具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明所用铁皮石斛样品为购自浙江温州的铁皮石斛。

实施例1、RAPD技术扩增金钗石斛特异SCAR标记

一、CTAB法提取植物DNA

取石斛样本0.2g置于1.5mL EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μl的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.L_1，EDTA20 mmolmmol.L_1，NaCL 1.4mol.L_1，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μl，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。本实验提取了11个样本DNA，分别是来自广西、湖北，泸州、个旧、怒江、赣州、文山、建水、漳州、缅甸的金钗石斛和铁皮石斛样本。

二、RAPD技术PCR扩增

利用RAPD技术进行扩增(参照Fu J,Yang L,Khan MA,Mei Z(2013)Geneticcharacterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by usingimproved RAPD analysis.Mol Biol Rep,40(10):5993-9)：

以步骤一提取的核酸作为模板，用RAPD引物SBS-M19进行扩增(序列见表1，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μl反应体系包括：1μl的引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCR Taq Mastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems 96-WellThermal Cycler，Life Technology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

表1

琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。

(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压120V，电泳时间30min即可。

三、RAPD扩增条带的分离

1.片段回收

1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图1铁皮石斛品种的特异片段M19-45，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。

2.克隆

接着利用pGEM-T载体(Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(4℃连接12小时)。连接后加入30μl活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μl无氨苄青霉素的LB培养基(配制方法：12.5克LB粉加500ml水高温灭菌)200转每分钟摇动45分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37℃培养15小时[固体培养基配制方法：12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500μl的氨苄青霉素(100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40μl的20mg/ml的X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20μl的24mg/ml的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)]进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。

3.阳性克隆鉴定

每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，220转每分钟摇2-4小时，取0.2～0.5μl培养基进行菌落PCR反应。10μl体积的反应体系是：2×PCR Taq Mastermix 5μl，DNA0.5μl，通用引物(SP6:ATTTAGGTGACACTATAGAA+T7:TAATACGACTCACTATAGGG)1μl(2.5μmol/L)，水3.5μl。PCR反应条件是：95℃1分30秒，94℃40秒，58℃30秒，72℃40秒，30个循环，最后72℃5分钟。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色、曝光显色。

4.结果

改良RAPD扩增见图1。阳性克隆的菌落PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。

四、测序分析

1.测序

挑选阳性克隆，进行Sanger测序。测序的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1所示)：

SEQ ID NO.1(795bp)：

CATCCTAGATCATGTTTGGACTAGTTATATTCACGCAAACAAAATATAATTAGTATAAGGAACTTTCTTTTGGATTACTAGAGCAGCAATAGGTGCCATGGAGAGTCTTGAAAATACAAAGACCCTCTTGGGAGCCTTCTCATCAATAGCTTCAGTAGTAGGCTTTTTAACGACACCTTTGATAGAAGGTACGCTAACAATATTCTCAAAGTCAGCAATTCTCAGTTACTGCTAATTATTTTGTACTAGGATTCTAGAGAGAGAAGCTCTGTGATTCTAGAGAGAGAAAGTGTTTTTTTTATTCTTCATTTTCACGGGCTCCCTGTCTCTAGCCATGGCGGCTGCCGGCCGTCCGCCATCTGATCCTCCTAATCAGCCTCAACTTGTTGGTCCTCAATTAGGGCCTATTCCAATCATTCCACTACCATCCCCTCGATCTTCCATCTTTGGATGCGATGTTAGTTTTGTTTCAAGATCAGGTTCTAAACCTTTGATAATTCAGGAAGGTTTCGGATCTATTGCTCAATATGATAATTCGTCATCCACTATGGATGGAAAAGGTAAGGCTAAGATGGGTTCGTCGGTTCTTGATCTTCATGGTCACACCATTCCGCCGATTGTTAATCTCGTTTCTAAGGGATTCACCTTTGGATCTCTAGAACATGATGTATTGGACTCTCCGATTCTTCCTGAATCTGTTGCTGGTTACACTTCTAACTCGATTACTACTGTTCCATTGGATATTAATAAATCTGAGGTTTTTGTCGCGGTCGCAGATAATCCTAAGAACTCTTT

2.同源性搜寻与查新

将测序获得的如上序列，在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行比对，未见相同或者重复序列，说明它为新的、铁皮石斛特有的核苷酸序列，可建立铁皮石斛特异的SCAR标记。

实施例2用本发明方法特异扩增铁皮石斛的基因

一、实验方法

(一)根据实施例1得到的铁皮石斛特异的SCAR标记(SEQ ID NO.1所示的序列)，设计1对引物，合成。

(二)PCR扩增

1、模板制备

检测不同物种：取选取了21个不同地区金钗石斛或者其他品种石斛DNA作为模板，1-21号通道分别代表广西金钗石斛，湖北金钗石斛，泸州金钗石斛、个旧金钗石斛、怒江金钗石斛、赣州金钗石斛、文山金钗石斛、建水金钗石斛、漳州金钗石斛、缅甸金钗石斛、铁皮石斛、玫瑰石斛、长苏石斛、黑毛石斛、铜皮石斛、银杏、金银花、薄荷、赶黄草、栀子、赤灵芝。分别稀释成10ng/μl备用。

基因提取方法同实施例1。

2、PCR扩增：

(1)PCR体系(10μl)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR扩增条件

3、琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)

(1)脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.6g琼脂粉，加入1×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入Goldview 1μl，混匀，待冷却至50℃备用；

(2)用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

(3)点样：

(4)130V电泳35min；

4、图像摄取：(BIO-RAD，Universal HoodⅡ)

二、实验结果

如图3所示，本发明设计的引物可以从铁皮石斛中扩增出特异性片段，而其他地区的金钗石斛没有扩增出特异性条带，其他品种植物基因组也没有扩增出任何条带。

实验结果说明，本发明引物的特异性良好，可以特异、有效扩增铁皮石斛的基因，能够有效鉴别铁皮石斛样本。

实施例3本发明金钗石斛检测试剂盒和使用方法

一、试剂盒组成

本试剂盒含有：

CTAB提取缓冲液(200ml)；

2×Taq Master Mix，其中，引物可以选用SEQ ID NO.1所示引物(500μl)；

阴性对照模板DNA(铜皮石斛或其他地区金钗石斛的DNA)一管(50μl)；

阳性对照模板DNA(铁皮石斛DNA)一管(50μl)；

灭菌ddH₂O(1500μl)。

(一)CTAB提取缓冲液

CTAB提取缓冲液(100ml)

用HCL调至pH 5.0，加H₂O至100ml.

(二)PCR体系2×Taq Master Mix的配方

二、检测方法

(一)PCR扩增

1、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。

2、进行PCR扩增：

具体如下：

充分混匀后，12000rpm离心30s；

注：2×Taq Master Mix，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照

3、放入PCR仪上(Mastercycler 5331PCR仪器，德国Eppendorf，或者其它PCR仪器如Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler)，采用如下程序。

(二)琼脂糖凝胶电泳：

1、琼脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.6g琼脂粉，加入1×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入Goldview 1μl，混匀，待冷却至50℃备用；

2、用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：注意加样顺序，并加上DNA的分子Marker

4、130V电泳35min；

(三)结果检测与分析

在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以有效鉴定铁皮石斛，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南医科大学

<120> 铁皮石斛的检测试剂盒和检测方法

<130> GY185-2021P0113686CC

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 铁皮石斛的特异SCAR标记

<400> 1

catcctagat catgtttgga ctagttatat tcacgcaaac aaaatataat tagtataagg 60

aactttcttt tggattacta gagcagcaat aggtgccatg gagagtcttg aaaatacaaa 120

gaccctcttg ggagccttct catcaatagc ttcagtagta ggctttttaa cgacaccttt 180

gatagaaggt acgctaacaa tattctcaaa gtcagcaatt ctcagttact gctaattatt 240

ttgtactagg attctagaga gagaagctct gtgattctag agagagaaag tgtttttttt 300

attcttcatt ttcacgggct ccctgtctct agccatggcg gctgccggcc gtccgccatc 360

tgatcctcct aatcagcctc aacttgttgg tcctcaatta gggcctattc caatcattcc 420

actaccatcc cctcgatctt ccatctttgg atgcgatgtt agttttgttt caagatcagg 480

ttctaaacct ttgataattc aggaaggttt cggatctatt gctcaatatg ataattcgtc 540

atccactatg gatggaaaag gtaaggctaa gatgggttcg tcggttcttg atcttcatgg 600

tcacaccatt ccgccgattg ttaatctcgt ttctaaggga ttcacctttg gatctctaga 660

acatgatgta ttggactctc cgattcttcc tgaatctgtt gctggttaca cttctaactc 720

gattactact gttccattgg atattaataa atctgaggtt tttgtcgcgg tcgcagataa 780

tcctaagaac tcttt 795

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> M19-45L

<400> 2

aggtgccatg gagagtcttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> M19-45R

<400> 3

cgcatccaaa gatggaagat 20