铜团簇、包含铜团簇的组合物和神经退行性疾病的治疗
阅读说明:本技术 铜团簇、包含铜团簇的组合物和神经退行性疾病的治疗 (Copper clusters, compositions comprising copper clusters and treatment of neurodegenerative diseases ) 是由 孙涛垒 常柏松 于 2019-06-28 设计创作,主要内容包括:用铜团簇(CuNCs)治疗神经退行性疾病,其中神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA)和青光眼。(Treating neurodegenerative diseases with copper clusters (CuNCs), wherein the neurodegenerative diseases include Alzheimer's Disease (AD), Parkinson's Disease (PD), Huntington's Disease (HD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), spinocerebellar ataxia (SCA), and glaucoma.)
技术领域
本发明涉及神经退行性疾病
技术领域
,尤其涉及铜团簇(CuNCs),包含 CuNCs的组合物,以及它们在治疗神经退行性疾病中的应用。背景技术
神经退行性疾病是人类健康的主要威胁之一,其特征是神经细胞的渐进性损伤和神经元丢失,从而导致运动或认知功能受损。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA)和青光眼(Kim 2015;Liu 2017;Singh 2019)。
神经退行性疾病的发病机制被认为是由活性氧(ROS)引起的氧化应激(OS) 引发或加速的。ROS被定义为一组源自氧的活性分子,由于其未配对的价电子,它们通常寿命短且活性高。ROS包括但不限于自由基(超氧化物,O2 -)、羟基自由基(·OH)或非自由基(过氧化氢,H2O2)。它们在生物系统中自然产生,在调解炎症、细胞存活和应激反应等细胞活动以及包括心血管疾病、肌肉功能障碍、过敏、癌症和神经退行性疾病在内的许多疾病方面发挥着重要作用。由于其反应活性,高浓度的ROS会导致细胞死亡或氧化应激(OS).OS是由促氧化和抗氧化水平之间的不平衡产生的一种状况。神经退行性疾病的复杂发病机制在很大程度上仍然未知;然而,OS增加已被认为是各种神经退行性疾病的潜在常见病因之一(Kim2015;Liu 2017;Singh 2019)。
阿尔茨海默病(AD)是最普遍的神经退行性疾病,其特征是行为、认知和功能的逐渐恶化。AD的病理生理主要与淀粉样蛋白β(Aβ)斑块的细胞外沉积和细胞内tau神经原纤维缠结(NFT)的积累有关。即使在AD早期,Aβ的积累似乎也会增加OS并导致线粒体功能障碍和能量衰竭。OS还可以加重Aβ的产生和聚集,促进tau蛋白的磷酸化,从而诱发AD发病机制的恶性循环。ROS诱导的OS 正在成为AD发病机制中的一个重要因素,因为ROS过度产生被认为在AD的发生和进展中起关键作用(Kim 2015;Liu 2017;Cheignon 2018)。
帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病,其特征是震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、姿势不稳定和运动障碍。PD主要发生在老年人中,发病率随年龄增长而增加。据保守估计,世界上PD患者的数量已经超过1000万。然而,PD的病因尚不清楚。就临床治疗而言,尽管美国FDA批准了几种药物用于治疗轻度和中度帕金森病,但这些药物是神经递质调节药物,只能暂时改善患者的认知或运动功能。停药后症状就会反弹。目前尚无药物能终止或逆转PD的病理过程。
PD的主要病理特征是脑干、脊髓和皮层中多巴胺能神经元的缺失和细胞内蛋白样包涵体的存在,称为Lewy小体。Lewy小体主要由变性α-synuclein(α-syn) 聚集形成的淀粉样纤维组成。α-syn位于神经元的突触前膜末端,细胞内的自然状态为可溶性和开放状态。在病理条件下发生的α-syn错误折叠,产生β片状结构,这些结构又聚集和纤毛化形成Lewy小体病变。多巴胺能神经元退化的病理机制与ROS或其他自由基的过度积累有关。尽管目前没有治愈PD的有效方法,但对疾病进展中ROS相关机制的理解为可能缓解PD症状的治疗提供了重要的见解。具有抗氧化特性的物质,如辅酶Q10、维生素C、维生素E、二十二碳六烯酸(DHA)、银杏和多酚已经过测试,但还没有合理证据表明它们对神经保护有任何功效(Liu2017;Al Shahrani 2018)。
亨廷顿病(HD)是一种进行性神经退行性疾病,与HTT基因中胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤(CAG)重复序列的不稳定扩增有关。大量研究表明氧化标记物水平升高与不可逆的神经元损伤之间存在联系。有趣的是,尽管OS在HD中的作用已确立,但尝试使用经典抗氧化剂治疗该疾病的试验在很大程度上是无效的(Liu 2017)。
肌萎缩侧索硬化(ALS)的特征是脊髓前角运动神经元的逐渐丧失。它被归类为家族性或散发性取决于是否存在明确定义的遗传性基因元件(Liu 2017)。
脊髓小脑性共济失调(SCA)是一种常染色体显性遗传疾病,其特征是进行性神经变性。与SCA相关的常见症状是共济失调步态、肌肉运动障碍、发音困难和认知障碍(Liu2017)。
青光眼是一种不可逆的视神经退行性疾病,以视神经损伤、视野缺损和视功能逐渐丧失为特征。它是继白内障之后世界上第二种不可逆的致盲眼病。根据临床分析数据预测,到2020年,全球青光眼患者将达到7600万,尤其是在亚洲和非洲,而中国青光眼患者将达到2100万。青光眼的发病机制尚不清楚。长期以来,病理性眼压升高被认为是引起神经损伤和青光眼的主要因素之一。青光眼的临床治疗主要以降低患者眼压为主。然而,大量的临床数据表明,仅靠控制眼压并不能达到治愈青光眼的目的。这是因为即使眼压控制理想,进行性视神经损伤和视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡仍可能恶化。因此,高眼压可能只是青光眼相关视神经损伤的早期诱发因素,而仅通过降低眼压难以防止视神经功能进一步丧失。基于上述原因,青光眼治愈的关键是增强视神经功能,阻断或减缓视神经细胞凋亡和视神经损伤。然而,目前临床上尚未发现有效预防青光眼相关视神经损伤的药物。研究发现多种因素可导致视神经损伤,如氧化应激、机械应激、自身免疫系统异常、血糖水平、炎症分子和异常蛋白质沉淀等。在这些因素中,β淀粉样蛋白(Aβ)的错误折叠、异常聚集和纤维化受到更多关注,细胞内外的Tau蛋白在视神经退行性疾病和RGCs死亡过程中起着至关重要的作用。
Aβ是一种含有39-43个氨基酸残基的蛋白质,由β-分泌酶和γ-分泌酶水解淀粉样前体蛋白(APP)产生。它是参与神经损伤和神经细胞凋亡的重要因素。研究表明,Aβ的神经毒性是阿尔茨海默病(AD)等多种神经退行性疾病形成和发病的共同机制,长期以来一直作为相关药物研发的重要靶点。近年来的研究表明,Aβ的神经毒性在眼科神经退行性疾病—青光眼中也起着至关重要的作用。临床青光眼患者RGCs和房水中Aβ的表达显著高于对照组。在青光眼动物模型中,长期高眼压诱导的RGCs凋亡与淀粉样前体蛋白(APP)、Aβ表达增加和Tau 蛋白过度磷酸化密切相关。同时,临床数据显示,AD患者更容易出现青光眼和视力下降。并且在AD转基因动物的视网膜中合成了大量的APP,出现了Aβ斑块聚集。因此,青光眼和AD可能具有相似的Aβ机制。更重要的是,在青光眼动物模型中,处于凋亡期的RGCs与Aβ共表达,Aβ抗体或阻断Aβ过量产生的药物可有效抑制RGCs凋亡,减轻视神经损伤。这些研究结果表明,Aβ在青光眼的发病机制中具有重要作用,是基于视神经保护机制治疗青光眼的重要靶点。
视神经挤压伤大鼠模型是一种广泛使用的无高眼压青光眼动物模型。该模型维持视神经外膜的完整性,模拟青光眼视神经轴浆运输中断和RGCs死亡,接近临床青光眼损伤特征。同时,该模型制作规范,操作方便,能清晰定量地造成视神经损伤,误差小,重复性好。它是目前国内外公认的青光眼视神经损伤的准确模型,广泛应用于青光眼视神经损伤和RGCs损伤的病理机制研究和视神经保护药物的筛选。例如,从这个模型中发现人参皂苷Rg1、地塞米松、银杏、α-硫辛酸有一定的视神经保护作用,但保护效果并不理想。由于Aβ机制在视神经损伤过程中起重要作用,因此,在动物模型中开发一种既能抑制Aβ聚集和纤维化,又能保护视神经、改善视功能的药物,对青光眼的防治具有重要意义。
OS累积可能导致细胞损伤、DNA修复系统受损和线粒体功能障碍,所有这些都被认为是衰老过程加速和神经退行性疾病发展的关键因素(Kim 2015)。考虑到OS在神经退行性疾病中的关键作用,操纵ROS水平可能代表一种有希望的治疗选择,以减缓神经退行性疾病并缓解相关症状。在这方面,许多具有抗氧化特性的化合物,包括谷胱甘肽(GSH)、维生素C、维生素E和辅酶Q10,其减轻神经退行性症状的潜力已被检验;然而,结果喜忧参半(Liu2017)。
铜是人体许多生物功能所必需的稀有元素。例如,α-syn对金属离子具有很强的亲和力,如Cu2+。Cu2+-α-syn相互作用与氧化应激的增加和有毒低聚物的产生有关,这些低聚物在体外在膜双层中形成孔状结构,改变电导活性,在体内破坏膜导致细胞死亡。此外,铜离子可以与多巴胺(DA)协同结合到α-syn,在很大程度上增强α-syn的纤毛化。在PD患者中发现铜稳态失调。最近的研究显示黑质(SN)中的总组织铜减少;但在脑脊液中发现高水平的非结合铜,可能导致运动障碍。高水平的Cu2+与PD相关。在此基础上,旨在调节PD患者铜稳态失调的治疗已被广泛评估。PD动物模型的临床前研究调查了先前描述的铜螯合剂氯喹在治疗中的潜在应用,并显示SN神经元存活。此外,对铜离子络合物Cu2+双乙酰双(4-甲基硫代氨基脲)(Cu2+(atsm))在四种不同的PD动物模型中的体内评估显示神经保护、认知功能的改善和运动功能的恢复(Giampietro R,et al.2018; Kozlowski H,et al.2012;Tristan-Lopez L,et al.2014)。体外研究表明形成 Cu2+-α-syn复合体(Dudzik,2011)和铜依赖的α-syn胞内聚集物(McLeary,2018)。
铜团簇(CuNCs)是一种介于铜原子和铜纳米晶体之间的物质。它们由几个到几十个铜原子组成,表面有稳定的配体(Yao 2018)。CuNCs由于其独特的尺寸依赖性光学和电子特性而引起了相当大的关注,进而在广泛的应用中表现出巨大的潜力,例如,纳米催化剂、生物传感器、细胞标记和光电纳米器件(Jin 2016;Liu 2018)。据我们所知,之前尚未见报道应用CuNCs治疗神经退行性疾病。
发明内容
本发明提供了铜团簇(CuNCs)在制备用于治疗受试者的神经退行性疾病的药物中的用途,其中所述铜团簇(CuNCs)包含配体。
在制备药物用途的一些实施例中,所述配体修饰的铜团簇(CuNCs)的直径在 0.5-3nm的范围内。
在制备药物用途的一些实施例中,所述配体修饰的铜团簇(CuNCs)的直径在 0.5-2.5nm的范围内。
在制备药物用途的一些实施例中,所述配体选自胸腺嘧啶、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)、L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇的化合物中的一种。
在制备药物用途的一些实施例中,所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC),其中 D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰-D-半胱氨酸(D-NIBC)、和 N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在制备药物用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸寡肽及其衍生物为含半胱氨酸二肽、含半胱氨酸三肽或含半胱氨酸四肽。
在制备药物用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽 (HC)、和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
在制备药物用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)、和L-谷胱甘肽(GSH)。
在制备药物用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)、和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
在制备药物用途的一些实施例中,所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2- 甲基-3-硫醇-1-氧丙基]-L-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、和十二烷基硫醇。
在制备药物用途的一些实施例中,所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA)和青光眼。
本发明提供了铜团簇(CuNCs)在治疗受试者的神经退行性疾病中的用途,其中所述铜团簇(CuNCs)包含配体。
在治疗用途的一些实施例中,所述配体修饰的铜团簇(CuNCs)的直径在 0.5-3nm的范围内。
在治疗用途的一些实施例中,所述配体修饰的铜团簇(CuNCs)的直径在 0.5-2.5nm的范围内。
在治疗用途的一些实施例中,所述配体选自胸腺嘧啶、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)、L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇的化合物中的一种。
在治疗用途的一些实施例中,所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC),其中所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰-D-半胱氨酸(D-NIBC) 和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在治疗用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸寡肽及其衍生物为含半胱氨酸二肽、含半胱氨酸三肽或含半胱氨酸四肽。
在治疗用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L- 精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽 (HC)、和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
在治疗用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L- 半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)、和L-谷胱甘肽(GSH)。
在治疗用途的一些实施例中,所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸 -L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
在治疗用途的一些实施例中,所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基 -3-硫醇-1-氧丙基]-L-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、 N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、和十二烷基硫醇。
在治疗用途的一些实施例中,所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA)和青光眼。
通过结合附图对优选实施例的详细描述,本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明,其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1(a)(i)显示式1所代表的TMHA的结构;图1(a)(ii)演示TMHA的合成,图1(a)(iii)和(iv)分别显示HA和TMHA的典型外观;图1(b)分别显示TMHA(红线)和纯HA(蓝线)的紫外-可见光谱;图1(c)显示了HA和TMHA的FT-IR;图1(d)显示了HA和TMHA的1H NMR谱。
图2提供了曲线图,显示(a)Cu2+和TMHA之间的摩尔比、(b)反应pH值、 (c)反应温度、和(d)反应时间对所得含有TMHA配体的CuNCs的光致发光强度的影响。
图3提供了曲线图,显示(a)NaCl浓度(0-1M)、(b)常见阳离子和阴离子、(c)pH 值(4-10)、和(d)储存时间(0-5周)对所得含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度的影响。
图4提供了显示用胸腺嘧啶不同取代度(DS)的TMHA制备的含有TMHA配体的CuNCs的照片和曲线图。图4(a)和(d)分别显示了用胸腺嘧啶取代度为3.2%的TMHA制备的含有TMHA配体的CuNCs的TEM或AFM图像;图4(b)和(e) 分别显示了用胸腺嘧啶取代度为10.5%的TMHA制备的含有TMHA配体的 CuNCs的TEM或AFM图像;图4(c)和(f)显示了用胸腺嘧啶取代度为20.1%的 TMHA制备的含有TMHA配体的CuNCs的TEM或AFM图像。图4(g)和(h) 分别显示了TMHA和含有TMHA配体的CuNCs的质谱,图4(i)和(j)分别显示了(i)CuNCs的全区和(j)Cu 2p区的XPS光谱。在图4中,插图:(b,g,h)分别是含有TMHA配体的CuNCs纳米线、电离碎片和含有TMHA配体的CuNCs 的示意图;(e,f)组成纳米线的分离CuNCs。
图5是含有GSH配体的CuNCs的热重分析的曲线图。
图6显示使用胸腺嘧啶取代度分别为3.2%、10.5%和20.1时获得的CuNCs 的激发(在λem=613nm处测量)光谱。
图7显示:(a)不同胸腺嘧啶DS的PL光谱(左)和衰减曲线(右)。插图:365 纳米激发的图像。(b)TMHA探针相对Cu2+含量的PL反应。(c)Cu2+对各种金属的TMHA探针的PL和颜色变化(插入)。
图8显示:(a)H2O2与CuNCs反应的紫外吸光度。(b)CuNCs和各种对照的GPx样活性的初始速率。(c)CuNCs的SOD样活性。插图:O2生成率。(d) CuNCs与其它金属的催化活性的比较。
图9是显示用于PD早期诊断的尿中Cu2+的检测曲线图。
图10(a)是显示细胞存活率数据的柱状图(***p<0.001);图10(b)显示PI染料染色的死(红)细胞,在4mM MPP+、2μM Cu2+和10μg ml-1TMHA的条件下处理细胞;图10(c)显示用钙黄素-AM染色的活(绿)细胞。细胞在4mM MPP+、10μM Cu2+和10μg ml-1TMHA条件下进行处理。
图11(a)是显示细胞内ROS水平的数据的柱状图,***p<0.001;图11(b)显示了在4mM MPP+、10μg mL-1TMHA条件下处理并通过特异性荧光探针 DCFH-DA染色的细胞内ROS的CLSM图像;图11(c)显示了在4mM MPP+、10 μg mL-1TMHA、10μM Cu2+的条件下处理并通过特异性荧光探针DCFH-DA染色的细胞内ROS的CLSM图像。
图12(a)显示记忆缺陷小鼠的行进距离和跌倒潜伏期,***p<0.001;图12(b) 显示大剂量MPTP(30mg kg-1)处理的动物的线粒体,其中经红线勾勒的线粒体显示肿胀、空泡状和严重的嵴。图12(c)显示了用MPTP(30mg kg-1)+TMHA(30mg kg-1)处理的动物的线粒体,而通过红线勾勒出的线粒体显示出健康的形态。
图13是显示L-谷胱甘肽(GSH)修饰的CuNCs(GSH-CuNCs)对α-syn纤维化动力学的影响的曲线图。
图14是显示CuNCs对MPP+损伤PD细胞(SH-sy5y)模型细胞存活率影响的柱状图。
图15显示了CuNCs的特征数据。(A)CuNCs的典型透射电子显微镜(TEM) 图像。(B)根据TEM图像计算的CuNCs尺寸分布。(C)CuNCs中铜(0)的 2p3/2和2p1/2电子的X射线光电子能谱(XPS)。(D)GSH改性CuNCs(上)和 GSH(下)的傅立叶变换红外光谱(FT-IR)比较。(E)CuNCs的荧光激发(左) 和发射光谱(右)。
图16显示了CuNCs的CAT活性。
图17显示了CuNCs的GPx活性。
图18显示了CuNCs的SOD活性。
图19是显示CuNCs对H2O2诱导的青光眼细胞(RGC-5)模型中细胞存活率的影响的柱状图。
具体实施方式
可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
在本申请中,为了更充分地描述本发明所涉及领域状态,当出版物被引用,这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。
超氧化物歧化酶(SOD)在催化高活性O2-分解为活性较低的H2O2和氧气方面发挥着重要作用。细胞溶质铜/锌-SOD(SOD1)、线粒体锰SOD(SOD2) 和细胞外SOD(SOD3)是已鉴定的三种不同的SOD亚型。SOD1和SOD2分别主要参与消除细胞质和线粒体中的O2-(Kim2015)。
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)包含多种同工酶家族,它们利用谷胱甘肽 (GSH)作为电子供体催化H2O2和脂质过氧化物的还原。GPX位于细胞质和线粒体中。在哺乳动物中,有五种不同的硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶亚型 (GPX1-4和6)和三种无硒同源物(GPX 5、7和8),它们具有半胱氨酸而不是硒代半胱氨酸。GPX的抗氧化功能取决于细胞中的每个异构体和位置; GPX1被认为是大脑中主要的抗氧化酶之一。研究表明GPX1的上调可能是对神经元损伤的保护反应之一(Kim 2015)。
过氧化氢酶负责使用铁或锰作为辅助因子将H2O2转化为水和氧气。过氧化氢酶位于过氧化物酶体中,也存在于细胞质和线粒体中。过氧化氢酶在H2O2水平较低时的作用很小,但在H2O2水平较高时变得越来越重要(Kim 2015)。
在正常生物体中,活性氧(ROS)通过调节各种酶来维持体内平衡。过氧化氢酶(CAT)几乎存在于所有生物体中。CAT是一种酶清除剂,一种基于铁卟啉的接触酶。它促进H2O2分解成分子氧和水,是生物防御系统中的关键酶之一。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一种重要的过氧化物降解酶,广泛存在于体内。 GPx的活性中心是硒代半胱氨酸。硒是GPx酶系统的组成部分,该酶系统催化GSH向GSSG转化,将有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物,从而保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰和破坏。超氧化物歧化酶(SOD)是体内天然存在的超氧自由基清除剂,可将有害的超氧自由基转化为过氧化氢。虽然过氧化氢仍然是对身体有害的氧气,但体内的过氧化物酶立即将其分解成完全无害的水。已知CAT负责在氧化应激期间去除过量H2O2,但GPx可以微调细胞信号中的H2O2浓度。据报道,CAT-GPx协同作用对于在病理生理条件下正确控制H2O2水平很重要。这样,三种酶就形成了一条完整的抗氧化链。
本发明提供用于治疗由活性氧(ROS)引起的氧化应激(OS)引发或加速的神经退行性疾病的组合物和方法。神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA)和青光眼。
本发明提供一个或多个配体修饰的铜团簇(CuNCs)。在一些实施例中,所述配体修饰的铜团簇的直径在0.5-5nm的范围内,优选在0.5-3nm的范围内,更优选在0.5-2.5nm的范围内。在一些实施例中,所述配体包括胸腺嘧啶、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)、L(D)-半胱氨酸和其他半胱氨酸衍生物,如N-异丁酰-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰-L-半胱氨酸和N-乙酰-D-半胱氨酸,含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不限于二肽、三肽、四肽和其他含半胱氨酸的肽,如L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC),L-半胱氨酸L-组氨酸(CH),甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR),L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR),L-谷胱甘肽 (GSH),甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR),和其他含硫醇的化合物,例如1-[(2S)-2- 甲基-3-硫醇-1-氧丙基]-L-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、和十二烷基硫醇中的一个或多个。
本发明提供了用于治疗患有神经退行性疾病的受试者的组合物。在一些实施例中,所述组合物包括铜团簇(CuNCs)和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中,所述组合物包含胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中,所述组合物包含含有TMHA配体的CuNCs和药学上可接受的赋形剂。
本发明提供了铜团簇(CuNCs)在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
本发明提供了胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
本发明提供了含有TMHA配体的CuNCs在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
本发明提供了一种治疗患有神经退行性疾病的受试者的方法。
在一些实施例中,所述方法包括:向受试者施用有效剂量的包含铜团簇 (CuNCs)的组合物。
在一些实施例中,所述方法包括:向受试者施用有效剂量的包含胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)的组合物。
在一些实施例中,所述方法包括:向受试者施用有效剂量的包含含有TMHA 配体的CuNCs的组合物。
在一些实施例中,通过腹腔注射向神经退行性疾病患者施用有效量的铜团簇。在一些实施例中,通过腹腔注射向神经退行性疾病患者施用有效量的 TMHA。在一些实施例中,通过腹腔注射向神经退行性疾病患者施用有效量的含有TMHA配体的CuNCs。在一些实施例中,所述有效量为2-100mg kg-1。
本发明提供胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)及其合成方法。
TMHA的结构由图1(a)(i)的式1所示,其中HA由葡萄糖醛酸(GlcA)-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)重复序列组成,GlcNAc被胸腺嘧啶修饰,n是10-10000,优选10-1000,更优选10-100的整数。需要注意的是,HA中的不是每一个GlcNAc 被胸腺嘧啶修饰的。胸腺嘧啶在TMHA中的取代度(DS)定义为TMHA的每100 个糖残基中胸腺嘧啶分子的数量。胸腺嘧啶在TMHA中的取代度(DS)在1-50%的范围内、优选地4-30%、优选地5-20%、优选地7-16%、优选地8-15%的范围内。
合成TMHA的方法包括:
提供浓度为0.05-0.02w/v%的胸腺嘧啶酸性水溶液,在一些实施例中,酸性水溶液由水和HCl组成;
提供浓度为1-5%(重量)的HA溶液;
在HA溶液中加入催化剂;在一些实施例中,催化剂是聚磷酸酯;
将胸腺嘧啶的酸性水溶液加入含催化剂的HA溶液中,形成HA-胸腺嘧啶混合物;在一些实施例中,胸腺嘧啶的酸性水溶液通过滴注加入;
将HA-胸腺嘧啶混合物加热预定时间;在一些实施例中,加热温度为 45-50℃,在油浴中加热12-20小时;
将加热的HA-胸腺嘧啶混合物冷却到预定温度;在一些实施例中,预定温度约为0℃,以沉淀未反应的胸腺嘧啶;
将来自冷却的HA-胸腺嘧啶混合物的上清液进行透析;在一些实施例中,透析进行48-96小时,截留分子量8000,以去除未反应的试剂和杂质;
将透析液冻干,得到TMHA。
本发明还提供含有TMHA配体的CuNCs及其合成方法。
在一些实施例中,含有TMHA配体的CuNCs合成方法包括:
提供TMHA溶液;在一些实施方案中,TMHA溶液为0.1mm,pH7.0;
向TMHA溶液中加入CuSO4溶液,在一些实施方案中,CuSO4溶液为20mM, pH7.0,并且以滴状方式加入;
从而允许混合物反应;在一些实施例中,在黑暗中37℃反应20分钟以获得含有TMHA配体的CuNCs溶液;在黑暗中4℃储存含有TMHA配体的 CuNCs溶液以供使用。
在紫外光(365nm)的辐射下,可以清楚地看到亮橙红光发射,表明发光的 CuNCs成功形成。
在一些实施例中,Cu和TMHA之间的摩尔比在10:1至500:1的范围内,进一步在15:1至300:1的范围内,更进一步在20:1至200:1的范围内,更进一步在25:1至100:1的范围内,以及更进一步在30:1至80:1的范围内。
含有TMHA配体的CuNCs含有分散良好的球形纳米团簇,直径为0.5-3 nm。
avajznns提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理;它们决不旨在限制或缩小本发明的范围。
实施例一、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(TMHA)的合成
首先制备聚磷酸酯作为催化剂。将二乙醚(14.5mL)和CHCl3(5.6mL)加入五氧化二磷(10g)中,搅拌,在50℃下回流加热12h,得到澄清溶液。冷却至室温后,在真空下蒸馏除去溶剂。所得到的无色粘性残渣是聚磷酸酯,用作催化剂而无需进一步纯化。
其次,TMHA合成如下。溶于添加了0.25mL浓盐酸溶液(25%)的25mL H2O 中,得到清澈的胸腺嘧啶溶液(23.6mg)。将聚磷酸酯(1.5g)加入HA溶液(50mL,2.2wt%;MW120KD),然后滴注胸腺嘧啶,混合物在油浴中加热到50℃,16h,冷却到0℃以沉淀未反应的胸腺嘧啶。然后,通过透析袋(截留分子量8000) 对上清液透析72小时,以去除任何未反应的试剂和杂质。将得到的溶液冻干得到TMHA,产率为86%,取代度(DS)为10.5%。通过1H NMR和FT-IR对最终产物的质量进行了分析。
现在参考图1,图1(a)(ii)示出了TMHA的合成,图1(a)(iii)和(iv)分别显示了HA和TMHA的典型外观;图1(b)分别显示了TMHA(红线)和纯HA(蓝线)的紫外-可见光谱;图1(c)显示了HA和TMHA的FT-IR;以及图1(d)显示HA 和TMHA的1H NMR谱。在10mg mL-1样品浓度下,在D2O中以80℃和400MHz 进行1H NMR谱分析。在FTIR分析中,样品制备过程中使用KBr晶体作为基体。
通过比较天然HA及其衍生物的光谱,用FTIR对TMHA共轭物的化学结构进行了定性研究。与天然HA相比,这些光谱在3000-3200cm-1和1300-1800cm-1的范围内显示出显著的差异,特别是对于具有较高DS的TMHA衍生物。天然HA的特征峰分配是:3360cm-1(次级O-H伸展),2873cm-1(C-H伸展),1622cm-1 (酰胺II带,乙酰基的C-O伸展),1554cm-1(酰胺II带,N-H伸展),1380cm-1 (CH2组的不对称C-H伸展弯曲),1314cm-1(初级醇基的O-H伸展)和1026cm-1(涉及桥C-O伸展的骨骼振动)。TMHA衍生物的光谱显示三个特征峰,即3195 和3079cm-1(N-H伸展)、1730cm-1(C=O伸展)和1340cm-1(C-N伸展振动),提示胸腺嘧啶对HA的功能化。更重要的是,由于属于HA的初级醇基的O-H 伸展,在1314cm-1处的一条带消失,表明HA的GlcNAc中只有初级-OH基团与胸腺嘧啶发生反应。1H NMR分析进一步证实了成功的修饰。
实施例二、用TMHA合成含有TMHA配体的CuNCs
10mL TMHA(DS为10.5%)溶液(0.1mM,pH 7.0)逐渐加热至37℃,溶解TMHA。滴加2mL硫酸铜(20mM,pH 7.0)溶液,在黑暗下37℃再反应 20分钟。在紫外光(365nm)的照射下,可以清楚地看到亮橙红光的发射,表明发光含有TMHA配体的CuNCs成功形成。最后,将所得溶液在黑暗中4℃储存,备用。
分别详细地研究了Cu2+/TMHA的摩尔比、pH值、反应温度、反应时间等最佳合成条件。为了考察反应体系中Cu2+含量的影响,在10mL的TMHA溶液中加入2mL不同浓度的CuSO4,使反应体系中Cu2+与TMHA的摩尔比为5:1、 10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、60:1、80:1、100:1。黑暗中在37℃和pH 7.0下温和搅拌反应20min后,得到胶体样品,并用发光分光光度计进行测定。为了更好地理解pH值对含有TMHA配体的CuNCs形成的影响,在另外相同的环境条件下,以1.0M NaOH或1.0M HCl调节不同pH值,进行了一系列实验。同样研究了反应温度(20~70℃)和反应时间(1~25min)对反应的影响。用荧光分光光度计对所得样品进行测试。
现在参考图2,显示了(a)Cu2+与TMHA的摩尔比、(b)反应pH值、(c)反应温度和(d)反应时间对所得含有TMHA配体的CuNCs的光致发光强度的影响。如图2(a)所示,含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度随Cu2+与TMHA的摩尔比从5增加到40而增强,随Cu2+/TMHA比从40增加到100而逐渐降低。如图 2(b)所示,反应pH值在形成高质量的含有TMHA配体的CuNCs中起着重要作用。随着反应pH值从4增加到7,含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度显著升高,然后开始迅速下降。例如,在反应pH 10时,含有TMHA配体的CuNCs 的发射很难通过荧光光谱法监测到。如图2(c)所示,反应温度在20~50℃范围内是形成高荧光含有TMHA配体的CuNCs的理想参数。如图2(d)所示,随着合成时间从1分钟延长到8分钟,制备的含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度显著提高,当时间持续增加到25分钟时,含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度保持不变。在pH 7.0溶液中,Cu2+和TMHA的摩尔比约为40,然后在37℃下反应4h,所得含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度最高。
实施例三、含有TMHA配体的CuNCs的稳定性研究
含有TMHA配体的CuNCs发光稳定性的评价按以下步骤进行。首先,将不同浓度的氯化钠溶液(100μL)与含有TMHA配体的CuNCs溶液(900μL) 混合,在25℃下孵育30分钟;其次,将500μL的含有TMHA配体的CuNCs 溶液与各种正负离子溶液(500μL,2mM)充分混合,在25℃下孵育30分钟。再其次,将NaOH(1.0M)或HCl(1.0M)引入5mL含有TMHA配体的CuNCs 溶液中,调节体系pH值,在25℃下孵育30分钟。最后,在激发波长385nm和发射波长610nm处测量了含有TMHA配体的CuNCs的荧光光谱。
现在参考图3,显示了(a)NaCl浓度(0-1M)、(b)常见阳离子和阴离子、(c)pH 值(4-10)和(d)储存时间(0-5周)对所得含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度的影响。如图3(a)所示,在不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0M)的氯化钠溶液中,含有TMHA配体的CuNCs的荧光强度保持不变,表明含有TMHA配体的 CuNCs在强离子强度环境中具有良好的稳定性。更重要的是,在含有TMHA配体的CuNCs溶液中加入2mM其它传统金属离子,如Na+、Ba2+、Fe3+、Gd3 +、 Sn4+和阴离子,如Cl-、CO3 2-、PO4 3-、C2O4 2-、C6H5O7 3-,发现所有这些选定离子对荧光强度的干扰都可忽略不计(图3(b))。在图3(c)中也显示了类似的稳定荧光性能。将pH值从4.0调整到10.0几乎不影响含有TMHA配体的CuNCs 的相应荧光光谱。显然,在本缓冲体系中,含有TMHA配体的CuNCs对pH值不敏感。此外,在室温(25℃)下在空气中储存5周后,含有TMHA配体的CuNCs 没有观察到沉淀、絮凝或荧光强度下降(图3(d))。这些结果表明我们的含有 TMHA配体的CuNCs具有优异的稳定性,使它们在实际应用中非常有前景。
实施例四、胸腺嘧啶在TMHA中的取代度(DS)对含有TMHA配体的 CuNCs合成的影响
透明质酸(HA)和胸腺嘧啶是两个天然的生物分子,胸腺嘧啶负责有效地螯合Cu2+,HA的羟基作为金属团簇成核和生长的还原剂。本发明的发明人发现胸腺嘧啶的取代度(DS)是合成含有TMHA配体的CuNCs的一个关键调节因子。在pH 7.0的溶液中,Cu2+和TMHA的摩尔比约为50,然后在37℃下反应4h。
现在参见图4,显示用胸腺嘧啶不同取代度(DS)的TMHA制备的含有TMHA 配体的CuNCs的照片和曲线图。图4(a)和(d)分别显示了用胸腺嘧啶的DS为 3.2%的TMHA所制备的含有TMHA配体的CuNCs的TEM或AFM图像;图 4(b)和(e)分别显示了用胸腺嘧啶的DS为10.5%的TMHA所制备的含有TMHA 配体的CuNCs的TEM或AFM图像;图4(c)和(f)分别显示了用胸腺嘧啶的DS 为20.1%的TMHA所制备的含有TMHA配体的CuNCs的TEM或AFM图像。图4(g)和(h)分别显示了TMHA和含有TMHA配体的CuNCs的质谱,图4(i)和 (j)分别显示了(i)CuNCs的全区和(j)Cu 2p区的XPS光谱。在图4中,插图:(b, g,h)分别是含有TMHA配体的CuNCs纳米线、电离碎片和含有TMHA配体的 CuNCs的示意图;(e,f)组成纳米线的分离CuNCs。
胸腺嘧啶的DS为10.5%时,生成直径为1.64±0.48nm的均匀分散球形 CuNCs。相比之下,在低(3.2%)和高(20.1%)水平下,大量绒毛状CuNCs 分别以1.08±0.72nm和1.96±0.83nm直径存在。随后,在另外相同的实验因素下用空白HA替换TMHA仅显示严重融合的大分子网络(图4(i)和(j))。更令人惊讶的是,10.5%的DS可以得到直径为8.05±0.43nm的含有TMHA配体的CuNCs 纳米线的一维组装(图4(b)和(e))。当胸腺嘧啶的DS增加到20.1%时,纳米线的形状部分由于严重衰减的长度/直径比而变得模糊(图4(c)和(f))。CuNCs和线性 TMHA模板之间的微调共价键保证了CuNCs被自组装成高度有序的阵列,即含有TMHA配体的CuNCs。我们强调,基于聚集诱导发射(AIE)的概念,这种纳米线有效地改善了含有TMHA配体的CuNCs的荧光稳定性和强度(见下文)。
实施例五、用其它配体取代胸腺嘧啶
为了更清楚地检测形成纳米线的单个CuNCs,在不改变金属芯尺寸的情况下,通过生成更强的Cu-S键,胸腺嘧啶配体被硫代物取代。当GSH作为配体如预期那样形成CuNCs时,它的使用容易将母纳米线分解成其构建单元,即 CuNCs。如图5所示,图中显示了具有GSH配体的CuNCs的热重分析。这里,采用配体交换策略将母纳米线分解成其构建块,例如CuNCs。将制备好的TMHA 作为模板的CuNCs(1mL)加入GSH水溶液(0.05M,5mL)中,在室温下搅拌8h。随着反应的进行,会产生白色沉淀。在8000rpm下离心10分钟左右,收集产生的上清液;加入乙醇从上清液中沉淀出GSH稳定的CuNCs,用乙醇反复洗涤3次。最后,将产品冷冻干燥后储存在冰箱中进行长期保存。
实施例六、含有TMHA配体的CuNCs的鉴定
值得注意的是,DS在10.5%时形成完整、球形和均匀的CuNCs,通过截面轮廓分析和多分散性指数进行了验证。通过仔细计算HR-TEM图像,发现条纹间距为0.207nm,与面心金属Cu的(111)晶面非常匹配。图6显示使用胸腺嘧啶的DS分别在3.2%(蓝色)、10.5%(红色)和20.1(绿色)下获得的CuNCs的激发(在λem=613nm处测量)光谱的图。
在以下章节中,除非另有说明,有意使用了由DS为10.5%的TMHA来制备含有TMHA配体的CuNCs。
作为电子显微镜的补充,质谱(MS)已被证明是团簇尺寸分析中更可靠的工具。试图利用高分辨电喷雾电离质谱(ESI-MS)技术鉴定亚纳米CuNCs的精确分子式。值得注意的是,纯HA没有任何可见的离子信号,主要是由于它在正离子模式下电离效率低。相反,TMHA的正电离在m/z=106.1936(图4(g)) 下产生单峰。由于胸腺嘧啶HNCO的丢失,可归纳出式[C4H5NO+Na]+。在筛选了几个测量参数后得出,作为CuNCs电离中的配体,不是THMA而是C4H5NO,有助于释放出丰富的离子信号。那些因传递适当能量以促进胸腺嘧啶分解而被选为最佳的参数为毛细管电压为4500V左右,干燥温度为150℃。结合元素分析和m/z=1043.2545(图4(h))时的最高离子峰,确定CuNCs的分子式为Cu6L5。低质量范围内的其他离子峰也与Cu6相关种类的碎片精确对应。结果表明,Cu6簇是优势种类,与胸腺嘧啶的DS分别为3.2%和20.1%的TMHA对照组相比,胸腺嘧啶的DS为10.5%的TMHA合成的CuNCs具有优越的单分散性。
X射线光电子能谱(XPS)分析表明,CuNCs由所有预期的元素组成,包括C、 O、N、Cu。计算CuNCs中的无机含量为29.8wt%。此外,在932.3和952.1eV 两个强信号被指定为Cu0的2p3/2和2p1/2电子的结合能,并且没有卫星信号暗示缺少Cu2+。值得一提的是,Cu0的2p3/2结合能与Cu+的结合能非常接近。因此,制备的CuNCs的价态很可能介于0和+1之间。
现在参考图7,显示:(a)具有不同胸腺嘧啶DS的PL光谱(左)和衰减曲线 (右)。插图:365纳米激发的图像。(b)TMHA探针的PL反应相对于Cu2+含量。 (c)用于Cu2+的TMHA探针对各种金属的的PL和颜色变化(插入)。
实施例七、TMHA作为铜离子检测的探针
5份尿样,其中3份来自健康成人志愿者,其余的来自患有PD的成年志愿者,用乙腈稀释以去除尿中蛋白质和其他生物物质的干扰。在10℃,以12000rpm 的速度离心10分钟后,收集上清液用于以下实验。首先,用去离子水稀释上清液,以降低上清液中残留的Cu2+浓度。然后,将100μL尿样与200μL TMHA (0-40μg mL-1)混合,在25℃下孵育10分钟后用荧光光谱仪检测。
明显地,在560nm处,光学特征明显不同于大尺寸铜纳米粒子的表面等离子体共振。XRD峰向基线的展宽与CuNCs的微小尺寸一致。有趣的是,亚纳米级的CuNCs具有DS依赖的光致发光(PL)特征。在385nm的激发下,10.5%DS 诱导的纳米线在613nm峰处产生明亮而稳定的红光发射,长寿命为57μs,大的量子产率为14.8%(图7(a))。对于那些不那么有序的CuNCs组装,这些特性衰退迅速,暗示了自组装驱动的AIE。CuNCs更紧密和有序地包裹,则PL反应更稳定和强烈。通过调节反应因素,我们的清洁合成路线依赖于TMHA(螯合,还原Cu2+和模板自组装成CuNC纳米线),消除了传统路线引入的杂质,并提供了引人注目的PL性能。例如,TMHA传感器的PL强度是线性的,根据Cu2+浓度明确地改善(图7(b)),对应于2.2ppb的极低检测限度。与目前报道的方法相比,该分析性能比美国环保署的最新探针和饮用水最高等级分别小约1.5倍和480 倍。此外,在图7(c)中,与外来离子相比,光学性质对Cu2+有选择性。总之, TMHA可作为高灵敏度、高选择性的比色和荧光铜离子探针。
实施例八、CuNCs的抗氧化功能
研究了CuNCs功能模拟细胞抗氧化酶的能力。引人注目的是,CuNCs可以基于一级反应动力学而剧烈分解H2O2(图8(a))。然后我们通过NBT方法研究了功能模拟的GPx样活性。在各种分析条件下记录的初始速率显示在图8(b)中,它直接支持CuNCs的GPx样功能。此外,CuNCs具有非常显著的SOD样活性,从KO2作为超氧化物源产生大量O2推导出工作原理:超氧化物歧化成H2O2和 O2(图8(c))。此外,CuNCs比用作细胞抗氧化剂的现有金属具有明显的多酶优势(图8(d))。
现在参见图8,显示:(a)H2O2与CuNCs反应的紫外吸收率。(b)CuNCs 和各种对照的GPx样活性的初始速率。(c)CuNCs的SOD样活性(插图:O2生成率)。(d)CuNCs与其它金属的催化活性的比较。
实施例九、TMHA对PD的无创诊断
以TMHA为探针,测定人尿中Cu2+的含量。令人兴奋的是,红色荧光仅出现在PD患者的尿液样本中。考虑到其特异性高,操作简单,TMHA可能为PD 的早期诊断和风险评估开辟了新的机遇。
现在参考图9,显示尿液中Cu2+的检测用于PD的早期诊断。
实施例十、体外细胞保护实验
PC12(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系)、SHSY-5Y(人神经母细胞瘤细胞系)和HEK293(人胚胎肾细胞系)细胞培养,DMEM培养基,另外添加10%(v/v) 胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素;37℃, 5%CO2。
采用甲基噻唑四氮唑(MTT)法,通过测定细胞存活率,测定体外细胞毒性。为了进行MTT分析,SHSY-5Y细胞以每孔5000个存活细胞的密度接种在96 孔板中,培养24小时以允许细胞附着。然后,用空白TMHA溶液(不添加Cu2+) 在指定的浓度下培养细胞。随后将细胞在37℃和5%CO2下孵育24小时。然后用含5mg mL-1MTT的新鲜DMEM代替培养基,再培养4小时。去除MTT溶液后,用DMSO溶解紫色甲烷晶体,用微板阅读器在570nm处监测吸光度 (FL600,Bio-TEK)。结果表示为三个测量值的平均值。用同样的方法测定了纯 THMA对HEK 293细胞和PC12细胞的体外细胞毒性。TMHA在剂量高达500μg ML-1时无毒性。
在实验性PD模型中评价TMHA对细胞的保护作用。它是用MPTP(1-甲基 -4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)的活性代谢产物MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)而产生的。
1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒素。它本身无毒,但进入大脑后,新陈代谢产生的1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)会破坏黑质中DA能神经元。同时,MPP+还可以干扰线粒体代谢呼吸链中的重要物质NADH 脱氢酶,导致细胞死亡和自由基的积累。此过程导致DA能神经元大量死亡,严重影响大脑皮层的运动控制,导致类似的PD症状。因此,MPTP和MPP+被广泛用于PD相关动物模型和细胞模型的建立以及PD药物的研究和开发。
在不存在或存在Cu2+和THMA的条件下,在6孔板中培养PC12细胞。然后加入不同浓度的MPP+(0.5-4mm)。MTT法测定细胞的相对存活率。4mM MPP+触发PC12细胞的严重细胞毒性(即仅小于20%细胞存活率)。令人兴奋的是,8 μM Cu2+和10μg ml-1TMHA完全逆转4mM MPP+诱导的细胞毒性(即超过80%的细胞存活率)。细胞存活率的数据如图10(a)所示(***p<0.001)。
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞形态学变化。为了在CLSM上观察活细胞和死细胞,用3′,6′-二(O-乙酰基)-4′,5′-双[N,N-双(羧甲基)氨基甲基]荧光素 (即四乙酰氧基甲酯(钙黄素-AM))染色活细胞,产生绿色荧光 (λex=490nm,λem=515nm),用碘化丙啶(PI)染色死细胞,产生红色荧光(λex=535 nm,λem=617nm)。具体而言,在去除培养基后,分别加入0.1mL钙黄素-AM 溶液(20mM)和0.1mL PI溶液(20mM)。培养10分钟后,这两种染色液迅速去除,并用PBS漂洗两次。所获得的细胞可以随后通过CLSM观察。图10(b) 显示用PI染料染色的死(红)细胞,其中细胞处理的条件为4mM MPP+、2μM Cu2+和10μg ml-1TMHA;图10(c)显示用钙黄素-AM染色的可活(绿)细胞,其中细胞处理的条件为4mM MPP+、10μM Cu2+和10μgml-1TMHA。
为了用CLSM直接观察活性氧(ROS),首先将PC12细胞接种在CLSM专用培养盘中,在37℃,5%CO2气体下进行过夜粘附。以2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA)1mL培养20min后,用含有以下物质的新鲜培养基(pH=7.4)代替培养液:(a)4mM MPP+作为对照;(b)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA;(c)4mM MPP+, 10μM Cu2+;(d)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA,2μM Cu2+;(e)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA,4μM Cu2+;(f)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA,6μM Cu2+;(g)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA,8μM Cu2+;(h)4mM MPP+,10μg mL-1TMHA,10μM Cu2+。在37℃、5%CO2浓度下再次孵育30分钟后,用新鲜PBS洗涤细胞两次。通过检测新生DCF(λex=488nm,λem=525nm)的荧光来评价细胞内ROS水平。胞内ROS 水平的数据见图11(a);***p<0.001。
图11(b)显示了在4mM MPP+和10μgmL-1TMHA条件下处理的细胞中胞内 ROS的CLSM图像,并通过特定荧光探针DCFH-DA染色;图11(c)显示了在4 mM MPP+,10μmL-1TMHA,10μMCu2+条件下处理的细胞中胞内ROS的CLSM图像,经特定荧光探针DCFH-DA染色。ROS特异性荧光强度明显下降,表明TMHA 能有效清除细胞内升高的ROS。特征性1:2:2:1羟自由基自旋进一步证实了 TMHA处理减少胞内ROS。
实施例十一、体内保护实验
一般认为,施用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)可导致动物产生与人类散发性PD非常相似的临床症状。因此,我们的实验中,我们利用 MPTP来产生PD动物模型。C57BL/6小鼠随机分为7组(n=每组小鼠5只),即:空白对照组(生理盐水)、高剂量TMHA组(100mg kg-1)、低剂量TMHA组(50mg kg-1)、高剂量MPTP组(30mg kg-1)、低剂量MPTP组(10mgkg-1)、MPTP+TMHA 组(30mg kg-1+10mg kg-1)和MPTP+TMHA(30mg kg-1+20mg kg-1)。特别地,对于模型组,通过连续腹腔注射MPTP至少4天来产生PD小鼠模型。空白对照组和 THMA组分别用生理盐水和THMA治疗。其余MPTP+TMHA组,预先0.5h腹腔注射TMHA(10或20mg kg-1)(每天一次),然后腹腔注射30mg kg-1MPTP 7天。
通过游泳试验评估运动功能。每只动物放置在直径为120厘米和高度为80 厘米的圆形水池中。水的深度(25℃)为60厘米。使用跟踪系统(上海吉良软件技术有限公司)以10分钟间隔记录行程距离(cm 10min-1)和持续时间(sec)。使用 ROTROD(Ugo Basile)测量运动协调和平衡。小鼠在旋转杆上进行3次15分钟的试验,每次试验以10rpm开始,30s内加速至22rpm。试验间歇时间为3分钟。测量各组从杆上摔下来的时间,并进行平均。图12(a)显示记忆缺失小鼠的行走距离和跌倒潜伏期,***p<0.001。这些数据表明TMHA处理可以恢复MPTP处理的动物的认知活动。
线粒体形态学改变是ROS诱导线粒体功能障碍的早期重要标志。在这里,我们使用TEM观察线粒体形态改变。通常,C75BL/6小鼠的脑组织在放入环氧树脂之前,依次在冷的含有2.5%戊二醛的0.1M PBS(pH 7.2)和含有2%多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)的混合物中连续固定过夜。将包埋好的样品装入胶囊中,在38℃下聚合9h,然后在60℃下聚合48h。在透射电子显微镜(JEM-2100F) 检查之前,将合适的薄切片区域切成小于100nm的厚度,在80kV下用饱和4%乙酸铀酰/4%柠檬酸铅染色。图12(b)显示了用大剂量MPTP(30mgkg-1)处理的动物的线粒体,而如红线划出的轮廓,线粒体显示肿胀、空泡状形状和严重的嵴破坏;相比之下,图12(c)显示了用MPTP(30mg kg-1)+TMH(30mg kg-1)处理的动物的线粒体;如红线划出的轮廓,线粒体显示健康的形态。
实施例十二、具有不同配体的单个CuNCs的α-syn聚集动力学实验
根据文献,制备了不同配体修饰的CuNCs。硫黄素T(缩写:ThT)是一种特别用于染色淀粉样纤维的染料。当ThT与多肽或蛋白质的单体一起孵育时,其荧光没有显著变化。当ThT遇到具有纤维结构的淀粉样多肽或蛋白质时,它会立即与淀粉样多肽或蛋白质偶联,其荧光强度将呈指数增加。因此,ThT被广泛用作监测多肽或蛋白质淀粉样变性的标记物。本实施例采用ThT荧光标记法监测在CuNCs存在下α-syn的纤维化聚集动力学过程。具体实验方法如下:
α-syn单体的预处理:将冷冻干燥的α-syn粉末(Bachem Corp.)溶于HFIP中得到1g/L的α-syn溶液,封口后在室温下保温2-4h,然后在通风柜用高纯氮气以适当的流速吹干HFIP,溶解干燥α-syn在200μL DMSO,密封溶液,将其保存在20℃冰箱中以备将来使用,最多一周。使用前,用大量磷酸盐缓冲液(PBS, 10mM,pH=7.4)将α-syn DMSO溶液稀释到20μM,得到α-syn PBS溶液。实验中所有的α-SYN-PBS溶液均在使用前制备。
样品制备和检测:在α-syn PBS溶液中加入配体修饰的CuNCs,使CuNCs 和α-syn分别达到5ppm和35μM的最终浓度。37℃将溶液在96孔板中连续孵育,每10分钟用微型板读出器监测荧光强度,通过ThT荧光强度的变化鉴定α-syn聚集的动力学过程。实验组采用配体修饰的CuNCs。配体对照组采用不与 CuNCs结合的配体分子。空白对照组仅采用α-syn。
现在参考图13,显示L-谷胱甘肽(GSH)修饰的CuNCs(GSH-CuNCs)对-syn 纤维化动力学的影响。结果表明,在37℃孵育35μMα-syn的过程中,ThT标记的荧光强度从25小时开始迅速增加,表明α-syn发生了聚集和纤维化。配体对照组结果表明,单独使用配体GSH对α-syn的聚集动力学无明显影响。对于添加CuNCs的实验组,在70小时内ThT标记的荧光强度基本保持在基线附近,无任何增加,表明GSH修饰的CuNCs能完全抑制α-syn聚集和纤维化,其作用来源于CuNCs,但不是GSH配体。
在一些实施例中,还使用相同的方法研究了用其他配体修饰的CuNCs,例如L(D)-半胱氨酸、N-异丁酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NIBC)和N-乙酰基-L(D)- 半胱氨酸(L(D)-NAC)。用不同配体修饰的CuNCs也观察到类似的现象,并得出相同的结论:这些配体本身不能影响α-syn的聚集和纤维化,而配体修饰的 CuNCs可以完全抑制α-syn的聚集和纤维化。
实施例十三、MPP+诱导的PD细胞(SH-SY5Y)模型实验
本实验以CCK-8法测定的细胞存活率为指标,反映配体修饰的CuNCs对 PD SH-sy5y神经细胞模型中MPP+(一种常用的神经毒素)的毒性作用的抵抗作用,以证明其对PD的神经保护作用。具体方法:
1)取对数生长期的SH-sy5y细胞,用完全培养基稀释,形成细胞密度为 5×104/mL的细胞悬液,将200μl细胞悬液放入96孔平板的每一孔中,在37℃和5%CO2的环境中培养。在细胞附着后加入样品。
2)添加100μL配体修饰CuNCs样品或不同粒径的配体修饰铜纳米颗粒样品,样品制备于维持培养基,最终浓度分别为0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm和 20PPM。用配体修饰的CuNCs预处理2小时后,分别向给药组和细胞对照组加入MPP+(最终浓度为1mM),同时设空白对照组,不含SH-sy5y细胞,阴性对照组含SH-sy5y细胞,不含CuNCs和MPP+,含有SH-sy5y细胞和仅含1mM MPP+的细胞对照组,含有SH-sy5y细胞和100ppm CuNCs但不含MPP+的样品对照组,以及含有SH-sy5y细胞和1mM MPP+以及相应的配体分子(最终浓度为20ppm) 的配体对照组,在37℃孵育24h,离心除去培养基,加入含10%CCK-8的100μL 维持培养基,孵育4h,在450nm处测量各孔的吸光度,以反映配体修饰CuNCs 对MPP+损伤的预保护和治疗效果。
现在参考图14,显示CuNCs对MPP+损伤PD细胞(SH-sy5y)模型细胞存活率的影响。结果表明,培养24小时后,加入100ppm CuNCs,但未经MPP+处理的对照组,与空白对照组(设定为100%)相比,其细胞存活率为110±6.2% (P<0.01),提示CuNCs无毒。添加1mM MPP+,但无CuNCs模型对照组,其细胞存活率下降至58.9±5.4%(P<0.01,与空白对照组相比);配体对照组的细胞成活率为56.9±3.4%(P<0.01,与空白对照组相比),提示单独使用配体不能提高MPP+损伤细胞模型的生存能力。而添加0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm 和20ppmCuNCs各组的细胞存活率则分别提高到70.9±7.1%(P<0.001,与模型对照组相比)、89.3±4.1%(P<0.001,与模型对照组相比)、90.5±6.1%(P<0.001,与模型对照组相比)、92.8±4.8%(P<0.001,与模型对照组相比)和88.5±1.4% (P<0.001,与模型对照组相比),提示本发明提供的配体修饰的CuNCs对PD的神经细胞具有显著的保护作用,这种作用也来源于配体以外的CuNCs。
还采用相同的步骤对其它配体修饰的CuNCs进行实验,如L(D)-半胱氨酸、 N-异丁酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NIBC)和N-乙酰基-L(D)-半胱氨酸 (L(D)-NAC)。效果是相似的,所以这里将不作详细描述。
实施例十四、铜团簇(CuNCs)的表征
合成了一种或多种配体修饰的铜团簇(CuNCs),合成方法参照文献。配体包括胸腺嘧啶,L(D)-半胱氨酸和其他半胱氨酸衍生物,例如N-异丁酰-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰-L-半胱氨酸和N- 乙酰-D-半胱氨酸、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不限于二肽、三肽、四肽和其他含半胱氨酸的肽,如L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L- 半胱氨酸二肽(RC)、L-半胱氨酸L-组氨酸(CH)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-谷胱甘肽(GSH)、甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)和其他含硫醇的化合物,例如1-[(2s)-2-甲基-3- 硫醇-1-氧丙基]-L-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、硫酚、D-3-特洛洛韦醇和十二烷基硫醇中的一种或多种。
作为一个实例,以下为GSH修饰的铜团簇(CuNCs)的表征数据。
1)通过透射电镜(TEM)的形态观察
将试验粉末(GSH修饰的铜团簇样品)溶解于超纯水中,溶解至2mg/L作为样品,然后用悬滴法制备试验样品。具体方法:将5μl样品滴在铜网上,自然挥发至水滴消失,然后用JEM-2100F STEM/EDS场发射高分辨透射电镜观察样品的形态。
图15A和图15B显示了GSH修饰的铜团簇(CuNCs)的典型扫描电镜图像,并从不同的透射电镜图像计算出它们的尺寸分布。结果表明,铜团簇(CuNCs) 具有良好的分散性,其尺寸在0.5-5.0nm之间。
2)X射线光电子能谱
在ESCALAB 250xi X射线光电子能谱仪上测量了X射线光电子能谱 (XPS)。将双面导电胶(3mm×3mm)贴在铝箔上,将试验粉均匀地涂在双面胶带上,并覆盖一层铝箔。样品在8兆帕压力下保持1分钟。去除表面的残余粉末,然后切出中心样品(1mm×1mm)进行XPS测试。
图15C是铜团簇(CuNCs)中铜元素的XPS光谱。两个峰分别出现在931.98 和951.88eV,这可以归因于铜的2p3/2和2p1/2电子的结合能。942.0eV附近没有 Cu 2p3/2卫星峰证实了Cu(II)电子不存在。由于Cu(0)的结合能与Cu(I) 的结合能只有0.1eV距离,因此不可能排除Cu(I)的形成,而且在得到的GSH 修饰的铜团簇(CuNCs)中,铜的价态很可能在0和+1之间。
3)傅立叶变换红外光谱
在PerkinElemer LS 55荧光光谱仪上测试FT-IR光谱。将试验粉末溶解于超纯水中,在室温下测定。扫描范围为200-800nm,样品池为标准石英试管,光路为1cm。
图15D显示了GSH修饰的铜团簇(上)和GSH(下)的FT-IR光谱的比较。 GSH表现出许多特征性的红外波段,即COOH(1390和1500cm-1)、N-H拉伸 (3410cm-1)和NH2组N-H弯曲(1610cm-1)。在2503cm-1处观察到的峰值可归结于S-H拉伸振动模式。除S-H拉伸振动带(2503cm-1)外,GSH修饰的铜团簇均具有相应的红外特性。结果表明,S-H键发生了断裂,GSH分子通过铜- 硫键的形成与铜团簇的表面结合。
4)荧光光谱法
将试验粉末溶解于超纯水中,室温下用荧光光谱法测定。
如图15E所示,在365nm的激发峰值下,铜团簇(CuNCs)显示出峰值为595nm 的红光发射,以及约80nm的相应半峰全宽(FWHM)。值得注意的是,由于聚集诱导的发射增强,当乙醇加入到溶液中时,铜团簇(CuNCs)的FL强度将显著提高。此外,大的斯托克斯(stokes)位移(230nm)显示了荧光探针和生物成像的良好前景。
实施例十五、铜团簇(CuNCs)的CAT活性
目前,CAT活性的检测仅通过紫外吸收来表征过氧化氢在240nm处的紫外吸收强度。然而,由于合成的铜团簇在催化H2O2过程后可能会发生变化,在300 nm以下紫外吸收大大增加,因此,此实验通过观察铜团簇(CuNCs)催化H2O2产生的氧气来验证铜团簇的催化效果。此实验应观察H2O2分解产生的气泡,因此 H2O2浓度越高,实验现象越明显。实验方法如下:
在室温下,在试管中加入4ml 10%H2O2溶液,然后加入2ml 2000ppm CuNCs溶液并催化3分钟。如图16所示,左边的试管是加入了CuNCs的试管,管壁上有大量H2O2催化分解产生的O2气泡;右侧为加入等体积超纯水的对照组,无明显气泡。实验结果表明CuNCs具有优异的过氧化氢酶活性。
实施例十六、铜团簇(CuNCs)的GPx activity活性
通过5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)显色试验研究铜团簇的GPx活性。GPx促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成水和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。含硫醇的化合物可与DTNB反应,裂解DTNB的二硫键,生成2- 硝基-5-硫代苯甲酸(NTB-),其可在中性或碱性pH条件下在水中电离形成NTB2-二价阴离子。NTB2-可以通过测量412nm处的吸光度来定量,从而定量反应中 GSH的量。
实验步骤如下:
将下列试剂在室温下依次加入试管中:
(1)0.2ml一定浓度的CuNCs溶液(适量的CuNCs溶解于PBS缓冲液中);
(2)0.5ml GSH(1mM)(适量GSH粉溶解于PBS缓冲液中);
(3)0.5ml H2O2溶液(1.5mM);
(4)0.2ml含1%柠檬酸钠的DTNB(1mM)(0.3g柠檬酸三钠二水合物溶于 30ml PBS缓冲液中,DTNB溶解其中,超声处理)。
通过轻轻摇动试管来混合溶液以检测紫外光谱。
在空白组中,CuNCs溶液更换为0.2ml PBS缓冲液;实验组通过改变铜团簇的浓度和催化时间来研究催化效果。
图17a显示不同浓度铜团簇(30ppm、60ppm、90ppm、120ppm、150ppm) 在室温下催化5分钟得到的实验结果。发现随着催化剂浓度的增加,412nm处的紫外吸收显著降低,说明体系中的GSH随着催化剂浓度的增加而降低。这也意味着随着催化剂的增加,更多的H2O2氧化了GSH。
为了观察后续实验的结果,延长了反应时间。图17b显示催化13分钟后的结果。铜团簇浓度为30ppm和60ppm时,紫外吸收继续降低,表明催化反应继续进行;同时,当铜纳米团簇浓度达到90ppm或更高时,反应几乎停止,表明 GSH几乎被完全催化。因此,选择90ppm进行连续监测。
图17c表明开始时催化较慢,随着反应的进行催化速率逐渐增加,在第11-13 分钟催化反应基本完成。
实施例十七、铜团簇(CuNCs)的SOD活性
SOD活性测定采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物)。总之,黄芪与黄嘌呤氧化酶反应生成超氧化物,进一步还原WST-1[2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑];在440nm的紫外光谱中检测到产生的甲臜。通过加入铜团簇观察440nm处紫外吸收的减少来判断SOD活性。
底物工作液的制备:底物原液:缓冲液以1:200的比例混合形成当前使用的底物工作液。
酶工作液的制备:酶原液:酶稀释液以1:10的比例混合制得当前使用的酶工作液。
实验组设置如下:
根据以上设置,向96孔板中的孔依次添加:(1)底物工作液;(2)酶稀释液; (3)测试样品或蒸馏水;以及(4)酶工作液。充分混匀,在酶标仪中于37℃孵育,并在450nm处读取UV吸光度。
图18a显示了在与不同浓度的CuNCs孵育60分钟期间45nm处的UV吸光度。如图18a所示,随着CuNCs添加浓度的增加,UV吸收值在培养期间逐渐降低,每个剂量的CuNCs的紫外(UV)吸收值在30分钟后趋于稳定;这些证明CuNCs具有优异的SOD活性,其SOD活性随着CuNCs浓度的增加而增加。综合以上结果,选取孵育20min时的紫外吸收值计算SOD抑制率。如图18b 所示,CuNCs在60ppm、90ppm、120ppm、150ppm和180ppm下的SOD抑制率分别为16.9%、23.2%、33.7%、44.8%和55.2%。SOD活性是指反应体系中 SOD抑制率达到50%时,一个SOD活性单位对应的酶量。因此,以150ppm CuNCs为例,其SOD活性为10.24U/mg。
实验结果表明合成的GSH-CuNCs具有三种不同结构和功能的主要抗氧化酶的酶活性:过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)。
实施例十八、H2O2诱导的青光眼细胞(RGC-5)模型
在本实施例中,以细胞存活率作为指标来测试配体修饰的铜团簇(CuNCs) 对H2O2诱导的细胞毒性的影响;cck-8测定的结果表明,CuNCs对视网膜神经节细胞(RGC)中氧化应激诱导的损伤具有神经保护作用。
对数生长期的RGC-5细胞用完全培养基(DMEM培养基+10%FBS+1%青霉素-链霉素)稀释成密度为5×104/mL的细胞悬液,于96孔板中每孔接种100μL。细胞在37℃5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁后弃去原培养液,将由维持培养基(DMEM培养基+2%FBS+1%青霉素-链霉素)制备的不同浓度CuNCs 50μL 加入不同孔中。最终浓度分别为0.5、5和20ppm(即图19中的第5、6、7组)。预处理2h后,加入约50μL H2O2(终浓度105μM)。细胞培养24h,每孔加入10%CCK-8培养4h。在450nm波长处测量各孔的吸光度值,以评估CuNCs 对H2O2诱导损伤的保护作用。在上述实验中,提供了未处理细胞的空白对照组、用105μM H2O2处理细胞的模型对照组、加入100ppm CuNCs但不加入H2O2的 CuNCs对照组、以及添加了20ppm配体和105μMH2O2的配体对照组(分别为图19中第1、2、3、4组)。
如图19所示,以GSH修饰的CuNCs的实验结果为例。结果显示,培养24 小时后,添加100ppm CuNCs但未用H2O2处理的铜团簇对照组(即第2组)的细胞存活率相对于空白对照组(即第1组)(100%)(P>0.05)为103.2±7.0%,表明CuNCs无毒。添加100μM H2O2但不含CuNCs的模型对照组(即第3组) 的细胞存活率降低至空白对照组的58.0±6.2%(P<0.005)。添加20ppm GSH 和100μM H2O2的配体对照组(即第4组)的细胞存活率为空白对照组(与空白对照组比较P<0.01,与模型对照组比较P>0.05)的56.5±5.9%,表明单独使用配体不会增加H2O2诱导的损伤细胞模型中的细胞存活率。0.5ppm(即第5组)、5ppm(即第6组)和20ppm(即第7组)CuNCs给药组的细胞存活率增加至 65.9±4.5%(与模型对照组比较P<0.05)、87.1±7.4%(与模型对照组比较P<0.01)、 91.2±5.7%(与模型对照组比较P<0.01)。
以上结果表明,本发明的CuNCs在H2O2诱导的损伤RGC细胞模型中可显著提高细胞存活率,表明它可以抵抗氧化应激诱导的RGC细胞凋亡,而GSH 对氧化应激诱导的RGC细胞凋亡没有明显影响。
其他配体修饰的CuNCs也按照同样的步骤进行了测试,效果相似,在此不再赘述。
尽管本发明参照特异的实施方式来描述,但是将被理解的是,实施例是说明性的,本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此,本发明的范围由所附的权利要求被描述,由前面的描述所支持。
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