一种药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用 (Drug targeting polymeric micelle and preparation method and application thereof ) 是由 刘艳华 毕嘉威 刘金霞 曹永敬 杨嘉玉 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶联药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用,属于药物载体技术领域。该胶束是以透明质酸-甘草次酸聚合物为载体,在聚合物表面以化学键合的方法连接胶原蛋白酶,并将抗肝纤维化药物物理包载其中,以纳米技术构建聚合胶束递送抗肝纤维化药物,通过胶束的透明质酸外壳特异性靶向至肝纤维化的主要效应细胞肝星状细胞,借助胶原蛋白酶穿透纤维化胶原屏障,实现高效靶向肝脏递送抗肝纤维化药物的目的,本发明的递药载体具有更高的递药效率,克服了肝星状细胞递送难的问题。(The invention discloses an enzyme-linked drug targeting polymeric micelle and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of drug carriers. The micelle takes a hyaluronic acid-glycyrrhetinic acid polymer as a carrier, is connected with collagenase on the surface of the polymer by a chemical bonding method, physically entraps anti-hepatic fibrosis drugs, constructs a polymeric micelle by a nanotechnology to deliver the anti-hepatic fibrosis drugs, specifically targets to hepatic stellate cells which are main effect cells of hepatic fibrosis through a hyaluronic acid shell of the micelle, and penetrates a fibrotic collagen barrier by virtue of the collagenase to realize the purpose of efficiently delivering the anti-hepatic fibrosis drugs by targeting the liver.)
技术领域
本发明属于药物载体
技术领域
，具体涉及一种药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用。背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，除了肝脏移植手术外基本无治愈可能。研究发现，在肝癌病变机制过程中，肝脏在受到疾病或外界致病因素干扰后产生损伤后，首先要经历肝纤维化(Liver fibrosis，LF)这一阶段才逐渐恶化成为肝癌，LF主要表现在组织变性及组织炎症浸润，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的增生和降解失衡，进而导致肝内纤维结缔组织异常增生，这一系列临床表现即构成了LF。并且研究发现，LF不同于肝硬化与肝癌，病理条件决定了LF的组织是可以被药物治愈并逆转成为正常肝脏，即在早期发现LF并进行积极治疗将会阻止病变组织发展成为肝细胞癌，从而挽救患者的生命。因此LF的逆转治疗逐渐引起了人们的关注。
位于肝脏肝细胞和窦状内皮细胞之间的窦周间隙中腔中的肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发病的主要细胞。疾病发生后，活化的HSC分泌过量的纤维化胶原，随后在肝脏Disse腔中大量沉积，同时表达纤维化相关产物如波形蛋白、胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。加速ECM产生的同时，HSC通过分泌基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)抑制ECM的降解。因此肝星状细胞成为了治疗肝纤维化的关键细胞。实验证实，将药物递送至肝星状细胞后可以明显减轻动物的纤维化程度。并且由于肝纤维化组织中由胶原蛋白和粘连蛋白等物质构成的基质屏障不仅构成了肝纤维化中瘢痕组织，更限制了药物的穿透，使进入肝脏的药物难以抵达肝星状细胞发挥治疗作用。
目前尚未有针对肝纤维化的特效药物，但是已经有大量临床实验证实一些药物可以通过不同的机制减轻或者逆转肝纤维化。然而药物本身的缺点限制了它们在抗纤维化治疗过程中的作用，如疏水性较强的药物导致其生物利用度较低，这就使治疗效果大打折扣。同时病变组织存在的由胶原蛋白组成的ECM屏障也成为了阻止药物进入细胞发挥疗效的关键难题。
因此，如何提供一种能够穿透ECM屏障进行供给药物的药物靶向聚合胶束是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种靶向药物聚合胶束及其制备方法和应用，在本发明中，我们用HA以乙二胺枝接疏水分子，形成两亲性的聚合胶束，并在胶束表面用I型胶原蛋白酶进行修饰，形成表面含酶的聚合胶束COL-HA-GA，COL-HA-DOCA及COL-HA-VE，并以HA为靶头进行特异性靶向。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种酶联药物靶向聚合胶束，透明质酸分子接枝有疏水分子和胶原蛋白酶分子，具体结构如下：
R1、R2…Rn选自疏水分子、胶原蛋白酶分子或OH中的任意一种；N为正整数；
作为优选的技术方案，自疏水分子、胶原蛋白酶分子通过乙二胺和透明质酸分子链接；
作为优选的技术方案，疏水分子为甘草次酸(GA)、脱氧胆酸(DOCA)和琥珀酸维生素E(VE)中的一种或几种；
作为优选的技术方案，所述胶原蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶、Ⅱ胶原蛋白酶、Ⅳ型胶原蛋白酶和Ⅴ型胶原蛋白酶中的一种或几种；
作为优选的技术方案，疏水分子接枝率为10％-40％；
作为优选的技术方案，胶原蛋白酶的接枝率为60％-100％；
作为优选的技术方案，所述药物靶向聚合胶束为所述疏水分子为甘草次酸的药物靶向聚合胶束，所述抗肝纤维化药物占该聚合胶束总质量的5％-10％，所述甘草次酸占该药物靶向聚合胶束单体分子总质量的6％-39.4％，所述胶原蛋白酶占该药物靶向聚合胶束单体分子总质量的1％-10％；
作为优选的技术方案，抗肝纤维化药物为索拉非尼、尼洛替尼、水飞蓟宾和阿霉素中的一种或几种；
一种酶联药物靶向聚合胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘草次酸(GA)、脱氧胆酸(DOCA)或琥珀酸维生素E(VE)溶于有机溶剂，加入缩合剂，搅拌1-3h，得疏水分子-缩合剂中间体；将疏水分子-缩合剂中间体加入乙二胺中，室温搅拌12-24h，纯化后，得到乙二胺修饰的疏水分子中间体；
作为优选的技术方案，所述纯化包括：去除乙二胺和柱层析；
(2)将步骤(1)中的乙二胺修饰的疏水分子中间体，加入到透明质酸中，再加入有机溶剂，搅拌均匀后，加入缩合剂反应12-24h，纯化后，得药物靶向聚合胶束；
作为优选的技术方案，所述透明质酸为透明质酸的水溶液；
作为优选的技术方案，搅拌时间为1-2h；
(3)将步骤(2)中的药物靶向聚合胶束加入缩合剂，反应平衡后，加入含胶原蛋白酶的磷酸盐缓冲液，在0-4℃下反应2-8h，纯化后，得修饰有胶原蛋白酶的聚合物，为酶联药物靶向聚合胶束。
作为优选的技术方案，所述计算疏水分子和胶原蛋白酶的接枝率的方法为：根据紫外-可见分光光度计法得到疏水分子和胶原蛋白酶的标准曲线，根据紫外法测定疏水分子在特定波长的吸光度，即可计算出疏水分子在该胶束中的物质的量，接枝率即为n(疏水分子)/n(HA)×100％。同理，由考马斯亮蓝法测定胶原蛋白酶在胶束中的含量，蛋白酶接枝率为C(样品)×V(样品)/W(理论)。C(样品)为测定的酶的浓度，V(样品)为胶束溶液稀释的体积，W(理论)为合成前胶原蛋白酶的质量。
作为优选的技术方案，所述缩合反应时间为1-3h；
作为优选的技术方案，所述纯化方法可为透析；
作为优选的技术方案，其特征在于，步骤(1)、(2)和(3)中，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的任意一种或几种。
作为更优选的技术方案，步骤(1)中，缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐；
作为更优选的技术方案，步骤(1)中，所述甘草次酸、缩合剂和乙二胺的质量体积比为0.1～2g：0.05～1g：20～40mL；
作为更优选的技术方案，步骤(3)中，缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；EDC·HCL和NHS物质的量比为1：1；
作为更优选的技术方案，步骤(3)中，EDC·HCL、NHS和HA-GA物质的量比为1：1：1.5；
作为更优选的技术方案，步骤(3)中，HA-GA和胶原蛋白酶的质量比为10mg：1mg；
作为优选的技术方案，步骤(3)中，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的任意一种或几种；
作为优选的技术方案，步骤(1)和(2)中，所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇、二甲基亚砜、N，N二甲基甲酰胺、1，4二氧六环、正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯中的任意一种或几种；
作为更优选的技术方案，步骤(1)中，有机溶剂为甲醇、二甲基亚砜、二氯甲烷或乙酸乙酯中的任意一种；
作为更优选的技术方案，步骤(1)中，有机溶剂为甲醇；
作为更优选的技术方案，步骤(2)中，有机溶剂为无水乙醇；
作为优选的技术方案，步骤(3)中，所述胶原蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶、Ⅳ型胶原蛋白酶和Ⅴ型胶原蛋白酶中的一种或几种；
作为更优选的技术方案，步骤(3)中，所述胶原蛋白酶为Ⅰ型胶原蛋白酶，反应温度为0℃；
作为优选的技术方案，步骤(1)中，所述疏水分子、缩合剂、有机溶剂、乙二胺的质量体积比为0.1～2g：0.05～1g：20～40mL：20～40ml；
作为优选的技术方案，步骤(2)中，所述透明质酸、乙二胺修饰的疏水分子中间体和缩合剂的质量比为50～200mg：1～20mg：50～200mg。
作为优选的技术方案，步骤(2)中，透明质酸、乙二胺修饰的疏水分子中间体和缩合剂的质量比为50～80mg：5～10mg：80～100mg；
作为优选的技术方案，步骤(3)中，所述聚合物HA-GA，HA-DOCA及HA-VE、缩合剂和胶原蛋白酶的质量比为10～50mg：10～100mg：1～10mg。
作为更优选的技术方案，步骤(3)中，所述聚合物HA-GA，HA-DOCA或HA-VE与缩合剂的质量比为5～10mg：80～100mg，聚合物HA-GA和胶原蛋白酶的质量比为10mg：1mg；
一种包载抗肝纤维化药物酶联药物靶向聚合胶的制备方法，具体方法如下：
将抗肝纤维化药物溶于有机溶剂与药酶联药物靶向聚合胶束混合，通过薄膜分散法、透析法或溶剂挥发-超声法制备包载抗肝纤维化药物的酶联药物靶向聚合胶束。
作为优选的技术方案，所述有机溶剂为：甲醇、二甲基亚砜、二氯甲烷或乙酸乙酯中的任意一种或几种。
作为优选的技术方案，有机溶剂为甲醇；
作为优选的技术方案，所述抗肝纤维化药物为索拉非尼、尼洛替尼、水飞蓟宾和阿霉素中的一种或几种。
作为优选的技术方案，抗肝纤维化药物与酶联药物靶向聚合胶束的质量比为1mg：10～30mg。
作为更优选的技术方案，具体方法如下：
将修饰有胶原蛋白酶的聚合物HA-GA，HA-DOCA或HA-VE胶束单体分子溶于蒸馏水中，抗肝纤维化药物溶解于有机溶剂，在搅拌的条件下将含有抗肝纤维化药物的有机溶剂逐滴加入含胶束的水溶液中，磁力搅拌器12-24h后采用冰浴超声10-20min，离心除去杂质，即可制得的载抗肝纤维化药物的纳米胶束。
综上所述，本发明公开了一种酶联药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用，为了克服HSC外存在的ECM屏障对药物递送的影响和提高两亲性聚合胶束的递药效率，提高治疗效果，我们选择用可以水解细胞外基质中胶原蛋白的胶原蛋白酶通过化学键合的方式连接在聚合胶束的表面，使其成为可以溶解ECM屏障的“钻头”，从而使胶束可以成功穿透肝纤维化组织中的ECM屏障，达到更高效靶向递送药物的目的。
本发明的目的之一是：针对肝纤维化的微环境设计了一种包载抗肝纤维化药物的靶向聚合胶束及其制备方法和应用，本发明的聚合物载体可以提高载体对肝纤维化组织中ECM的穿透能力，增加抗肝纤维化药物进入肝星状细胞，用于实现更高效的靶向递药和提高治疗效果，为肝纤维化的临床治疗提供新方法。
本发明的目的之二是：提供一种包载抗肝纤维化药物的靶向聚合胶束及其制备方法和应用，其特别之处在于：由透明质酸(HA)提供连接甘草次酸(GA)、脱氧胆酸(DOCA)和维生素E琥珀酸酯(VE)形成两亲性聚合胶束载体包载抗肝纤维化药物，并将胶原蛋白酶以化学键合的方式连接在胶束表面，借助于胶原蛋白酶对肝纤维化组织中细胞外基质的胶原蛋白的特异性降解，增强了胶束穿透肝纤维化组织中的细胞外基质的能力，从而增强药物对肝星状细胞的抑制作用，减轻纤维化的程度。
附图说明
图1为制备HA-GA、HA-DOCA、HA-VE载药胶束和空白胶束的细胞制剂毒结果图；
图2为COL-HA-GA、COL-HA-DOCA和HA-VE胶束的粒径及透射电镜图；
图3为本发明FITC标记的COL-HA-GA聚合物对体外模拟的ECM屏障的穿透效果和HSC对胶束摄取的流式结果图及体内穿透ECM基质和HSC的共定位的免疫荧光染色；
图4为本发明Sora/COL-HA-GA胶束体内抗肝纤维化药效学结果图。
图5为模型小鼠经不同处理后，肝脏组织的染色结果图片。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：COL-HA-GA的合成
1.41g GA溶于30mL甲醇搅拌至溶解，加入0.967g DMT-MM，室温下搅拌1.5h，旋蒸除去溶剂，取出产物加入30mL乙二胺中室温搅拌12h，旋蒸除去乙二胺，得到的固体通过乙醇溶解，加硅胶粉拌匀后旋蒸除去溶剂，得到固体粉末。将硅胶粉用乙酸乙酯湿法装柱，产物的粉末装于柱中，加入乙酸乙酯并使液面不低于粉末。以乙酸乙酯：甲醇＝2:1为洗脱剂进行洗脱，收集产物，产物旋蒸除去溶剂后真空干燥12h，得到干燥的黄色粉末，即为产物GA-NH2。在圆底烧瓶中加10mL蒸馏水，60mg HA(70k Da)加入水中室温搅拌至溶解。加入GA-NH238.4mg。同时滴加适量无水乙醇搅拌3h至溶液澄清。加入DMTMM 83mg，室温搅拌过夜。溶液置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，产物于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到白色粉末产物，即为HA-GA。精密称取NHS 23mg和EDC·HCl 40mg分别溶于1mL水中，取HA-GA 15mg加5mL水，搅拌15min至溶解，加入EDC·HCl搅拌15min后加NHS溶液，搅拌反应4h。精密称取3mg COL I溶于1mL PBS中，与上述溶液混合后冰浴搅拌2h，合成产物COL-HA-GA。产物置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到淡黄色粉末产物，即为CHG。
实施例2：包载索拉非尼的COL-HA-GA胶束的制备
精密称取20mg的索拉非尼溶于10mL甲醇，制得索拉非尼溶液(2mg/mL)；称取实施例1或2中制得的COL-HA-GA聚合物10mg溶于10mL纯水中；CHG聚合物与索拉非尼以质量比10：1的投药量取所需体积，在搅拌的情况下将索拉非尼的甲醇溶液缓缓注入COL-HA-GA聚合胶束溶液中，搅拌至甲醇挥发完全，冰浴超声5min(200w，3s/3s)，即得粒径为200nm～250nm的包载索拉非尼的COL-HA-GA胶束。Sora/COL-HA-GA胶束的透射电镜图见图2所示。从透射电镜图可看出，它们成光滑圆整的球状，分散性良好。
实施例3：
COL-HA-DOCA的合成
1.176gDOCA溶于30mL甲醇搅拌至溶解，加入0.967g DMT-MM，室温下搅拌1.5h，旋蒸除去溶剂，取出产物加入30mL乙二胺中室温搅拌12h，旋蒸除去乙二胺，得到的固体通过乙醇溶解，加硅胶粉拌匀后旋蒸除去溶剂，得到固体粉末。将硅胶粉用乙酸乙酯湿法装柱，产物的粉末装于柱中，加入乙酸乙酯并使液面不低于粉末。以乙酸乙酯：甲醇＝2:1为洗脱剂进行洗脱，收集产物，产物旋蒸除去溶剂后真空干燥12h，得到干燥的黄色粉末，即得到中间体产物。在圆底烧瓶中加10mL蒸馏水，60mg HA(70kDa)加入水中室温搅拌至溶解。加入中间体60mg。同时滴加适量无水乙醇搅拌3h至溶液澄清。加入DMTMM138mg，室温搅拌过夜。溶液置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，产物于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到产物，即为HA-DOCA。精密称取NHS 92mg和EDC·HCl 160mg分别溶于1mL水中，取HA-DOCA 60mg加10mL水，搅拌15min至溶解，加入EDC·HCl搅拌15min后加NHS溶液，搅拌反应4h。精密称取5mgColI溶于1mL PBS中，与上述溶液混合后冰浴搅拌2h，合成产物COL-HA-DOCA。产物置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到淡黄色粉末产物，即为COL-HA-DOCA。
实施例4：
包载索拉非尼的COL-HA-DOCA胶束的制备。
精密称取20mg的索拉非尼溶于10mL甲醇，制得索拉非尼溶液(2mg/mL)；称取实施例4中制得的COL-HA-DOCA聚合物10mg溶于10mL纯水中；CHG聚合物与索拉非尼以质量比10:1的投药量取所需体积，在搅拌的情况下将索拉非尼的甲醇溶液缓缓注入COL-HA-DOCA聚合胶束溶液中，搅拌至甲醇挥发完全，冰浴超声5min(200w，3s/3s)，即得粒径为200nm～250nm的包载索拉非尼的COL-HA-DOCA胶束。
实施例5：
COL-HA-VE的合成
1.59gVE溶于30mL甲醇搅拌至溶解，加入0.967g DMT-MM，室温下搅拌1.5h，旋蒸除去溶剂，取出产物加入30mL乙二胺中室温搅拌12h，旋蒸除去乙二胺，得到的固体通过乙醇溶解，加硅胶粉拌匀后旋蒸除去溶剂，得到固体粉末。将硅胶粉用乙酸乙酯湿法装柱，产物的粉末装于柱中，加入乙酸乙酯并使液面不低于粉末。以乙酸乙酯：甲醇＝2:1为洗脱剂进行洗脱，收集产物，产物旋蒸除去溶剂后真空干燥12h，得到干燥粉末，即中间体产物。在圆底烧瓶中加10mL蒸馏水，60mgHA(70kDa)加入水中室温搅拌至溶解。加入中间体60mg。同时滴加适量无水乙醇搅拌3h至溶液澄清。加入DMTMM 138mg，室温搅拌过夜。溶液置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，产物于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到HA-VE。精密称取NHS92mg和EDC·HCl160mg分别溶于1mL水中，取HA-VE60mg加10mL水，搅拌15min至溶解，加入EDC·HCl搅拌15min后加NHS溶液，搅拌反应4h。精密称取5mgColI溶于1mLPBS中，与上述溶液混合后冰浴搅拌2h，合成产物COL-HA-VE。产物置于透析袋中(Mn＝3500)于蒸馏水中透析2天除去杂质，于-20℃冷冻12h，于冷冻干燥机干燥24h，得到产物COL-HA-VE。
实施例7：
包载索拉非尼的COL-HA-VE胶束的制备。
精密称取20mg的索拉非尼溶于10mL甲醇，制得索拉非尼溶液(2mg/mL)；称取实施例5中制得的COL-HA-VE聚合物10mg溶于10mL纯水中；胶束聚合物与索拉非尼以质量比10:1的投药量取所需体积，在搅拌的情况下将索拉非尼的甲醇溶液缓缓注入COL-HA-VE聚合胶束溶液中，搅拌至甲醇挥发完全，冰浴超声5min(200w，3s/3s)，即得粒径为200nm～250nm的包载索拉非尼的COL-HA-VE胶束。
效果例1：细胞制剂毒研究
将肝星状细胞HSC接种到96孔细胞培养板中，放置于细胞培养箱中孵育过夜，弃去旧培养液，然后给予不同浓度的实施例中制备的Sora/COL-HA-GA溶液、Sora/COL-HA-DOCA溶液、Sora/COL-HA-VE溶液，Sora/COL-HA-GA、COL-HA-DOCA、COL-HA-VE溶液胶束和索拉非尼溶液，载药胶束的给药浓度与普通溶液组保持一致。孵育72h，每孔加入浓度为2mg/mL的MTT溶液50μL，孵育4h后。移液枪吸去旧的培养液，每孔加入100μL DMSO。采用酶标仪于490nm下测定OD值，计算细胞活力。结果如图1，不同治疗组对HSC的抑制程度随索拉非尼浓度增大而增大，其中，Sora/COL-HA-GA胶束组抑制HSC作用最强，这是因为通过HSC表面存在HA的靶点CD44受体，胶束的HA起到了靶向作用，使胶束更容易进入HSC细胞，同时另外两组胶束组对HSC抑制作用比COL-HA-GA的作用弱，这可能是因为GA本身是一种TGF-β/Smad通路的抑制剂，可以通过抑制HSC中的TGF-β的合成来达到抑制HSC增殖的作用。三种载体进行比较后认为COL-HA-GA胶束可以和索拉非尼达到协同抗纤维化的作用，因此在后续的研究中我们使用COL-HA-GA胶束作为包载药物的胶束。
效果例2：胶束的粒径表征
通过上述方法制备了空白胶束，通过马尔文激光粒度仪测定两种胶束的粒径。结果如图2所示，COL-HA-DOCA胶束，COL-HA-GA和COL-HA-VE胶束粒径均在200nm以上，粒径大小相似。透射电镜可以看到三种胶束呈现均匀的圆球形。
效果例3：人工模拟ECM屏障存在的情况下HSC对FITC标记的COL-HA-GA胶束的摄取
在Transwell小室中构建I型鼠尾胶原蛋白的屏障，将肝星状细胞HSC接种到24孔细胞培养板中的中间两排中，培养24h后弃去旧的培养基，加入500μL无FBS的DMEM，将Transwell小室置于有细胞的孔中，将FITC标记的COL-HA-GA胶束加入Transwell小室中，在固定的时间通过胰酶消化细胞，离心收集后PBS清洗三遍，流式细胞仪检测HSC对FITC标记的COL-HA-GA胶束的摄取。结果如图3所示，相较于游离的FITC组和FITC标记的HA-GA胶束组，HSC对FITC标记的COL-HA-GA胶束摄取量最多，证实了COL-HA-GA胶束较不含酶的HA-GA胶束有更好的穿透能力，更容易穿透人工模拟ECM屏障并被HSC摄取。
效果例3：体内抗肝纤维化药效学研究
配置含25％四氯化碳(CCl4)的橄榄油溶液，采用4-6周龄的ICR雄性小鼠进行实验，空白组不作任何处理，纤维化造模组为腹腔注射四氯化碳(CCl4)的橄榄油溶液(4μL/g)，每周两次，为期四周。将空白组和纤维化组随机分组，每组五只，分别通过尾静脉注射生理盐水、索拉非尼溶液、Sora/COL-HA-GA胶束和Sora/HA-GA胶束。每周给药两次，同时注射四氯化碳(CCl4)的橄榄油溶液，于三周后最后一次给药后初四小鼠，取组织进行HE染色、天狼猩红染色和马松染色，观察治疗组对纤维化小鼠的治疗效果。结果如图4-5所示，与PBS组相比，Sora/COL-HA-GA组、Sora/HA-GA组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显降低，并且在Sora/COL-HA-GA处理组，ALT和AST水平接近正常小鼠水平，肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量较纤维化小鼠组明显降低，恢复到正常水平，表明肝脏中胶原含量降低。结果证明，Sora/COL-HA-GA能显著恢复正常肝脏功能，降低肝纤维化因子，使肝脏中胶原蛋白含量降至正常水平。HE染色显示，模型组小鼠肝细胞呈空泡样改变，排列混乱，同时局部肝细胞出现出血、水肿、点状坏死。肝小叶结构遭到破坏，出现炎性细胞浸润。Sora/COL-HA-GA组小鼠肝细胞正常，细胞核呈圆形，无细胞变性坏死，肝小叶网状纤维结构，完整清晰，汇管区无炎细胞浸润以及胶原纤维增生。在马松染色中，对照组和HG，GA组出现了大量的胶原堆积，COL-HA-GA组和Sora/COL-HA-GA组的胶原较少，因为COL-HA-GA胶束可以有效降解胶原蛋白，治疗组的索拉非尼可以抑制胶原，从而达到治疗的目的。Sora/COL-HA-GA对肝纤维化小鼠的治疗起到了较好效果，使治疗后小鼠的纤维化指标下降，纤维化小鼠的肝脏恢复到正常水平。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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