一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用
阅读说明：本技术 一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用 (HCR-DNAzyme probes for detecting nucleic acid and application thereof ) 是由 陈俊 杨子中 刘碧蓉 陈金香 谢宝平 段文军 田元新 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物学技术领域,公开了一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用。该探针,包含探针H1、探针H2和底物链H3。该HCR-DNAzyme探针可以特异性识别目标核酸,实现基于DNAzyme辅助的杂交链反应(HCR)的指数级信号放大,反应动力学提高,检测限降低,仅为3.28fM,相比传统的HCR探针检测限降低了5个数量级(传统的HCR探针的检测限为0.78nM),同时,检测灵敏度比传统的DNAzyme探针提高了5个数量级,即本发明提供的HCR-DNAzyme探针灵敏度高、检测限低、特异性强；并且具有更优的反应动力学。(The invention belongs to the technical field of molecular biology, and discloses a group of HCR-DNAzyme probes for detecting nucleic acid and application thereof. The probe comprises a probe H1, a probe H2 and a substrate chain H3. The HCR-DNAzyme probe can specifically recognize target nucleic acid, realizes exponential signal amplification based on DNAzyme assisted Hybrid Chain Reaction (HCR), improves reaction kinetics, reduces detection limit which is only 3.28fM, reduces 5 orders of magnitude compared with the detection limit of the traditional HCR probe (the detection limit of the traditional HCR probe is 0.78nM), and simultaneously improves detection sensitivity by 5 orders of magnitude compared with the traditional DNAzyme probe, namely, the HCR-DNAzyme probe provided by the invention has high sensitivity, low detection limit and strong specificity; and has better reaction kinetics.)
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类短的非编码RNA(长度为18～23个碱基)，是细胞发育过程中许多生物学过程的核心因素之一。miRNA在许多必不可少的细胞过程(包括细胞增殖，迁移和凋亡)中发挥关键作用；其异常表达水平与恶性肿瘤的发生，转移和进展有关。大量研究表明，microRNA是一类稳定的肿瘤标志物，对microRNA进行检测有助于了解肿瘤的发展状况或用于疾病诊断。microRNA具有序列相似度高、丰度低的特点，开发高选择性高灵敏度的microRNA检测方法是一个大的挑战。RT-qPCR是目前miRNA检测的金标准，灵敏度高。然而，RT-qPCR对热循环温度控制的高度依赖，对仪器的高要求以及复杂的样品制备，使其在临床上的应用受到了极大的限制。同时，该方法仅能够检测组织或细胞等样品RNA提取物中microRNA的平均含量，无法获得microRNA的空间信息。活细胞内microRNA的原位成像检测能够获取microRNA在活细胞内的表达水平和空间信息，是研究的热点和难点。
近来，恒温核酸扩增技术由于其反应条件温和，在恒温条件下即可实现高效扩增，被认为是实现活细胞内高灵敏核酸检测的有效方法。恒温核酸扩增技术主要分为基于生物酶的恒温扩增技术和无生物酶参与的恒温核酸扩增技术。生物酶难以转染进活细胞，然而核酸探针在一些纳米载体如金纳米粒子、石墨烯、二氧化锰等作用下能被有效转运进活细胞，无生物酶参与的扩增反应被逐渐用于活细胞内miRNA的成像分析。无生物酶参与的恒温扩增技术主要有催化发夹自组装反应(CHA)、杂交链反应(HCR)或基于功能核酸酶DNAzyme的信号放大方法。CHA是一种不依赖酶的链取代催化级联反应，在此系统中，目标序列可充当触发剂和催化剂，不断诱导探针之间的组装，实现信号的增强。杂交链反应(hybridization chain reaction(HCR))技术是由Dirks和Pierce等建立起来的一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术。在HCR体系中，靶分子引发两种DNA发夹结构的茎环交替开环，自组装形成包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构，放大效率达104～106倍。DNAzyme是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有RNA裂解活性的DNA分子，具有核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能及高效性和高特异性，金属辅助的脱氧核酶催化剂(DNAzymes)是用于在金属离子存在下裂解特定底物的基于DNA的催化剂，被广泛用于构建“一对多”信号扩增策略。尽管上述方法广泛用于活细胞内miRNA的分析，然而这些方法均为线性扩增，扩增效率有限，仅能检测细胞内含量低至pM水平的miRNA。然而，细胞内部分miRNA的含量低至aM水平，因此开发更高扩增效率的信号放大策略实现细胞内miRNA的高灵敏分析仍然是一大挑战。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针。
本发明第二方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米片。
本发明第三方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米片的制备方法。
本发明第四方面的目的，在于提供一种检测核酸的试剂盒。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针、本发明第二方面的纳米片、或第四方面的试剂盒在非疾病诊断用途的核酸检测中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种非疾病诊断用途的核酸检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针，包含探针H1、探针H2和底物链H3；
所述探针H1从5’到3’依次包括：A序列、B序列和C序列；
所述C序列与目标核酸互补；
所述B序列为任意4～6个碱基组成的序列；优选地，所述B序列为任意4～6个脱氧核苷酸组成的序列；进一步优选地，所述B序列为CACAC；
所述A序列与C序列的5’端互补；优选地，所述A序列与C序列的5’端的第1～14位碱基互补；
所述探针H2从5’到3’依次包括：D序列、E序列、F序列、G序列、H序列和I序列；
所述D序列为AAACCGAGGCTAGC(SEQ ID NO.8)；
所述E序列和所述H序列为一个碱基，所述E序列和所述H序列互补；优选地，所述E序列和所述H序列为一个脱氧核苷酸；
所述F序列与所述A序列和B序列连接而成的序列互补；
所述G序列与C序列互补；
所述I序列为TACAACGACGCCTGC(SEQ ID NO.9)；
所述底物链H3从5’到3’依次包括：G序列、J序列和K序列；
所述J序列为CG/rA//rU/CGGTTT(SEQ ID NO.10)，其中，rA为腺嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；
所述K序列与G序列的5’端互补；优选地，所述K序列与G序列的5’端的第1～14位碱基互补；
优选地，所述K序列的第2～13位碱基中有一个碱基错配；进一步优选地，所述K序列的第5～10位碱基中有一个碱基错配；从而降低K序列与G序列形成的双链的稳定性。
优选地，所述探针H1上修饰有第一荧光基团，所述探针H2上修饰有第二荧光基团，且所述第一荧光基团与所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光发色基团，其中一个荧光发色基团(供体)的发射光谱与另一荧光发色基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当供体分子被激发后，受体与供体相距一定合适的距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量通过偶极子的介导转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。本发明在探针H1和探针H2上分别修饰第一荧光基团和第二荧光基团，在两个探针发生杂交链反应后，两个荧光基团会因为靠近，导致荧光共振能量转移，从而实现对目标核酸的检测。
优选地，所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Cy5；或
所述第一荧光基团为Cy5，所述第二荧光基团为Cy7；或
所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Alexa488；或
所述第一荧光基团为Rhodamine，所述第二荧光基团为FITC。
优选地，所述核酸为miRNA。
优选地，所述核酸为miR-1246时，
所述探针H1的序列为：5’-ATTTTTGGAGCAGGCACACCCTGCTCCAAAAATCCATT-3’(SEQID NO.1)；
所述探针H2的序列为：5’-AAACCGAGGCTAGCCGTGTGCCTGCTCCAAAAATAATGGATTTTTGGAGCAGGGTACAACGACGCCTGC-3’(SEQ ID NO.2)；
所述底物链H3的序列为：5’-AATGGATTTTTGGAGCAGGCG/rA//rU/CGGTTTTCCAAATATCCATT-3’(SEQ ID NO.3)；其中，rA为腺嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；
所述miR-1246的序列为：5’-AAUGGAUUUUUGGAGCAGG-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明的第二个方面，提供一种检测核酸的纳米片，包含：本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针和MnO2纳米片。
优选地，所述HCR-DNAzyme探针负载于MnO2纳米片上。
优选地，所述MnO2纳米片的制备方法如下：将四甲基氢氧化铵和H2O2的混合溶液与可溶性锰盐混合，搅拌，固液分离，得到沉淀，即为MnO2纳米片。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：洗涤沉淀，干燥，分散于水中，超声处理。
优选地，所述搅拌的时间为10～16h。
优选地，所述固液分离的条件为1500～4500rpm离心15～25min。
优选地，所述核酸为miRNA。
本发明的第三个方面，提供一种检测核酸的纳米片的制备方法，取本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针和MnO2纳米片，进行第一次混合，加入缓冲液，进行第二次混合，得到检测核酸的纳米片。
优选地，所述MnO2纳米片的制备方法如下：将四甲基氢氧化铵和H2O2的混合溶液与可溶性锰盐混合，搅拌，固液分离，得到沉淀，即为MnO2纳米片。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：洗涤沉淀，干燥，分散于水中，超声处理。
优选地，所述搅拌的时间为10～16h。
优选地，所述固液分离的条件为1500～4500rpm离心15～25min。
优选地，所述第一次混合的时间为8～20min。
优选地，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
优选地，所述第二次混合的条件为25～35℃下搅拌10～30min。
优选地，所述核酸为miRNA。
本发明的第四个方面，提供一种检测核酸的试剂盒，包含本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针和/或本发明第二方面的纳米片。
优选地，所述核酸为miRNA。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的HCR-DNAzyme探针、本发明第二方面的纳米片、或第四方面的试剂盒在非疾病诊断用途的核酸检测中的应用。
优选地，所述核酸为miRNA。
本发明的第六个方面，提供一种非疾病诊断用途的核酸检测方法，为S1或S2，
S1：
1)根据目标核酸设计HCR-DNAzyme探针；
2)将HCR-DNAzyme探针、缓冲液、锰离子、镁离子和待测核酸混合，35～50℃下孵育1～4h，测定荧光信号强度；
S2：
1)根据目标核酸设计HCR-DNAzyme探针，并制成包含HCR-DNAzyme探针和二氧化锰纳米片的纳米片；
2)将纳米片和包含待测核酸的细胞混合，35～50℃下孵育2～6h，观察荧光强度。
优选地，所述核酸包括miRNA。
优选地，S1和S2中所述HCR-DNAzyme探针，包含探针H1、探针H2和底物链H3；
所述探针H1从5’到3’依次包括：A序列、B序列和C序列；
所述C序列与目标核酸互补；
所述B序列为任意4～6个碱基组成的序列；优选地，所述B序列为任意4～6个脱氧核苷酸组成的序列；进一步优选地，所述B序列为CACAC；
所述A序列与C序列的5’端互补；优选地，所述A序列与C序列的5’端的第1～14位碱基互补；
所述探针H2从5’到3’依次包括：D序列、E序列、F序列、G序列、H序列和I序列；
所述D序列为AAACCGAGGCTAGC(SEQ ID NO.8)；
所述E序列和所述H序列为一个一个碱基，所述E序列和所述H序列互补；优选地，所述E序列和所述H序列为一个脱氧核苷酸；
所述F序列与所述A序列和B序列连接而成的序列互补；
所述G序列与C序列互补；
所述I序列为TACAACGACGCCTGC(SEQ ID NO.9)；
所述底物链H3从5’到3’依次包括：G序列、J序列和K序列；
所述J序列为CG/rA//rU/CGGTTT(SEQ ID NO.10)，其中，rA为腺嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；
所述K序列与G序列的5’端互补；优选地，所述K序列与G序列的5’端的第1～14位碱基互补；
优选地，所述K序列的第2～13位碱基中有一个碱基错配；进一步优选地，所述K序列的第5～10位碱基中有一个碱基错配；从而降低K序列与G序列形成的双链的稳定性。
优选地，所述探针H1上修饰有第一荧光基团，所述探针H2上修饰有第二荧光基团，且所述第一荧光基团与所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光发色基团，其中一个荧光发色基团(供体)的发射光谱与另一荧光发色基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当供体分子被激发后，受体与供体相距一定合适的距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量通过偶极子的介导转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。本发明在探针H1和探针H2上分别修饰第一荧光基团和第二荧光基团，在两个探针发生杂交链反应后，两个荧光基团会因为靠近，导致荧光共振能量转移，从而实现对目标核酸的检测。
优选地，所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Cy5；或
所述第一荧光基团为Cy5，所述第二荧光基团为Cy7；或
所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Alexa488；或
所述第一荧光基团为Rhodamine，所述第二荧光基团为FITC。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一组HCR-DNAzyme探针，该HCR-DNAzyme探针可以特异性识别目标核酸，实现基于DNAzyme辅助的杂交链反应(HCR)的指数级信号放大，反应动力学提高，检测限降低，仅为3.28fM，相比传统的HCR探针检测限降低了5个数量级(传统的HCR探针的检测限为0.78nM)，同时，检测灵敏度比传统的DNAzyme探针提高了5个数量级，即本发明提供的HCR-DNAzyme探针灵敏度高、检测限低、特异性强；并且具有更优的反应动力学。
本发明提供了一种纳米片，包含HCR-DNAzyme探针和MnO2纳米片，可以借助MnO2纳米片对HCR-DNAzyme探针进行保护，提高HCR-DNAzyme探针的稳定性，同时，补充了细胞内酶链切割底物反应所依赖的金属离子(辅助因子)，实现了HCR-DNAzyme探针在活细胞中的应用，最终实现基于DNAzyme辅助的杂交链反应(HCR)的指数级信号放大的高灵敏度、高效率的细胞内核酸实时原位成像检测。
本发明提供的试剂盒包含HCR-DNAzyme探针和/或纳米片，可以通过HCR-DNAzyme探针检测核酸，通过纳米片实现细胞内核酸实时原位成像检测。
本发明提供的核酸检测方法简单快捷、灵敏度高、检测限低、特异性高、成本低廉，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是MnO2 nanosheets-HCR-DNAzyme检测miRNA的原理图。
图2是二氧化锰纳米片的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图：其中，A是二氧化锰纳米片的扫描电镜(SEM)图；B是二氧化锰纳米片的透射电镜(TEM)图。
图3是二氧化锰纳米片与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme的紫外可见吸收光谱图。
图4是二氧化锰纳米片与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme的粒度对比图。
图5是二氧化锰纳米片与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme的电位对比图。
图6是HCR-DNAzymet探针可行性验证的荧光发射光谱结果图。
图7是HCR-DNAzymet探针可行性验证的非变性凝胶电泳结果图：其中，1表示H1的泳道，2表示H2的泳道，3表示H3的泳道，4表示H1+H2的泳道，5表示H1+H2+H3的泳道，6表示H1+H2+miR-1246的泳道，7表示H1+H2+H3+miR-1246的泳道。
图8是HCR探针与HCR-DNAzymet探针的灵敏度检测结果图：其中，A是HCR-DNAzymet探针检测不同浓度miR-1246的荧光光谱图；B是使用HCR-DNAzymet探针时，miR-1246的浓度与FA/FD的相关关系图；C是HCR探针检测不同浓度miR-1246的荧光光谱图；D是使用HCR探针时，miR-1246的浓度与FA/FD的相关关系图。
图9是HCR探针与HCR-DNAzymet探针的动力学曲线图。
图10是HCR-DNAzymet探针的特异性检测结果图：其中，A是HCR-DNAzymet探针检测不同靶标的荧光光谱图；B是HCR-DNAzymet探针检测不同靶标的FA/FD的统计结果图。
图11是核酸负载率与MnO2纳米片的浓度的关系图：其中，A是核酸负载率随MnO2纳米片的浓度的变化图；B是H1的浓度与荧光强度的关系图。
图12是MnO2纳米片对核酸的保护作用结果图：其中，A是负载及未负载MnO2纳米片加入细胞裂解液后荧光强度变化图；B是负载及未负载MnO2纳米片加入脱氧核糖核酸酶后荧光强度变化图。
图13是不同浓度的谷胱甘肽下MnO2纳米片的降解效果图。
图14是MCF-7在不同浓度的二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)和MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzyme system)的细胞存活率图。
图15是MCF-7细胞与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzymesystem)共孵后细胞内锰离子的浓度图。
图16是不同处理下MCF-7细胞的共聚焦激光显微镜(CLSM)图。
图17是miR-1246上下调后MCF-7细胞的共聚焦激光显微镜(CLSM)图。
图18是MnO2纳米片-HCR-DNAzyme检测不同细胞内的共聚焦激光显微镜(CLSM)图。
图19是不同细胞内miR-1246表达水平图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本发明提供的纳米片的原理如图1所示，具体如下：该纳米片包含HCR-DNAzyme探针和MnO2纳米片，HCR-DNAzyme探针包含探针H1、探针H2和底物链H3；其中H1和H2分别修饰有荧光供体和受体，H1的3’端和H2的5’端修饰一段Toehold序列，并进一步将一段完整的DNAzyme序列劈成2段修饰在H2发夹的3’端和5’端，底物链H3包含DNAzyme的识别序列以及目标核酸的相似序列；将H1、H2和H3负载于MnO2纳米片上递送至细胞，MnO2纳米片被细胞内的谷胱甘肽降解生成Mn2+，并释放出H1、H2和H3；在目标核酸存在下，H1和H2发生HCR，H1和H2链上的荧光供体和荧光受体相互靠近产生能量共振转移，同时HCR产物的双链上形成多个DNAzyme，在特异性二价金属离子Mn2+的催化下识别H3序列并在H3的环部产生一缺口，由于H3茎部不稳定，此时H3被裂解成两段并游离到溶液，DNAzyme继续与新的发夹H3作用并产生切割将H3裂解成两端，不断地循环，H3的其中一条裂解片段上含有与目标miRNA相似的序列可作为目标引发物诱导H1和H2发生新的HCR，HCR产物上的DNAzyme又可不断与H3作用产生新的片段从而引发新HCR，如此不断地重复，能量共振转移信号呈现指数放大，实现miRNA的检测。
实施例1一组检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针
一组检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针，包含探针H1、探针H2和底物链H3；
其中，探针H1：5’-ATTTTTGGAGCAGGCACACCCTGCTCCAAAAATCCATT/iCy5d/-3’(SEQID NO.1)；
探针H2：5’-AAACCGAGGCTAGCCGTGTGCCTGCTCCAAAAA/iCy3dT/AATGGATTTTTGGAGCAGGGTACAACGACGCCTGC-3’(SEQ ID NO.2)；
底物链H3：5’-AATGGATTTTTGGAGCAGGCG/rA//rU/CGGTTTTCCAAATATCCATT-3’(SEQID NO.3)；其中，rA为腺嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；
miR-1246的序列为：5’-AAUGGAUUUUUGGAGCAGG-3’(SEQ ID NO.4)。
实施例2一种检测miR-1246的MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2nanosheets-HCR-DNAzyme)
(1)检测miR-1246的MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-HCR-DNAzyme)
制备20mL四甲基氢氧化铵和H2O2的混合溶液(四甲基氢氧化铵的浓度为0.6M，H2O2的浓度为3.0wt％，具体方法参考文献：H.Fan,Z.Zhao,G.Yan,X.Zhang,C.Yang,H.Meng,Z.Chen,H.Liu,W.Tan,A Smart DNAzyme–MnO2 Nanosystem for Efficient Gene Silencing，Angew.Chem.,Int.Ed.,2015,54,4801-4805.)，20s内快速添加到10mL的MnCl2(0.3M)中；溶液立即变成了深棕色，在剧烈搅拌下过夜；3000rpm离心20min，收集沉淀，用水和甲醇各洗涤三遍，真空干燥5h；得到二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)。取得到的二氧化锰纳米片分散在水中，60Hz超声10h以上，获得小尺寸的二氧化锰纳米片。取41μL(1.1mg/mL)小尺寸的二氧化锰纳米片与H1(10μL，10μM)，H2(10μL，10μM)和H3(25μL，10μM)混合10分钟，然后加入914μL HEPES缓冲液(10mM，pH 7.4)，室温搅拌20分钟，得到MnO2纳米片-HCR-DNAzyme。
(2)二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)和MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2nanosheets-HCR-DNAzyme)的表征
分别对二氧化锰纳米片和MnO2纳米片-HCR-DNAzyme进行粒度、电位、紫外和荧光以及电镜表征，二氧化锰纳米片的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)结果图2所示：呈现片状结构；二氧化锰纳米片的紫外可见吸收结果如图3所示：在380nm处有紫外吸收，表明二氧化锰纳米片合成成功；二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2nanosheets-DNAzyme)的紫外可见吸收结果如图3所示：紫外可见吸收光谱无明显变化，二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzyme)的动态光散射(DLS)检测粒度结果如图4所示：二氧化锰纳米片粒径由136.6±2.914nm变为151.2±5.154nm(MnO2纳米片-HCR-DNAzyme)；二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzyme)的电位检测结果如图5所示：二氧化锰纳米片电位由-20.6±1.34变为-35.8±0.4(MnO2纳米片-HCR-DNAzyme)，表明二氧化锰纳米片能够有效吸附核酸探针并且核酸链(H1～H3)的负载不会改变MnO2纳米片的性质。
实施例3检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针的设计合成可行性验证及测定条件优化
(1)电泳实验及荧光实验验证可行性
1)荧光实验
对HCR-DNAzyme探针中探针H1、探针H2、底物链H3进行荧光实验：分别进行如下处理：取H1+H2，miR-1246+H1+H2，H1+H2+H3，miR-1246+H1+H2+H3(H1的终浓度为200nM；H2的终浓度为200nM；H3的终浓度为500nM；miR-1246的终浓度为50nM)，分别加入Mn2+(终浓度为50mM)，Mg2+(终浓度为30mM)，Tris缓冲液(终浓度为10mM)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，然后用荧光分光光度计以540nm为激发波长测定562nm(FD)及666nm(FA)处的荧光强度值，激发/发射狭缝宽度为4nm，结果如图6所示：当靶标miR-1246不存在时，普通HCR(H1+H2)及HCR-DNAzyme(H1+H2+H3)指数放大反应只有非常微弱的荧光，表明反应几乎不发生；当加入靶标miR-1246时，普通HCR(miR-1246+H1+H2)反应产生了荧光，而HCR-DNAzyme(miR-1246+H1+H2+H3)反应荧光显著增强，表明HCR反应结合DNAzyme切割反应的指数放大反应(HCR-DNAzyme)可行且扩增效率比普通HCR高。
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
对HCR-DNAzyme探针中探针H1、探针H2、底物链H3进行荧光实验：分别进行如下处理：取H1，H2，H3，H1+H2，H1+H2+H3，miR-1246+H1+H2，miR-1246+H1+H2+H3(H1的终浓度为100nM；H2的终浓度为100nM；H3的终浓度为250nM；miR-1246的终浓度为50nM)，分别加入Mn2+(终浓度为50mM)，Mg2+(终浓度为30mM)，Tris缓冲液(终浓度为10mM)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，进行12％的聚丙烯凝胶电泳实验，结果如图7所示：当加入靶标miR-1246时，普通HCR(miR-1246+H1+H2)的泳道产生了亮的条带，并且有弥散条带产生，表明发生了链杂交反应；而HCR-DNAzyme(miR-1246+H1+H2+H3)的泳道颜色更深，弥散程度更好，且对比H3的泳道能够看到H3条带消失，表明基于HCR和DNAzyme切割反应的级联指数扩增能够发生。
(2)检测miR-1246的检测性能
1)检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针的灵敏度和检测限
取H1(终浓度为100nM)，H2(终浓度为100nM)，加入Mn2+(终浓度为50mM)、Mg2+(终浓度为30mM)和Tris缓冲液(终浓度为10mM)，分别加入miR-1246，使miR-1246的终浓度分别为300nM、200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、0(Blank)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，然后用荧光分光光度计以540nm为激发波长测定562nm(FD)及666nm(FA)处的荧光强度值，激发/发射狭缝宽度为4nm。
取H1(终浓度为100nM),H2(终浓度为100nM)、H3(终浓度为250nM)，加入Mn2+(终浓度为50mM)、Mg2+(终浓度为30mM)和Tris缓冲液(终浓度为10mM)，分别加入miR-1246，使miR-1246的终浓度分别为100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、0(Blank)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，然后用荧光分光光度计以540nm为激发波长测定562nm(FD)及666nm(FA)处的荧光强度值，激发/发射狭缝宽度为4nm。
结果如图8所示：图8中A，随着miR-1246浓度的增加，荧光强度逐渐增加；并且，图8中B，在100fM～10 0nM的浓度范围内，FA/FD与miR-1246的浓度呈现出良好的线性关系，线性方程为Y＝0.081X+1.21(R2＝0.9928)，检测限为3.28fM；图8中C、D为普通的HCR结果：随着miR-1246浓度的增加，荧光强度逐渐增加；在1nM～300nM浓度范围内,FA/FD与miR-1246浓度的线性方程为Y＝0.098X+0.089(R2＝0.9960)，检测限为0.78nM；本实施例提供的HCR-DNAzyme探针较HCR探针的检测灵敏度提高了5个数量级，具有更优的检测效果。
2)检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针的反应动力学考察
取H1+H2(HCR blank)、H1+H2+H3+Mn2+(HCR-DNAzyme-Mn2+system blank)、miR-1246+H1+H2(HCR)，miR-1246+H1+H2+H3+Mn2+(HCR-DNAzyme-Mn2+system)(H1的终浓度为100nM；H2的终浓度为100nM；H3的终浓度为250nM；miR-1246的终浓度为100nM；Mn2+终浓度为50mM)，分别加入Mg2+(终浓度为30mM)，Tris缓冲液(终浓度为10mM)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，然后用荧光分光光度计以540nm为激发波长扫描562nm(FD)及666nm(FA)处的荧光强度值(时间设定为2小时，每隔10min一次)，激发/发射狭缝宽度为4nm。
结果如图9所示：在靶标miR-1246存在时，HCR-DNAzyme探针(miR-1246+H1+H2+H3)随着时间的延长荧光显著增强，比普通HCR探针(miR-1246+H1+H2)的荧光强度强约4倍，表明HCR-DNAzyme探针比普通HCR探针具有更高的反应动力学；；当靶标不存在时，荧光值较低，表明HCR-DNAzyme探针的背景信号低。
3)检测miR-1246的HCR-DNAzyme探针的特异性
为了研究该HCR-DNAzyme探针是否对靶标特异性响应，设计合成了一系列与靶标相差1个或2个碱基差异的Random序列(序列见表1)。取H1(终浓度为100nM)、H2(终浓度为100nM)、H3(终浓度为250nM)，加入Mn2+(终浓度为50mM)，Mg2+(终浓度为30mM)，分别加入靶序列(SEQ ID NO.4、5、6、7，终浓度为10nM，空白组(Blank)不加入)，Tris缓冲液(终浓度为10mM)，反应体系100μL，37℃恒温条件下反应2h，然后用荧光分光光度计以540nm为激发波长测定562nm(FD)及666nm(FA)处的荧光强度值，激发/发射狭缝宽度为4nm。结果如图10所示：只有在miR-1246存在的条件下才能产生较强的荧光，空白和错配链产生的荧光都非常弱，表明HCR-DNAzyme探针具有较高的特异性。
表1.检测miR-1246的HCR-DNAzyme的特异性所用DNA/RNA序列
序列名称
序列(5'-3')
mis-1
AATGGATTTTTGGACCAGG(SEQ ID NO.5)
mis-2
AATGGATTATTGGACCAGG(SEQ ID NO.6)
mis-3
AATCGATTTTTGGACCAGG(SEQ ID NO.7)
注：其中DNA中的“T”等同于RNA中的“U”。
实施例4 MnO2纳米片的作用验证
(1)MnO2纳米片负载核酸探针
将标记荧光基团cy5的H1，稀释成浓度梯度(10、25、40、55、70、85、100nM)后分别测定其荧光强度，得到荧光强度随浓度变化的标准曲线。将终浓度为100nM的H1负载于终浓度为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130μg/mL的二氧化锰纳米片上(方法同实施例2)，12000rpm离心后获得不同浓度的二氧化锰纳米片的荧光值，通过与H1标准曲线拟合方程的换算得出不同浓度的MnO2纳米片的负载率，荧光强度随H1浓度变化曲线图及H1负载率随MnO2纳米片浓度变化曲线图如图11所示：MnO2纳米片中H1负载率最高能达到80％以上，表明MnO2纳米片对核酸探针具有良好的吸附作用。
(2)MnO2纳米片的保护作用
运用上述MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-HCR-DNAzyme)合成方法，将标记有FAM荧光基团的DNA链((FAM)-GAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT/rA//rG/TATAGTGGCAAAATCGAAGCACTTC(SEQ ID NO.11)-(BHQ1)，其中，rA为腺嘌呤核苷酸，rG为鸟嘌呤核苷酸)负载于二氧化锰纳米片上，将负载与未负载的标记有FAM荧光基团的DNA链分别在加入6μL细胞裂解液和氧核糖核酸酶的条件下，用荧光PCR仪检测FAM荧光的变化，对比是否存在二氧化锰纳米片的情况下荧光的强度变化。
结果如图12所示：在负载核酸探针的MnO2纳米片中加入细胞裂解液(FAM+MnO2nanosheets+Cell Lysates)或氧核糖核酸酶(FAM+MnO2 nanosheets+DNase I)，其荧光值均无显著变化，而无MnO2纳米片的条件下，标记荧光基团的探针很快被细胞裂解液液(FAM+Cell Lysates)和氧核糖核酸酶(FAM+DNase I)裂解，导致荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1分离从而产生较强的荧光。
(3)MnO2纳米片的降解
将MnO2纳米片稀释成126.1μg/mL，分别加入不同浓度(0、10、50、100、200、300、400、600、1000μM)的谷胱甘肽(GSH)，在37℃的条件下孵育1h，12000rmp离心，取上清，通过ICP-MS在上清液中测定Mn2+的浓度，从而通过计算求出二氧化锰纳米片中Mn2+的释放率。结果如图13所示：随着谷胱甘肽(GSH)浓度增加，Mn2+的释放率也逐渐升高：当GSH浓度达到1mM时，Mn2+的释放率达到将近80％，癌细胞内GSH浓度达6mM，表明MnO2纳米片进入癌细胞后，细胞内GSH能够有效裂解MnO2纳米片转化为Mn2+。
(4)二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)和MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2nanosheets-DNAzyme system)的细胞毒性
将MCF-7细胞铺于96孔板中，每孔大约5000个细胞，孵育过夜后分别加入二氧化锰纳米片(MnO2 nanosheets)和MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzymesystem)(用DMEM释成终浓度分别为0、5、10、20、30、45、60、80μg/mL)，37℃孵育24小时后，弃去培养液，加入100μL 10％的MTT溶液，37℃孵育24小时后，弃去MTT，加入100μL的DMSO摇晃10min，测得在490nm处吸收。结果如图14所示：二氧化锰纳米片在80μg/mL以内时，细胞存活率都在85％以上，表明二氧化锰纳米片细胞毒性小。
(5)细胞对二氧化锰纳米片的摄取
取MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzyme system)(用DMEM稀释成终浓度为45μg/mL)与MCF-7细胞在37℃共同孵育4h(对照组加入等量溶剂)，弃上清，用PBS将细胞洗3遍，消化后计数，加入浓硝酸，37℃放置过夜，细胞裂解后离心获取上清，通过ICP-MS在上清液中测定Mn2+的浓度，结果如图15所示：MCF-7细胞可以摄取MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(MnO2 nanosheets-DNAzyme system)中的Mn2+。
(6)活细胞内能量共振转移的发生
将MCF-7细胞铺于共聚焦皿中，每孔大约5000个细胞，孵育过夜后分别进行如下处理：H1+H2+H3、MnO2 nanosheets-H2+H3(H2+H3+MnO2)、MnO2 nanosheets-H1+H2(H1+H2+MnO2)、MnO2 nanosheets-H1+H2+H3(H1+H2+H3+MnO2)(H1(终浓度为100nM)、H2(终浓度为100nM)、H3(终浓度为250nM)、MnO2纳米片(终浓度为45μg/mL)，溶剂为DMEM，MnO2nanosheets-H2+H3、MnO2 nanosheets-H1+H2、MnO2 nanosheets-H1+H2+H3制备方法同实施例2)，37℃恒温孵育4h，通过倒置共聚焦激光显微镜观察细胞内能量共振转移的荧光强度，结果如图16所示：只有当MnO2 nanosheets-H1+H2+H3体系完善时，细胞内才能产生较强的荧光共振能量转移(FRET)的荧光，表明MnO2 nanosheets-HCR-DNAzyme具有活细胞成像的能力，并且能量共振转移的效率较高。
实施例5活细胞内microRNA原位成像
(1)活细胞microRNA原位成像的准确性
将MCF-7细胞铺于共聚焦皿中，每孔大约10000个细胞，孵育过夜后分别进行如下处理：miRNA-1246反义序列(用DMEM稀释为终浓度为500nM)孵育2小时(Anti-miR-1246pre-treated MCF-7)，溶剂孵育2小时(untreated MCF-7)，miRNA-1246序列(用DMEM稀释为终浓度为500nM)孵育2小时(miR-1246pre-treated MCF-7)，分别加入MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(H1(终浓度为100nM)、H2(终浓度为100nM)、H3(终浓度为250nM)、MnO2纳米片(终浓度为45μg/mL)，溶剂为DMEM)，37℃恒温孵育4h，通过倒置共聚焦激光显微镜观察细胞内能量共振转移的荧光强度，结果如图17所示：用miR-1246预处理后的MCF-7细胞与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme探针反应后荧光显著增强，用反义miR-1246预处理后的MCF-7细胞与MnO2纳米片-HCR-DNAzyme探针反应后荧光强度较不处理弱，这是由于反义miR-1246与细胞内的miR-1246结合导致细胞内miR-1246下调而降低HCR扩增反应的发生，表明MnO2纳米片-HCR-DNAzyme探针可以成功检测细胞内miR-1246表达水平的变化。
(2)不同类型细胞内microRNA原位成像
分别选取癌细胞MCF-7、Hela和正常细胞MCF-10A和L02细胞，将细胞铺于共聚焦皿中，每孔大约10000个细胞，孵育过夜后分别进行如下处理：分别加入MnO2纳米片-HCR-DNAzyme(H1(终浓度为100nM)、H2(终浓度为100nM)、H3(终浓度为250nM)、MnO2纳米片(终浓度为45μg/mL)，溶剂为DMEM)，37℃恒温孵育4h，通过倒置共聚焦显微镜观察细胞内能量共振转移的荧光强度，结果如图18所示：人乳腺癌细胞MCF-7和人宫颈癌细胞Hela均与MnO2nanosheets-HCR-DNAzyme产生了较强的荧光，而人正常胚胎干细胞L02和人正常乳腺上皮细胞FRET通道荧光很弱，说明癌症发生时，细胞内miR-1246显著的上调，该结果与RT-qPCR结果(图19)一致，进一步验证了MnO2 nanosheets-HCR-DNAzyme可以用作microRNA相关疾病标志物的诊断。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一组检测核酸的HCR-DNAzyme探针及其应用
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttttggag caggcacacc ctgctccaaa aatccatt 38
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatggatttt tggagcaggc gaucggtttt ccaaatatcc att 43
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 19
<212> DNA
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<400> 6
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<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 9
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<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaagtgcttc gattttgggg tgtagtatag tggcaaaatc gaagcacttc 50
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