具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pCAMBIA3301记载于如下文献中：Regulatory changes in TaSNAC8-6A areassociated with drought tolerance in wheat seedlings.Plant BiotechnolJ.202018(4):1078-1092.

小麦品种中国春记载于如下文献中：Regulatory changes in TaSNAC8-6A areassociated with drought tolerance in wheat seedlings.Plant BiotechnolJ.202018(4):1078-1092.在下文中，小麦品种中国春简称中国春。

小麦品种Fielder记载于如下文献中：Regulatory changes in TaSNAC8-6A areassociated with drought tolerance in wheat seedlings.Plant BiotechnolJ.202018(4):1078-1092.

下述实施例中多态性位点的命名方法为标记类型+序号；其中，标记类型有SNP和InDel两种，SNP代表单核苷酸多态性，InDel代表插入或缺失；序号是以中国春参考基因组DNA中TaPYL1基因的起始密码子(ATG)中的A记为“+1”；如SNP181代表在起始密码子(ATG)中的A的下游第181位碱基处存在单核苷酸多态性；InDel-442代表在起始密码子(ATG)中的A的上游第442位碱基下游存在1个或多个碱基的插入或缺失。

下述实施例中引物或序列的位置均以中国春参考基因组DNA中TaPYL1基因的起始密码子(ATG)中的A记为“+1”。

中国春参考基因组DNA中TaPYL1基因的基因组序列如SEQ ID NO:11所示，SEQ IDNO:11自5’末端起第601-1832位为TaPYL1基因的全长cDNA序列，第719-1360位编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的TaPYL1蛋白，第719位为起始密码子ATG的中的碱基A。

实施例1、TaPYL1基因的克隆

1、取中国春的种子，25℃催芽3天，之后将出芽的种子转移至营养土，25℃培养两周，得到中国春幼苗。

2、提取中国春幼苗的总RNA，之后反转录，获得中国春的cDNA。

3、以中国春的cDNA为模板，采用5’-ATGGAGCAGCAGCCTGTG-3’(SEQ ID NO:3)和5’-TTATTCTGCCGGCGGCGC-3’(SEQ ID NO:4)组成的引物对进行PCR扩增，得到约642bp的PCR扩增产物。

4、将PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

将SEQ ID NO:2所示的基因命名为TaPYL1基因。TaPYL1基因编码TaPYL1蛋白，TaPYL1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2、转TaPYL1基因小麦的获得和抗旱性鉴定

10×LS Major的溶质及其浓度为CaCl₂·2H₂O44g/L、KH₂PO₄1.7g/L、KNO₃19g/L、MgSO₄·7H₂O37g/L和NH₄NO₃16.5g/L，溶剂为水。

100×LS Minor的溶质及其浓度为CoC_l2·6H₂O2.5mg/L、CuSO₄·5H₂O2.5mg/L、H₃BO₃620mg/L、KI83mg/L、MnSO₄·5H₂O2230mg/L和ZnSO₄·7H₂O1060mg/L，溶剂为水。

100×Fe-EDTA的溶质及其浓度为FeSO₄·7H₂O2.78g/L和Na₂EDTA3.73g/L，溶剂为水。

100×Vitamin的溶质及其浓度为Pyridoxine-HCl 0.05g/L、Nicotinic acid0.05g/L、Thiamine-HCl 0.1g/L和myo-Inositol 10g/L，溶剂为水。

选择培养基：将100mL10×LS Major、10mL100×LS Minor、10mL100×Fe-EDTA、10mL100×Vitamin、5mL2,4-D、40gMaitose、0.5g Glutamine、0.75g MgCl₂·6H₂O、1.95gMES和5gAgarose溶于适量水，然后用水定容至1L；121℃灭菌15min；之后加入10g/L Ascorbicacid、50μL浓度为100mM的AgNO₃溶液、1mL浓度为150g/L的Timentin。

分化培养基：将100mL10×LS Major、10mL100×LS Minor、10mL100×Fe-EDTA、10mL100×Vitamin、50mL浓度为100mg/L的Zeatin溶液、100μL浓度为100mM的CuSO₄·5H₂O溶液、20g Sucrose、0.5g MES和3g Gelrite溶于适量水，然后用水定容至1L；121℃灭菌15min；之后加入250μL浓度为20g/L的PPT和1mL浓度为250g/L的Carbenicillin。

生根培养基：将100mL10×LS Major、10mL100×LS Minor、10mL100×Fe-EDTA、10mL100×Vitamin、2mL浓度为100mg/L的IBA溶液、15g Sucrose、0.5g MES和3g Gelrite溶于适量水，pH调节值5.8，然后用水定容至1L；121℃灭菌15min；之后加入250μL浓度为20g/L的PPT和1mL浓度为250g/L的Carbenicillin。

一、重组载体pCAMBIA3301-GZ的构建

将载体pCAMBIA3301的限制性内切酶HindIII和EcoRI之间的DNA小片段替换为SEQID NO:2自5’末端起第1至639位所示的DNA分子，得到重组载体pCAMBIA3301-GZ。

重组载体pCAMBIA3301-GZ表达SEQ ID NO:1所示的TaPYL1蛋白。

二、重组根癌农杆菌的获得

将重组载体pCAMBIA3301-GZ转化至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301-GZ。

将载体pCAMBIA3301转化至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301。

三、转TaPYL1基因小麦的获得

1、采用农杆菌介导的基因转化法将EHA105/pCAMBIA3301-GZ导入小麦品种Fielder，得到T₀代拟转TaPYL1基因小麦。

具体步骤如下：

(1)将EHA105/pCAMBIA3301-GZ接种于含有25mg/L壮观霉素的YEB液体培养基，28℃振荡培养至OD_600nm值为0.5，得到重组农杆菌菌液。

(2)将小麦品种Fielder的幼胚置于装满保存液(将10mL 10×LSMajor、1mL100×LS Minor、1mL 100×Fe-EDTA、1mL 100×Vitamin、10mL Glucose和0.5g MES溶于适量水，然后用水定容至1L获得)的离心管(规格为2mL)，46℃热处理3min，4℃、2000rpm离心10min，得到处理后的幼胚。

(3)完成步骤(2)后，向所述处理后的幼胚中加入重组农杆菌菌液，22℃黑暗培养3天，然后转移至选择培养基上，28℃黑暗培养7-10天；之后用不同浓度草胺膦筛选，最后转移至分化培养基，分化后转移到生根培养基，一定大小后移入营养土中，得到T₀代拟转TaPYL1基因小麦。

2、取T₀代拟转TaPYL1基因小麦，筛选阳性苗，获得T₀代转TaPYL1基因小麦。

3、取T₀代转TaPYL1基因小麦，自交，筛选阳性苗，获得T₁代转TaPYL1基因小麦。

4、取T₁代转TaPYL1基因小麦，自交，筛选阳性苗，获得T₂代转TaPYL1基因小麦。

5、取T₂代转TaPYL1基因小麦，自交，筛选阳性苗，获得T₃代转TaPYL1基因小麦。

筛选阳性苗的方法为：提取待测小麦的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-TCGATGCTCACCCTGTTGTTTG-3’(SEQ ID NO:9)和5’-TGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’(SEQ IDNO:10)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行Sanger测序；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约871bp的DNA片段，且测序结果包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，则该PCR扩增产物对应的小麦幼苗为阳性苗。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA3301-GZ替换为EHA105/pCAMBIA3301，其它步骤均相同，得到T₃代转空载体小麦的植株，简称转空载体小麦。

四、实时荧光定量检测T₃代转TaPYL1基因小麦中TaPYL1基因的表达量

1、分别将各个T₃代转TaPYL1基因小麦生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。将转空载体小麦生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。取小麦品种Fielder，16℃光暗交替培养10天，得到待测小麦幼苗；将该待测小麦幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、采用Trizo1(Biotopped)提取待测样本的总RNA，然后反转录出第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释100倍作为模板，实时定量PCR检测TaPYL1基因的相对表达量(TaActin1基因为内参基因)。

检测TaPYL1基因的引物为5’-CCGTCACCACCGTCTCCGAACT-3’(SEQ ID NO:5)和5’-CCTCGGCCACGGACTTGAGCT-3’(SEQ ID NO:6)。

检测TaActin1基因的引物为5’-AAATCTGGCATCACACTTTCTAC-3’(SEQ ID NO:7)和5’-GTCTCAAACATAATCTGGGTCATC-3’(SEQ ID NO:8)。

部分检测结果见图1(WT为小麦品种Fielder，OE1-OE12均为T₃代转TaPYL1基因小麦)。结果表明，小麦品种Fielder和转空载体小麦中TaPYL1基因的相对表达量无显著差异；与小麦品种Fielder相比，各个T₃代转TaPYL1基因小麦中TaPYL1基因的相对表达量均显著增加，其中3个T₃代转TaPYL1基因小麦株系中TaPYL1基因的相对表达量较高，依次命名为OE4、OE5和OE6，进行后续实验。

五、T₃代转TaPYL1基因小麦的抗旱性鉴定

(一)抗旱性鉴定一

待测小麦种子为OE4的T₃代种子、OE5的T₃代种子、OE6的T₃代种子、小麦品种Fielder种子或转空载体小麦种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取待测小麦种子，室温下萌发3天，之后转移至水培液，16℃、光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)15天，得到待测小麦幼苗。

水培液的溶质及其浓度为0.75mM K₂SO₄、0.1mM KCl、0.25mM KH₂PO₄、0.65mMMgSO₄、0.1mM EDTA-Fe、2mM Ca(NO₃)₂、1.0μM MnSO₄、1.0μM ZnSO₄、0.1μM CuSO₄和0.005μM(NH₄)₆Mo₇O₂，溶剂为水。

2、将生长状态基本一致的20株待测小麦幼苗转移至水培液(对照)或含30％PEG的水培液，16℃、光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)10天，观察表型。

结果表明，转空载体小麦和小麦品种Fielder的叶片明显干枯，T₃代转TaPYL1基因小麦(OE4、OE5和OE6)的叶片严重萎蔫。

3、完成步骤2后，将20株待测小麦幼苗转移至水培液，16℃、光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)7天，观察表型。

结果见图2(VC为转空载体小麦，WT为小麦品种Fielder)。结果表明，与小麦品种Fielder相比，T₃代转TaPYL1基因小麦(OE4、OE5和OE6)对PEG的耐受能力显著提高；转空载体小麦和小麦品种Fielder对PEG的耐受能力无显著差异。

(二)抗旱性鉴定二

待测小麦种子为OE4的T₃代种子、OE5的T₃代种子、OE6的T₃代种子、小麦品种Fielder种子或转空载体小麦种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、将48粒待测小麦种子播种于装有0.6kg营养土的盒子中(35.0cm×20.0cm×15.0cm)，正常条件培养21天，得到待测小麦幼苗。

部分待测小麦幼苗的表型见图3(干旱前)(WT为小麦品种Fielder)。

2、完成步骤1后，干旱处理(停止浇水)30天，观察表型。

结果表明，转空载体小麦和小麦品种Fielder的叶片明显干枯，T₃代转TaPYL1基因小麦(OE4、OE5和OE6)的叶片严重萎蔫。

3、完成步骤2后，复水，3天后观察表型并统计存活率。

将表现为能正常生长和收种的植株定义为存活植株。存活率为存活植株数目占总植株数的百分比。

复水后部分待测小麦幼苗的表型见图3(干旱后)(WT为小麦品种Fielder)。

存活率统计结果见图4(WT为小麦品种Fielder)。结果表明，与小麦品种Fielder相比，T₃代转TaPYL1基因小麦(OE4、OE5和OE6)的存活率显著提高，达到80％-85％；转空载体小麦和小麦品种Fielder的存活率无显著差异。

由此可见，TaPYL1基因为小麦抗旱基因。

实施例3、与小麦抗旱性相关的单体型及其分子标记与应用

一、分子标记的开发

1、本发明的发明人经过大量实验，发现在小麦基因组DNA中TaPYL1基因的起始密码子ATG上游的多态性位点存在2种与抗旱相关的单体型，分别命名为单体型甲和单体型乙，如图5所示。

2、制备用于鉴定小麦抗旱性相关的分子标记的特异引物对。特异引物对由引物F：-CGAAGAATTGGTGAATCATGTACTAC-3’(SEQ ID NO:12)和引物R：5’-TAAAAAATAGAAGAGCATCTCCTAAAAG-3’(SEQ ID NO:13)组成。

二、多态性检测

1、以抗旱小麦品种Pubing202为父本，旱敏感型小麦品种GLUYAS EARLY为母本进行杂交，再自交2代，获得分离群体Pubing202×GLUYAS EARLY。以抗旱小麦品种Pubing202为父本，旱敏感型小麦品种Wanmai33为母本进行杂交，再自交2代，获得分离群体Pubing202×Wanmai33。

2、基因型鉴定

(1)提取小麦(Pubing202、GLUYAS EARLY、Wanmai33、群体Pubing202×GLUYASEARLY或群体Pubing202×Wanmai33)的基因组DNA，得到小麦的基因组DNA。

(2)分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用步骤一中引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5min；16℃永久。

(3)取部分步骤(2)得到的PCR扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后核酸染色，凝胶成像系统下拍照。

部分小麦的电泳结果见图6。结果表明，小麦PCR扩增产物的带型为三种：带型A(显示一条带，为189bp)、带型B(显示一条带，为209bp)和带型C(显示两条带，分别为189bp和209bp)。

(4)取部分步骤(2)得到的PCR扩增产物，测序。

测序结果显示，小麦PCR扩增产物的核苷酸序列有三种：序列甲(SEQ ID NO:14所示，约189bp)、序列乙(SEQ ID NO:15所示，约209bp)和序列丙(两条序列，分别如SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15所示)。

SEQ ID NO:14：

cgaagaattggtgaatcatgtactactatgttttaagatggcgtttagtaaaataaaaaagtagtgaagttatttcggtggccagaaatgaaatgaatttgataaaataaattactccactaaatttCCTaaatttagtggagtaaaaatagtccattaatcttttaggagatgctcttctatttttta

SEQ ID NO:15：

Cgaagaattggtgaatcatgtactactatgttttaagatggcgtttagtaaaataaaaaagtagtgaagttatttcggtggccagaaatgaaatgaatttgataaaataaattactccactaaatttaggagatcagttatgtacaatcaaaatttagtggagtaaaaatagtccattaatcttttaggagatgctcttctatttttta

如果待测小麦的PCR扩增产物的带型为带型A或核苷酸序列为序列甲，则待测小麦为单体型甲纯合的小麦；如果待测小麦的PCR扩增产物的带型为带型B或核苷酸序列为序列乙，则待测小麦为单体型乙纯合的小麦；如果待测小麦的PCR扩增产物的带型为带型C或核苷酸序列为序列丙，则待测小麦为单体型甲和单体型乙杂合的小麦。

基因型鉴定结果见表1和表2。

表1.亲本的基因型及干旱处理后的存活率统计结果

表2.抗旱与旱敏感的杂交分离群体的基因型及干旱处理后的存活率统计结果

注：小写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-way ANOVA)在P<0.05的显著性，含有相同小写字母表示差异不显著，不含有相同小写字母表示差异显著；大写字母为群体内不同基因型植株经单因素方差分析(one-way ANOVA)在P<0.01的显著性，含有相同大写字母表示差异不显著，不含有相同大写字母表示差异极显著。表2中，各群体基因型分离比均符合孟德尔遗传定律。

3、抗旱性表型鉴定

实验重复三次，取均值进行统计分析。具体步骤如下：

从分离群体(Pubing202×GLUYAS EARLY或Pubing202×Wanmai33)中随机取单体型甲纯合的小麦种子90粒，单体型乙纯合的小麦种子90粒，催芽后移栽到栽培盆(长×宽×深为0.70×0.50×0.18米，盛有5千克蛭石和5千克草炭土混合的栽培基质)中，每盆种植180株，分别在温室中，于光周期为16h光照和8h黑暗、温度为白天14℃/夜晚12℃、空气湿度60％的条件下培养21天，将植株进行干旱处理(即不浇水)。待土壤相对含水量(即采用北京盟创伟业科技有限公司生产的土壤水分仪SU-LA(W)测得的土壤中水分的体积百分含量)达到0％后一周，进行复水。复水3天后统计各亲本及群体中各基因型植株的存活率(将复水3天后地上部未能转绿的植株，定义为死亡植株；将复水3天后地上部能转绿的植株定义为存活植株；存活率为存活植株占总植株数的百分比)。

统计结果见表1和表2所示。结果表明，单体型乙纯合的小麦抗旱性＞单体型甲纯合的小麦抗旱性，所述＞为在统计学上的＞。因此，在小麦育种中，应选择抗旱性较高的单体型乙纯合的小麦进行育种。

实施例4、与小麦抗旱相关的单体型的发现

本实施例中的120份小麦品种的名称详见表3中第2列，120份小麦品种均记载于如下文献中：Regulatory changes in TaSNAC8-6A are associated with droughttolerance in wheat seedlings.Plant Biotechnol J.202018(4):1078-1092.

表3

1、抗旱性表型鉴定

将120份小麦品种组成的自然变异群体种植在栽培池中，用营养土和蛭石作栽培基质，分装于两池中。每池均分成120个小区，每个小区可种植12棵苗。待三片真叶苗龄时停止浇水，进行干旱处理，一直持续到土壤相对含水量(即采用北京盟创伟业科技有限公司生产的土壤水分仪SU-LA(W)测得的土壤中水分的体积百分含量)降到0后7天进行复水，复水3天后统计存活率(将复水3天后地上部未能转绿的植株，定义为死亡植株；将复水3天后地上部能转绿的植株定义为存活植株；存活率为存活植株占总植株数的百分比)。

统计分析中用到的干旱表型数据，均为独立重复试验的均值。

存活率统计结果见表3。

根据表3中存活率结果，将小麦品种的抗旱性分成三种类型：存活率≥40％的小麦品种为抗旱型，存活率﹤10％的小麦品种为旱敏感型，10％≤存活率﹤40％的小麦品种为中间型。

分型结果见表3。

2、多态性位点鉴定

(1)分别对120份小麦品种中TaPYL1基因的编码区、5’非翻译区和3’端非翻译区约2.0kb基因组片段进行测序，测序引物为F：5’-cctctctttagccatcccttggtat-3’(SEQ IDNO:16)和R：5’-cagcacctcaggaatcacacctat-3’(SEQ ID NO:17)。测序结果用MEGA5.0(http://www.megasoftware.net/)比对。根据比对结果分析核苷酸多态性，得到7个多态性位点，其中有5个SNP和2个InDels(图7所示)，最小等位基因频率(MAF)≥0.05。

3、多态性位点与抗旱性表型的关联分析

按照实施例3的方法，将120份小麦品种分为单体型甲纯合、单体型乙纯合、单体型甲和单体型乙杂合。结果见表3。

进一步对两种单体型小麦材料耐旱表型进行统计分析，结果如图8所示。结果表明，单体型乙纯合的小麦存活率显著高于单体型甲纯合的小麦。

4、单体型乙纯合小麦材料中TaPYL1基因的表达水平显著高于单体型甲纯合小麦材料

为了确定基因表达对抗旱性的贡献差异，分析了46份小麦品种(见表4)在正常生长及干旱胁迫下的TaPYL1基因的表达水平。结果如图9所示，22份单体型乙纯合的小麦材料中TaPYL1基因表达量显著高于24份单体型甲纯合的小麦材料。

表4

分析46份小麦品种中TaPYL1基因的相对表达水平的步骤如下：

用1‰(v/v)Topsin-M(Rotam Crop Sciences Ltd.)灭菌处理小麦种子10min，然后用去离子水漂洗3次，最后放在铺有滤纸的培养皿上，22℃下催芽3天，将出芽的种子转移到营养土。苗龄3叶时进行停水处理，在相对叶片含水量(RLWC)为90％和58％时，分别取叶片，从不少于三棵苗中，用TRIZOL(Biotopped)法提取总RNA，紧接着用DNAseⅠ(Takara)消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product，USA)测定浓度，统一取5μg进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。取1μg总RNA，用重组M-MLV反转录酶(Promega)，以1μgOligo(dT)23为引物，进行cDNAs的合成。采用荧光实时定量PCR，分析46份小麦品种中TaPYL1基因的相对表达水平。

用特异引物F2：5’-CCGTCACCACCGTCTCCGAACT-3’(SEQ ID NO:18)和R2：5’-CCTCGGCCACGGACTTGAGCT-3’(SEQ ID NO:19)对基因TaPYL1的进行定量分析。以基因TaActin1为内参，引物为FC2：5’-AAATCTGGCATCACACTTTCTAC-3’(SEQ ID NO:20)和RC2：5’-GTCTCAAACATAATCTGGGTCATC-3’(SEQ ID NO:21)。

实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems Step One Real-Time PCR System(ABI，USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达水平。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.TaActin1)_{Time x}－(C_T.Target－C_T.TaActin1)_{Time 0}

Time x表示任意时间点，Time ₀表示经TaActin1校正后1倍量的目标基因表达。

用SPSS12.0软件对所得46份小麦品种的的TaPYL1基因的相对表达水平进行差异显著性分析。

结果如图9所示。结果表明，在干旱胁迫条件下，单体型乙纯合小麦材料中TaPYL1基因的表达水平显著高于单体型甲纯合小麦材料。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>西北农林科技大学

<120>一种辅助鉴定待测小麦抗旱性的方法及其专用的分子标记

<160>21

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>213

<212>PRT

<213>Triticum aestivum L.

<400>1

Met Glu Gln Gln Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Glu Val

1 5 10 15

Pro Ala Gly Leu Gly Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Ala Gln Leu Leu Pro

20 25 30

Thr Val Glu Ala Tyr His Arg Tyr Ala Val Gly Pro Gly Gln Cys Ser

35 40 45

Ser Leu Val Ala Gln Arg Ile Glu Ala Pro Pro Ala Ala Val Trp Ala

50 55 60

Ile Val Arg Arg Phe Asp Cys Pro Gln Val Tyr Lys His Phe Ile Arg

65 70 75 80

Ser Cys Ala Leu Arg Pro Asp Pro Glu Ala Gly Asp Glu Leu Arg Pro

85 90 95

Gly Arg Leu Arg Glu Val Ser Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr

100 105 110

Ser Thr Glu Arg Leu Asp Leu Leu Asp Asp Ala Arg Arg Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Thr Ile Thr Gly Gly Glu His Arg Leu Arg Asn Tyr Arg Ser Val

130 135 140

Thr Thr Val Ser Glu Leu Ser Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ile Cys Thr

145 150 155 160

Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Ser Glu

165 170 175

Glu Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr Val Val Arg Leu Asn Leu Gln

180 185 190

Lys Leu Lys Ser Val Ala Glu Ala Asn Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr

195 200 205

Ala Pro Pro Ala Glu

　　210

<210>2

<211>642

<212>DNA

<213>Triticum aestivum L.

<400>2

atggagcagc agcctgtggc ggcggcagcg gcagcggagc cggaggtacc ggcggggctt 60

gggctgacgg ccgcggagta cgcgcagctg ctgcccacgg tggaggcgta ccaccggtac 120

gccgtggggc caggccaatg ctcctccctc gtcgcgcagc gtatcgaggc gccgccagca 180

gccgtctggg ccatcgtccg ccgcttcgac tgcccccagg tgtacaaaca cttcatccgc 240

agctgcgcgc tccgcccgga ccccgaggcc ggcgacgagc tccgcccggg ccgcctccgc 300

gaggtcagcg tcatctccgg cctccccgcc agcaccagca ccgagcgcct cgacctcctc 360

gacgacgcgc gcagggcctt cggcttcacc atcaccggcg gcgagcaccg cctccgcaac 420

taccggtccg tcaccaccgt ctccgaactc tccccggccg cgcccgctga gatctgcacc 480

gtcgtcctcg agtcatacgt cgtcgacgtc cccgacggca acagcgagga ggacacgcgc 540

ctcttcgcgg acactgtcgt caggctcaac ctccagaagc tcaagtccgt ggccgaggcc 600

aacgccgccg ccgcggccac gaccgcgccg ccggcagaat aa 642

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>3

atggagcagc agcctgtg 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>4

ttattctgcc ggcggcgc 18

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>5

ccgtcaccac cgtctccgaa ct 22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>6

cctcggccac ggacttgagc t 21

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>7

aaatctggca tcacactttc tac 23

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>8

gtctcaaaca taatctgggt catc 24

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>9

tcgatgctca ccctgttgtt tg 22

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>10

tgtataattg cgggactcta atc 23

<210>11

<211>2432

<212>DNA

<213>Triticum aestivum L.

<400>11

tgggtgttct tcaggagtga aaaaggatgg ggtgagttct tgttgctacg gtttgctcaa 60

aaaatttatg tgatgggatt tctattaaag tgcataattg tggttctagt ttttttatcg 120

gttctcttgg cgaagaattg gtgaatcatg tactactatg ttttaagatg gcgtttagta 180

aaataaaaaa gtagtgaagt tatttcggtg gccagaaatg aaatgaattt gataaaataa 240

attactccac taaatttagg agatcagtta tgtacaatca aaatttagtg gagtaaaaat 300

agtccattaa tcttttagga gatgctcttc tattttttat tttttaggag atgctcttag 360

tttagaaaaa gatttctgct aaaaaaacac atcaaagtgt tgttcctgta gttttaagca 420

aagacagtta agtaaatccg aagagagaat atgcataaaa aaacattttt tgattcccta 480

gagtgaaaag gggtcgtaga ccaagagaga gagagagagt agagagagaa agtcctggtc 540

ccaattcccc atctcgcttc agcgtctact gctagataga gtagtattaa atgtactagc 600

aggcagctca ctcccgcaag gctccccttc atctctccct gctccaagcc tctctctcgc 660

acgcatccca tcccacccca ccccacccca cccgaccgcg ttgagtcgag tccaatcgat 720

ggagcagcag cctgtggcgg cggcagcggc agcggagccg gaggtaccgg cggggcttgg 780

gctgacggcc gcggagtacg cgcagctgct gcccacggtg gaggcgtacc accggtacgc 840

cgtggggcca ggccaatgct cctccctcgt cgcgcagcgt atcgaggcgc cgccagcagc 900

cgtctgggcc atcgtccgcc gcttcgactg cccccaggtg tacaaacact tcatccgcag 960

ctgcgcgctc cgcccggacc ccgaggccgg cgacgagctc cgcccgggcc gcctccgcga 1020

ggtcagcgtc atctccggcc tccccgccag caccagcacc gagcgcctcg acctcctcga 1080

cgacgcgcgc agggccttcg gcttcaccat caccggcggc gagcaccgcc tccgcaacta 1140

ccggtccgtc accaccgtct ccgaactctc cccggccgcg cccgctgaga tctgcaccgt 1200

cgtcctcgag tcatacgtcg tcgacgtccc cgacggcaac agcgaggagg acacgcgcct 1260

cttcgcggac actgtcgtca ggctcaacct ccagaagctc aagtccgtgg ccgaggccaa 1320

cgccgccgcc gcggccacga ccgcgccgcc ggcagaataa cggcggccgg atgctgtgat 1380

acgctttgct ttttctcggg agggggttgc ttcgaattga cgcatgcagg ggcttcgaat 1440

aggtgtgatt cctgaggtgc tgcctgtaat aaaactcttt ccatggactc ctccatcccc 1500

tttcttttcc tttcctttgg aattctttca cctttctgtc gtgcttgcaa ttggaattca 1560

actttgcatg tccgtgattc atagctcgct actgctagat gatcaagcca gcttatcact 1620

tatagcagta ctactcaatg ttcattagct tgattcatac tctagccctt gttgatcaat 1680

gatgatgatg atgaattagc acttgttgat caataatgat gatgaagaag aattagtact 1740

acctgctgat cgatgatgat gataataatg ttaaatggaa acgaaaagaa actaggagtg 1800

ctctaaactg tagaggctgg aacgatgtta ctgtgattga ttgtcttgag atgcttgttt 1860

agtgggtgtg gtttttgtct ctttcttgtc atgtttttct gttgcgtgtg ctccgggatg 1920

catgcatcat tgtttctgtt tggaaccggc atgaaaacac agcggcgatc gacacttgtt 1980

gcttctctag ttccctggag tagaaaacaa cacttccatt ttcccaggcc acactacaaa 2040

atttggtgaa tttatgtcca gtttgtgcat atctgaatat gttatcagcg actgtagcag 2100

tcatgtcatg tgatccattt gtgttagccc agccttccag aagccatcca tatcatgtga 2160

tgaatgctat tgccaagcaa gtttttactc atatttttca tgatcaaatc cattgctact 2220

gctatgctgg tgcttaaaga ttcagacatg gaaggaaaaa gccagtacag tagcagcaag 2280

aatgcaagat gctcaagagt cccagcgagc atcttctttt cttttctttt tttcttttca 2340

atcaatctgt ccgcctcctc ctttccagag acaaatcagt ttggaactta ctacaagtga 2400

aaaaacgaaa gttgcaggtc accaaagagc tc 2432

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>12

cgaagaattg gtgaatcatg tactac 26

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>13

taaaaaatag aagagcatct cctaaaag 28

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<211>189

<212>DNA

<213>Artificial sequence

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cgaagaattg gtgaatcatg tactactatg ttttaagatg gcgtttagta aaataaaaaa 60

gtagtgaagt tatttcggtg gccagaaatg aaatgaattt gataaaataa attactccac 120

taaatttcct aaatttagtg gagtaaaaat agtccattaa tcttttagga gatgctcttc 180

tatttttta 189

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<211>209

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>15

cgaagaattg gtgaatcatg tactactatg ttttaagatg gcgtttagta aaataaaaaa 60

gtagtgaagt tatttcggtg gccagaaatg aaatgaattt gataaaataa attactccac 120

taaatttagg agatcagtta tgtacaatca aaatttagtg gagtaaaaat agtccattaa 180

tcttttagga gatgctcttc tatttttta 209

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>16

cctctcttta gccatccctt ggtat 25

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<211>24

<212>DNA

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<400>17

cagcacctca ggaatcacac ctat 24

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<211>22

<212>DNA

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<400>18

ccgtcaccac cgtctccgaa ct 22

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<211>21

<212>DNA

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<400>19

cctcggccac ggacttgagc t 21

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>20

aaatctggca tcacactttc tac 23

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>21

gtctcaaaca taatctgggt catc 24