混匀得到所需浓度。将室内培育未接触过任何药剂的大豆蚜虫和大豆叶片，用直径15mm的打孔器打出适合大小的叶片，分别浸入稀释好的药液中15秒，取出晾干。然后将叶片放入生测板中，底部加入1.5％的琼脂保湿，每孔接入大豆蚜20±3头，每个重复3次。48小时后检查结果。死亡判断标准为：轻触虫体，不能正常爬行个体视为死亡。计算校正死亡率，公式如下所示：
校正死亡率(％)＝(样品死亡率-空白对照死亡率)/(1-空白对照死亡率)*100％.
杀蚜毒力LC50值用统计分析软件SPSS计算得到。
杀大豆蚜活性测试结果见表2
表2式A化合物对大豆蚜(Aphis glycines Matsmura)的杀虫活性
表2生物活性测试结果表明，本发明的化合物对大豆蚜均具有杀死活性，其中，有8个化合物对大豆蚜的致死率高于80％。将所有化合物进一步进行致死中浓度(LC50)的测试发现，化合物AI-1、AII-1、AII-2、AII-3、AII-4、AII-7对大豆蚜虫的LC50值远低于商品化药剂吡蚜酮，进一步表明这些化合物的杀蚜活性优异，具有作为蚜虫控制剂进一步开发的价值。
实施例28、本发明部分化合物对豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、桃蚜(Myzuspersicae(Sulzer))的生物活性
对豌豆蚜虫和桃蚜的杀虫活性测定同样采用实施例2中所述的leaf-dipping法，结果分别见表3和表4。
表3式A中部分化合物对豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的杀虫活性
经过活性测定发现，这类昆虫激肽化合物对于豌豆蚜虫也具有很好的活性，其中化合物AI-1和AI-8对于豌豆蚜的LC50均低于吡蚜酮，表明它们的杀豌豆蚜活性优于商品化药剂吡蚜酮。
表4式A部分化合物对桃蚜(Myzus persicae(Sulzer))的杀虫活性
经过对桃蚜的杀虫活性测试发现，这些化合物对于桃蚜都有一定的活性，其中化合物AI-1、AII-2和AII-3的LC50均低于吡蚜酮，表明它们的杀桃蚜活性优于商品化药剂吡蚜酮。
以上结果表明，本发明的化合物对于大豆蚜、豌豆蚜和桃蚜具有杀死活性。尤其是经过LC50活性测试发现AI-1对于这三种蚜虫的杀蚜活性均优于商品化药剂吡蚜酮，有一定的广谱性，具有作为蚜虫防治剂进行应用开发的价值。
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