一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法
阅读说明：本技术 一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法 (General kit and method for rapidly extracting total nucleic acid of biological sample ) 是由 唐勇军 刘小龙 黄婷 罗俭康 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法,通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒,包括：Buffer ATL、Proteinase K、MBs磁珠、Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII、Buffer ES、Buffer MDS。与现有核酸提取技术相比,本发明技术方案的有益效果为：无需对血液制品进行预处理,裂解结合一步完成,大大节省了全血基因组核酸提取的时间；使用Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII三种洗涤液可以洗去样本中绝大部分的蛋白、酚类、多糖等抑制杂质,最大限度的减少杂质的污染对下游实验的干扰；本发明试剂盒及方法可通用于多种来源样本的核酸提取,适用范围广。(The invention discloses a general kit and a method for rapidly extracting total nucleic acid of a biological sample, wherein the general kit for rapidly extracting the total nucleic acid of the biological sample comprises the following components: buffer ATL, protease K, MBs magnetic beads, Buffer WSI, Buffer WSII, Buffer WSIII, Buffer ES and Buffer MDS. Compared with the prior nucleic acid extraction technology, the technical scheme of the invention has the beneficial effects that: the blood product is not required to be pretreated, and the cracking is completed in one step, so that the time for extracting the whole blood genome nucleic acid is greatly saved; the three washing solutions of Buffer WSI, Buffer WSII and Buffer WSIII can be used for washing away most of protein, phenols, polysaccharides and other inhibitory impurities in the sample, so that the interference of the pollution of the impurities on downstream experiments is reduced to the maximum extent; the kit and the method can be universally used for extracting nucleic acid from various source samples, and have wide application range.)
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法。
背景技术
核酸检测越来越被广泛地应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测等领域。目前来说，测序和荧光定量PCR这两项技术已经成为基因多态性检测的主流工具，数字PCR也在逐渐开始使用。然而，无论是测序还是qPCR，提取和纯化核酸都是必不可少的技术环节；
在传统和商业化的核酸提取方法中，以离心柱抽提法和酚-氯仿抽提法是两种最经典，也是应用最为普遍的方法，常应用于病原体检测机构和研究机构。虽然这两种方法提取的核酸质量高，但操作时间长，效率较低且自动化难度大。最重要的是，在实验中使用苯酚，氯仿等有毒试剂会对操作人员和生态环境造成极大危害。而纳米磁珠分离纯化技术，无需离心，无需接触有毒试剂，操作简单方便，易于实现自动化，实现快速，高质量的样品核酸提取。目前，磁珠法用于血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出核酸的应用逐渐丰富，但普遍功能单一，难以应对复杂样本的使用场景。为更有效的解决并简化复杂样本核酸分析，研发一个能够通用地使用在多种样本核酸提取的试剂盒及方法即为必要。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法，方便对不同的样本提取核酸。
本发明的技术方案如下：提供一种通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，包括：Buffer ATL、Proteinase K、MBs磁珠、Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII、BufferES、Buffer MDS。
所述Buffer ATL为包含有：盐酸胍、月桂酰肌氨酸钠、异丙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer ATL的pH为5.0-8.0；其中，盐酸胍的浓度为1-6mol/L，月桂酰肌氨酸钠的浓度为1-15wt％，异丙醇的浓度为40-60％v/v，所述Tris-HCl缓冲液浓度为10-50mmol/L。
所述Proteinase K为包含有：蛋白酶k、KCl、甘油的Tris-HCl缓冲液，ProteinaseK的pH为5.0-8.0；其中，蛋白酶k的浓度为20-50mg/mL，KCl的浓度为50-150mmol/L，甘油的浓度为30-50％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
所述MBs磁珠为包含有：羟基磁珠或羧基磁珠、NaCl、无水乙醇的Tris-HCl缓冲液，MBs磁珠的pH为5.0-8.0；其中，所述羟基磁珠或羧基磁珠的浓度为1-5mg/mL，粒径为200-1500nm；NaCl的浓度为100-500mmol/L，无水乙醇的浓度为15-25％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
Buffer WSI为包含有：NaCl、异丙醇、PEG的Tris-HCl缓冲液；Buffer WSI的pH5.0-8.0；其中，NaCl的浓度为500-1000mmol/L，异丙醇的浓度为75-85％v/v，PEG的浓度为35-45wt％，其中PEG分子量范围在4000-10000，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
Buffer WSII为包含有异丙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer WSII的pH为5.0-8.0；其中，异丙醇的浓度为75-85％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为50-100mmol/L。
Buffer WSIII为包含有KCl的Tris-HCl缓冲液，Buffer WSIII的pH为6.8-9.0；其中，KCl的浓度为0.85-2wt％，Tris-HCl缓冲液的浓度为40-120mmol/L。
所述Buffer ES为含有乙二胺四乙酸二钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，乙二胺四乙酸二钠的浓度为1.0±0.2mmol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10±1mmol/L，Buffer ES的pH为6.0-8.0。
所述Buffer MDS为包含有NaCl、无水乙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer MDS的pH为5.0-8.0；其中，NaCl的浓度为100-500mmol/L，无水乙醇的浓度为15-25％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为6-16mmol/L；所述Buffer MDS为MBs磁珠的稀释剂；所述Buffer MDS应用于自动化操作。
本发明提供两种具体的通用型快速提取生物样本总核酸的方法，第一种方法为手动操作方法，基于通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，包括以下步骤：
S1：取容器，加入Proteinase K、样本、MBs磁珠以及Buffer ATL，混匀后在50-60℃加热4-20分钟，期间每隔1-2分钟颠倒混匀一次；其中，Buffer ATL：Proteinase K：MBs磁珠：样本的体积比为：50-80：2-4：4-8：8-30；优选的，Buffer ATL为500-800μL，ProteinaseK为20-40μL，MBs磁珠为40-80μL，样本为80-300μL；
S2：孵育结束后，将容器冷却至室温，转移容器至磁力架上，磁富集后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁珠或羧基磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架磁吸附至溶液澄清。
S3：取下容器，加入Buffer WSI，混匀，将容器置于磁力架上，磁富集后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁珠或羧基磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附至溶液澄清，吸弃上清；其中，Buffer WSI：Buffer ATL的体积比为6-8：5-8；优选的，BufferWSI为600-800μL
S4：取下容器，加入Buffer WSII，混匀，将容器置于磁力架上，磁富集后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁珠或羧基磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附至溶液澄清，吸弃上清；其中，Buffer WSII：Buffer WSI的体积为1：1；优选的，BufferWSII为600-800μL
S5：取下容器，加入Buffer WSIII，混匀，将容器置于磁力架上，磁富集后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的羟基磁珠或羧基磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附至溶液澄清，吸弃上清；其中，Buffer WSIII：Buffer WSI的体积为1：1；优选的，BufferWSIII为600-800μL
S6：将容器置于磁力架上，室温开盖干燥至羟基磁珠或羧基磁珠表面无泛光，则表明已干燥充分；
S7：加入Buffer ES，混匀，于60-70℃加热2-15分钟；其中，Buffer ES：Buffer WSI的体积比1：6-10；优选的，Buffer ES为80-100μL；
S8：孵育结束后轻轻振荡容器混匀羟基磁珠或羧基磁珠，将容器置于磁力架上磁吸复至溶液澄清，小心转移上清至保存管并保存于-20℃以下待用。
进一步地，混匀采用涡旋震荡混匀，涡旋震荡10-100秒；磁富集的时间为5-60秒，磁吸附的时间为10-100秒。
优选的，所述容器采用离心管。
本发明提供两种具体的通用型快速提取生物样本总核酸的方法，第二种方法应用于自动化设备操作，包括以下步骤：
SS1：准备无菌的96深孔板，96深孔板为8行*12列；其中，第1列和/或第7列的孔内加入500-800μL Buffer ATL、Proteinase K 20-40μL；第2列和/或第8列的孔内加入MBs磁珠40-80μμL、Buffer MDS 600-800μL；第3列和/或第9列的孔内加入Buffer WSI 600-800μL；第4列和/或第10列的孔内加入Buffer WSII 600-800μL；第5列和/或第11列的孔内加入Buffer WSIII 600-800μL；第6列和/或第12列的孔内加入Buffer ES 80-100μL；
SS2：向含有Buffer ATL、Proteinase K的孔内加入50-200μL样本；
SS3：将96深孔板送入仪器，由内向外孔板行序列依次为A-H，按下列程序进行：
SS31：裂解，将第1列和/或第7列的孔内的溶液充分混合，在50-60℃加热4-20分钟；
SS32：移磁，磁吸30-90秒，将第2列和/或第8列的孔内的羟基磁珠或羧基磁珠吸附后，加入至第1列和/或第7列的孔内，充分混合后；
SS33：结合，第1列和/或第7列的孔内的溶液充分混合，在50-60℃加热4-20分钟，然后磁吸60-120秒，将羟基磁珠或羧基磁珠吸附；
SS34：第一清洗，将步骤SS33中吸附的羟基磁珠或羧基磁珠转移至第3列和/或第9列的孔内，充分混合后，然后磁吸60-120秒，将羟基磁珠或羧基磁珠吸附；
SS35：第二次清洗，将步骤SS34中吸附的羟基磁珠或羧基磁珠转移至第4列和/或第10列的孔内，充分混合后，然后磁吸60-120秒，将羟基磁珠或羧基磁珠吸附；
SS36：第三次清洗，将步骤SS35中吸附的羟基磁珠或羧基磁珠转移至第5列和/或第11列的孔内，充分混合后，然后磁吸20-80秒，将羟基磁珠或羧基磁珠吸附；
SS37：洗脱，将步骤SS36中吸附的羟基磁珠或羧基磁珠转移至第6列和/或第12列的孔内，充分混合，在60-70℃加热3-20分钟，然后磁吸20-80秒，将羟基磁珠或羧基磁珠吸附；
SS38：弃磁，将将步骤SS37中吸附的羟基磁珠或羧基磁珠转移至第2列和/或第8列的孔内；
SS4：将第6列和/或第12列的孔孔内的液体全部转移至保存管并保存至-20℃以下备用。
若样本不足时(少于200μL)，则向样品中加生理盐水或PBS补足。
所述96孔反应板单孔最大装液量需小于1.0mL。
采用上述方案，本发明提供一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法，待提取的全血、血浆/血清，无需进行预处理，Proteinase K、MBs磁珠以及Buffer ATL直接与血液制品混合，裂解结合一步即可完成，极大缩短了时间。此外，本发明试剂盒可应用于多个物种生物制品核酸的提取，包括哺乳类、鸟类、细菌等多种生物；提取过程既可以手工完成，也可以应用于全自动核酸提取仪自动完成；使用本发明试剂盒提取的核酸可直接应用于PCR扩增、qPCR基因分型、基因测序等科研或法医鉴定或临床诊断的分析。与现有通用型核酸提取技术相比，本发明技术方案的有益效果为：
1.无需对血液制品进行预处理，裂解结合一步完成，大大节省了全血基因组核酸提取的时间；
2.使用Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII三种洗涤液可以洗去样本中绝大部分的蛋白、酚类、多糖等抑制杂质，最大限度的减少杂质的污染对下游实验的干扰；
3.本发明试剂盒及方法可通用于多种来源样本的核酸提取，适用范围广；
4.本发明试剂盒应用于核酸提取仪，可一步完成全血核酸的提取，并可同时进行1-16个甚至更高通量的全血样本核酸提取，实现核酸提取的自动化。
附图说明
图1为采用实施例1方法提取的16个人血样本的核酸进行电泳的结果；
图2为采用实施例2方法提取三种不同血液样本核酸进行电泳的结果；
图3为采用实施例2方法提取细菌培养物样本核酸进行电泳的结果；
图4为采用实施例2方法提取血浆与血清样本核酸进行电泳的结果；
图5为采用实施例2方法提取6个人的全血样本核酸进行PCR的电泳结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，包括：Buffer ATL、Proteinase K、MBs磁珠、Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII、Buffer ES、BufferMDS。
所述Buffer ATL为包含有：盐酸胍、月桂酰肌氨酸钠、异丙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer ATL的pH为5.0-8.0；其中，盐酸胍的浓度为1-6mol/L，月桂酰肌氨酸钠的浓度为1-15wt％，异丙醇的浓度为40-60％v/v，所述Tris-HCl缓冲液浓度为10-50mmol/L。
所述Proteinase K为包含有：蛋白酶k、KCl、甘油的Tris-HCl缓冲液，ProteinaseK的pH为5.0-8.0；其中，蛋白酶k的浓度为20-50mg/mL，KCl的浓度为50-150mmol/L，甘油的浓度为30-50％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
所述MBs磁珠为包含有：羟基磁珠或羧基磁珠、NaCl、无水乙醇的Tris-HCl缓冲液，MBs磁珠的pH为5.0-8.0；其中，所述羟基磁珠或羧基磁珠的浓度为1-5mg/mL，粒径为200-1500nm；NaCl的浓度为100-500mmol/L，无水乙醇的浓度为15-25％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
Buffer WSI为包含有：NaCl、异丙醇、PEG的Tris-HCl缓冲液；Buffer WSI的pH5.0-8.0；其中，NaCl的浓度为500-1000mmol/L，异丙醇的浓度为75-85％v/v，PEG的浓度为35-45wt％，其中PEG分子量范围在4000-10000，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-50mmol/L。
Buffer WSII为包含有异丙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer WSII的pH为5.0-8.0；其中，异丙醇的浓度为75-85％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为50-100mmol/L。
Buffer WSIII为包含有KCl的Tris-HCl缓冲液，Buffer WSIII的pH为6.8-9.0；其中，KCl的浓度为0.85-2wt％，Tris-HCl缓冲液的浓度为40-120mmol/L。
所述Buffer ES为含有乙二胺四乙酸二钠的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，其中，乙二胺四乙酸二钠的浓度为1.0±0.2mmol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10±1mmol/L，Buffer ES的pH为6.0-8.0。
所述Buffer MDS为包含有NaCl、无水乙醇的Tris-HCl缓冲液，Buffer MDS的pH为5.0-8.0；其中，NaCl的浓度为100-500mmol/L，无水乙醇的浓度为15-25％v/v，Tris-HCl缓冲液的浓度为6-16mmol/L；所述Buffer MDS为MBs磁珠的稀释剂；所述Buffer MDS应用于自动化操作。
实施例1
本发明提供一种通用型快速提取生物样本总核酸的方法，为手动操作方法，基于前述的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，包括以下步骤。
S1：取1.5mL离心管，加入20μL Proteinase K、200μL样本、40μL磁珠MBs以及500μLBuffer ATL，涡旋混匀30秒后56℃水浴或金属浴10分钟，期间每隔2分钟颠倒混匀一次。
S2：孵育结束后，待冷却至室温转移离心管至磁力架上，磁富集10秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架磁吸附50秒至溶液澄清。
S3：取下离心管，加入600μL Buffer WSI，涡旋振荡30秒混匀，将离心管置于磁力架上，磁富集10秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附50秒至溶液澄清，吸弃上清。
S4：取下离心管，加入600μL Buffer WSII，涡旋振荡30秒混匀，将离心管置于磁力架上，磁富集10秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附50秒至溶液澄清，吸弃上清。
S5：取下离心管，加入600μL Buffer WSIII，涡旋振荡30秒混匀，将离心管置于磁力架上，磁富集10秒后上下颠倒磁力架，将可能残留在管盖上的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架，磁吸附50秒至溶液澄清，吸弃上清。
S6：将离心管置于磁力架上，室温开盖干燥5-10分钟至磁珠表面无泛光，则表明已干燥充分。
S7：加入100μL Buffer ES，涡旋振荡3-5秒或吹吸混匀，于65℃水浴或金属浴5分钟。
S8：孵育结束后轻轻振荡离心管混匀磁珠，将离心管置于磁力架上磁吸1分钟至溶液澄清，小心转移上清至保存管并保存于-20℃待用。
请参阅图1，图1为采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，按照实施例1提取的16个人血样本的核酸进行电泳的结果，从图1中可以看出，获得的核酸样品完整性较好，核酸片段主要集中在15kbp以上(>1700bp)，无明显的降解发生，合适地满足NGS测序以及绝大多数技术的样品质量要求。
实施例2
本发明提供一种通用型快速提取生物样本总核酸的方法，为机器操作方法，基于前述的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，包括以下步骤。SS1：准备96深孔板，按表1在96深孔板中计入相应组分。
表1
列
组分
列
组分
1/7
Buffer ATL 500μL+Proteinase K 20μL
4/10
Buffer WSII 600μL
2/8
MBs磁珠40μL+Buffer MDS 600μL
5/11
Buffer WSIII 600μL
3/9
Buffer WSI 600μL
6/12
Buffer ES 100μL
SS2：向含有Buffer ATL、Proteinase K的孔内加入200μL样本；
SS3：将96深孔板送入仪器，由内向外孔板行序列依次为A-H，按表2所示程序步骤进行：
表2
SS4：将第6列和/或第12列的孔孔内的液体全部转移至保存管并保存至-20℃以下备用。
若样本不足时(少于200μL)，则向样品中加生理盐水或PBS补足。
所述96孔反应板单孔最大装液量需小于1.0mL。
表3为采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，按照实施例2的方法在核酸提取仪提取三种不同血液样本核酸样品。图2为对表3中获得的核酸样本进行电泳的结果，从图2中可以看出，在多种不同的血液核酸提取中都能达到极好的均一性，结果稳定且无核酸片段降解完整性好。
表3
请参阅图3，图3为采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，按照实施例2的方法在核酸提取仪提取细菌培养物样本核酸的电泳结果，从图3中可以看出，相比于单一的分离纯化DNA和RNA，本方案能够同时获得细菌样本中的DNA(>15kb)和RNA(<7kb)，无需单独分离DNA和RNA，简单快速。
请参阅图4，图4为采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，按照实施例2的方法在核酸提取仪提取血浆与血清核酸的电泳结果，其中，序号1、2、3为血浆样本，序号4、5、6为血清样本；从图4中可以看出，本方案能够回收血浆与血清中含量较少、片段分布范围广的核酸，对于不同片段大小的核酸都能吸附回收，通用性强。
请参阅图5，图5为采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒，按照实施例2的方法在核酸提取仪提取6个人(每个人两个样本)的全血样本核酸进行PCR的电泳结果，其中，序号1为空白样本，序号2、3为1个人的两个样本，序号4、5为同一个人的两个样本，序号6、7为同一个人的两个样本，序号8、9为同一个人的两个样本、序号10、11为同一个人的两个样本，序号12、13为同一个人的两个样本；从图5中可以看出，PCR产物条带清晰且均一，特异性强，无抑制性组分的残留，纯度较好。
从图1-图5的结果可以看出，采用本发明的通用型快速提取生物样本总核酸试剂盒及方法提取到的不同种类生物制品的核酸样本降解少、完整性较好、质量好。均一性优异，无需单独分离DNA和RNA，特异性强，无抑制性组分的残留。能够应用于多个物种生物制品核酸的提取，充分满足通用的需求，十分有利于推广应用，市场前景好。
综上所述，本发明提供一种通用型快速提取生物样本总核酸的试剂盒及方法，待提取的全血、血浆/血清，无需进行预处理，Proteinase K、MBs磁珠以及Buffer ATL直接与血液制品混合，裂解结合一步即可完成，极大缩短了时间。此外，本发明试剂盒可应用于多个物种生物制品核酸的提取，包括哺乳类、鸟类、细菌等多种生物；提取过程既可以手工完成，也可以应用于全自动核酸提取仪自动完成；使用本发明试剂盒提取的核酸可直接应用于PCR扩增、qPCR基因分型、基因测序等科研或法医鉴定或临床诊断的分析。与现有通用型核酸提取技术相比，本发明技术方案的有益效果为：
1.无需对血液制品进行预处理，裂解结合一步完成，大大节省了全血基因组核酸提取的时间；
2.使用Buffer WSI、Buffer WSII、Buffer WSIII三种洗涤液可以洗去样本中绝大部分的蛋白、酚类、多糖等抑制杂质，最大限度的减少杂质的污染对下游实验的干扰；
3.本发明试剂盒及方法可通用于多种来源样本的核酸提取，适用范围广；
4.本发明试剂盒应用于核酸提取仪，可一步完成全血核酸的提取，并可同时进行1-16个甚至更高通量的全血样本核酸提取，实现核酸提取的自动化。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。