一种环孢素聚合物胶束制剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种环孢素聚合物胶束制剂及其制备方法 (Cyclosporine polymer micelle preparation and preparation method thereof ) 是由 程增江 满艳哲 程思奇 赵京华 于 2020-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种环孢素聚合物组合物,其包括环孢素和两亲性嵌段共聚物,所述两亲性嵌段共聚物包含疏水性链段和亲水性链段,并且所述两亲性嵌段共聚物具有式(I)所示的结构。所述组合物加水溶解即形成环孢素聚合物胶束溶液,如滴眼液,可用于治疗眼科疾病如干眼症。所述组合物为固体形式,稳定性好,便于储存和运输；加水溶解形成的胶束溶液也具有很好的稳定性,可满足眼部用药的需求。本发明还提供了所述组合物的制备方法,将两亲性嵌段聚合物加热熔融,加入环孢素,搅拌至澄清透明,冷却即得。所述制备工艺简单,重复性好,可规模化生产,具有良好的产业化前景。(The invention provides a cyclosporine polymer composition, which comprises cyclosporine and an amphiphilic block copolymer, wherein the amphiphilic block copolymer comprises a hydrophobic chain segment and a hydrophilic chain segment, and has a structure shown in a formula (I). The composition is dissolved in water to form a cyclosporin-containing polymeric micellar solution, such as eye drops, which can be used for treating ophthalmic diseases such as dry eye. The composition is in a solid form, has good stability and is convenient to store and transport; the micelle solution formed by dissolving in water also has good stability, and can meet the requirements of eye medication. The invention also provides a preparation method of the composition, which comprises the steps of heating and melting the amphiphilic block polymer, adding cyclosporine, stirringStirring to be clear and transparent, and cooling to obtain the final product. The preparation process is simple, has good repeatability, can realize large-scale production, and has good industrial prospect.)
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种环孢素聚合物胶束制剂及其制备方法。
背景技术
干眼症又名角结膜干燥症，是指由任何原因(包括老龄、配戴隐形眼镜、某些药物、眼疾、其他疾病或环境因素等)造成的泪液质、量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降(泪膜破坏并在角膜上形成干斑)，并伴有眼部不适(眼睛干涩、刺痛、灼痛、砂砾感等)和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。干眼症是目前最为常见的眼表疾病，主要治疗方法是使用人工泪液。近年来，干眼病已经成为一种全球性的流行性疾病，患病率(患干眼病风险人群中的患病人数比)大约为5％-34％，我国患病率大约为21％-30％，处于较高水平。据统计，国内干眼病患者约为7500万人，在美国有多达1600万成年人被诊断患有干眼症。
环孢素是一种免疫调节剂与抗炎药，能抑制促炎症细胞因子的生成与释放，并提高抗炎症细胞因子的释放水平，临床上可有效地改善由长期炎症所致的干眼症状与体征。但环孢素脂溶性极强，水中溶解度很低，因此常采用亲脂性载体提高药物的穿透力。目前临床常用的环孢素处方中采用大量有毒增溶剂增加环孢素的溶解度。例如，被用作环孢素溶剂的Cremophor RH40易导致过敏反应和肾脏毒性。此外，环孢素制剂还存在药物起效慢，使用频率高，患者耐受性差等缺点。例如，艾尔建公司的用于慢性、中至重度干眼症的长期治疗的产品Restasis(丽眼达，0.05％环孢素)在治疗干眼症时最长需使用6个月以上才能起效，患者甚至一天需要用药4-5次，且用药时灼烧感较强，部分患者难以耐受。因此，开发不含有阳离子型表面活性剂的水溶性环孢素制剂具有重要意义。
聚合物胶束是近年来发展起来的一种新型给药系统。胶束通常由两亲性嵌段共聚物分子链定向排列形成，其疏水链段通过和药物分子之间的弱的相互作用而将药物包裹于核中，亲水链向外稳定胶束，呈现典型的核-壳结构。聚合物胶束不仅能增加药物的溶解度，提高治疗有效性，而且药物被包裹其中，可避免降解失活，并减少毒副反应。胶束的粒径通常在10-100nm之间，对人体组织具有很强的渗透性，因此，给药后的起效速度较快。但一般高分子聚合物和药物之间的相容性通常较弱，因此形成的载药胶束的稳定性也较低，表现为制备好的胶束溶液容易在较短时间内出现药物析出和沉淀。此外，一般聚合物胶束制剂为冻干粉针，存在制备工艺复杂，成本高昂，不易推广等问题。因此，选择适宜的高分子辅料，增强环孢素和高分子之间的作用力，并通过合理的制备工艺，得到全新的环孢素胶束制剂，提高其在水溶液中的溶解度和稳定性是开发环孢素新制剂的重要方向。本发明公开了一种两亲性嵌段高分子聚合物及两亲性嵌段高分子为辅料制得含药胶束制剂的方法，该高分子和药物分子之间可形成非常稳定的胶束，并且通过简单的混合工艺即可得到药物制剂，在使用前加水溶解即可形成可用于眼部给药的含药胶束。
发明内容
为克服现有技术中的问题，本发明提供了一种环孢素聚合物组合物，其包括环孢素和两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物包含疏水性链段和亲水性链段，并且所述两亲性嵌段共聚物具有下式(I)的结构：
其中A为亲水嵌段，可选自聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸(PAA)、海藻酸、海藻酸钠或透明质酸中的一种、两种或更多种；B为疏水嵌段，可选自聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙交酯丙交酯(PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚氧丙烯(PPO)、聚苯乙烯(PS)、聚异丙基丙烯酰胺(PIPAA)或聚碳酸酯(PC)中的一种、两种或更多种；L为连接基；Q为包含巯基或二硫键官能团的基团；且r为1-10的整数。
根据本发明，在式(II)的结构中，A部分的数均分子量在1000～5000之间，B部分的数均分子量在500～50000之间。
根据本发明，Q部分具有下式(II)的结构：
其中R3为C1-C6的亚烷基或者C1-C6的亚烯基，其中一个、两个或更多个碳原子可任选地被选自O、N和S的杂原子取代或者可任选地被氧代；
或者，Q部分具有下式(III)的结构：
-R4-SH
(III)
其中R4为C1-C8的亚烷基或者C1-C8的亚烯基，其中一个、两个或更多个碳原子可任选地被选自O、N和S的杂原子取代或者可任选地被氧代。
根据本发明，在式(II)的结构中，R3为-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH、-CH2CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CHCH2CH2-、-CH2CH2CH＝CHCH2CH2-、-CH2CH＝CHCH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH＝CHCH2-、-CH2CH2O-、-C(O)CH2-、-CH2CH2OCH2-、-CH2C(O)CH2-、-CH2CH2OCH2CH2-、-C(O)CH＝CH、-C(O)CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CHC(O)CH2-、-CH2C(O)CH＝CHCH2CH2-、-CH2C(O)CH＝CHC(O)CH2-、-CH2-NH-、-(CH2)2-NH-、-CH2CH2S-或者-CH2CH2SCH2-中的一个。
根据本发明，Q部分具有以下结构：
根据本发明，在式(III)的结构中，R4为-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH、-CH2CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CHCH2CH2-、-CH2CH2CH＝CHCH2CH2-、-CH2CH＝CHCH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH＝CHCH2-、-CH2CH2O-、-C(O)CH2-、-CH2CH2OCH2-、-CH2C(O)CH2-、-CH2CH2OCH2CH2-、-C(O)CH＝CH、-C(O)CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CHC(O)CH2-、-CH2C(O)CH＝CHCH2CH2-或者-CH2C(O)CH＝CHC(O)CH2-、-CH2-NH-、-(CH2)2-NH-、-CH2CH2S-或者-CH2CH2SCH2-中的一个。
根据本发明，在式(I)的结构中，r为1-6的整数，如1、2、3、4、5或6。
根据本发明，在式(I)的结构中，L具有以下结构：
-C(O)CH2O-、-C(O)(CH2)2O-、-C(O)(CH2)3O-、或中的一个。
根据本发明，两亲性嵌段共聚物具有下式的结构：
其中，m＝20～500的整数，n＝3～500的整数；优选地，m＝20～200的整数，n＝3～50的整数。
根据本发明的环孢素聚合物组合物，其中环孢素和所述两亲性嵌段共聚物的重量比可以为1:(1～100)，例如，1:(2～80)，1:(3～50)，1:(4～20)，1:(4～10)，具体可以为例如1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等。
根据本发明的环孢素聚合物组合物，其还可以包括常规的pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、粘度调节剂等。优选地，本发明的环孢素聚合物组合物不含有抑菌剂。所述pH调节剂可以为磷酸盐、硼酸盐等；所述渗透压调节剂可以为氯化钠、硼酸、硼砂、葡萄糖等；所述抑菌剂可以为季铵盐类如苯扎溴铵、对羟基苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯和乙酯等；所述粘度调节剂可以为甲基纤维素、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素等。
根据本发明的环孢素聚合物组合物，优选其为固体。
此外，本发明还提供所述环孢素聚合物组合物的制备方法，包括固体熔融法或溶剂蒸发法；优选固体熔融法，该法成本低，控制容易。
根据本发明，所述环孢素聚合物组合物的制备方法采用固体熔融法，包括以下步骤：
步骤1)：将两亲性嵌段聚合物加热熔融；
步骤2)：将步骤1)的聚合物熔融体与环孢素混合，搅拌；
步骤3)：将步骤2)的混合物冷却后，得到环孢素聚合物组合物。
根据本发明，在步骤1)中，可以将所述两亲性嵌段共聚物加热至40～80℃，例如40～60℃。根据本发明，在步骤2)中，将混合物搅拌至澄清透明。
本发明的环孢素聚合物组合物的制备方法，还任选地包括以下步骤：
步骤4)：将步骤2)的混合物冷却后，进行冷冻干燥，得到环孢素聚合物组合物。
根据本发明，可以在步骤4)中加入药用辅料进行冻干，所述的药用辅料为冻干赋型剂、pH值调节剂和稳定剂等中的一种、两种或更多种。所述药用辅料可以选自乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠、甘氨酸、柠檬酸和明胶中的一种、两种或者更多种的混合物。
根据本发明，所述环孢素聚合物组合物的制备方法还可以采用溶剂蒸发法，包括以下步骤：将两亲性嵌段聚合物和环孢素溶于有机溶剂中，旋蒸除去有机溶剂。
根据本发明，所述有机溶剂例如可以为乙醇。
根据本发明，将上述旋蒸后的混合物加水溶解，然后进行冷冻干燥，得到环孢素聚合物组合物。
本发明还提供一种环孢素聚合物胶束的制备方法，其包括以下步骤：
将环孢素聚合物组合物与水混合，形成环孢素聚合物胶束溶液，该胶束溶液可用作滴眼液。所述水可以为蒸馏水、去离子水、纯化水或注射用水。所用水的重量可以为环孢素重量的100-5000倍，例如400-3000倍，如600-2000倍，如800-1500倍，如1000倍。
根据本发明，所述形成的胶束溶液澄清，不浑浊。
本发明还提供通过上述方法制备得到的环孢素聚合物组合物，或者所述组合物加水溶解后形成的环孢素聚合物胶束溶液，所述胶束溶液可用作滴眼液。
本发明还提供所述环孢素聚合物组合物或者所述环孢素聚合物胶束溶液用于制备治疗眼科疾病如干眼症的药物中的用途。
有益效果
本发明的环孢素聚合物组合物在加水溶解时即可形成聚合物胶束，所述两亲性嵌段共聚物的疏水性链段形成胶束的“核”，亲水性链段形成胶束的“壳”，环孢素被包裹在胶束的“核”中。所述组合物为固体形式，具有很好的稳定性，便于储存和运输。加水溶解形成的胶束溶液也具有很好的稳定性，在室温环境下至少可稳定24h以上无药物析出，可满足眼部用药的需求。本发明所述环孢素聚合物组合物与水形成的胶束溶液澄清，不浑浊，包封率可达95％以上，可以实现几乎全部的包封。所述粒径大约保持在10-50nm，如10-30nm(特别是15-25nm)的范围内。
本发明的环孢素聚合物组合物或环孢素聚合物胶束溶液如滴眼液的制备工艺简单，重复性好，可规模化生产，具有良好的产业化前景。
附图说明
图1示出了mPEG-PLA-(LA)4的1H核磁共振图谱。
图2示出了环孢素/mPEG-PLA-(LA)4胶束在室温下放置24h的粒径变化图。
图3示出了环孢素/mPEG-PLA-(LA)4胶束的体外释放曲线。
图4示出了mPEG-PLA-(LA)4胶束的斑马鱼毒性结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的交联聚合物胶束和载药交联聚合物胶束做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1：两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA-(LA)4的合成
50g二羟甲基丙酸溶解于250mL丙酮，加入对甲苯磺酸3.55g，二甲氧基丙烷69mL室温搅拌反应4h，加入氨水3mL终止反应后旋蒸去除溶剂，产物经水洗后得到羟基保护的二羟甲基丙酸。取50g羟基保护的二羟甲基丙酸溶解于二氯甲烷，加入环己基碳二亚胺30g，室温反应12h，旋蒸去除有机溶剂后产物溶解于正己烷，放入冰箱冷冻结晶后过滤干燥得到化合物1。
12g mPEG2000 130℃真空脱水两小时，加入4g D,L-丙交酯和40mg辛酸亚锡，反应物置于130℃真空聚合24h后，用适量二氯甲烷溶解，乙醚沉淀，真空干燥后得到的白色固体为甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(mPEG-PLA)，共聚物分子量为500-2000。
10g mPEG-PLA加入100mL二氯甲烷溶解，室温下依次加入1.3mL三乙胺，0.139g 4-吡咯烷基吡啶，3.05g化合物1反应6h。反应物溶液用无水乙醚沉淀后得到白色固体。所得白色固体加入100mL无水甲醇溶解，2.5g氢型离子交换树脂，在室温下搅拌反应24h；反应结束后，用4号砂芯漏斗过滤除去离子交换树脂，取滤液进行旋蒸浓缩，后用乙醚沉淀，真空干燥后得到白色固体。所得白色固体用100mL二氯甲烷溶解，室温下依次加入2.38mL三乙胺、0.254g 4-吡咯烷基吡啶和5.57g化合物1反应24h。反应结束后，产物溶液用无水乙醚沉淀，真空干燥得到白色固体。所得白色固体加入100mL无水甲醇溶解，后加入5g氢型离子交换树脂，在室温下搅拌反应24h。反应结束后用4号砂芯漏斗过滤除去离子交换树脂，滤液用无水乙醚沉淀，真空干燥后得到白色固体为末尾含有四个羟基的mPEG-PLA-(OH)4。
将6.87g硫辛酸放入圆底烧瓶中，加入100mL乙酸乙酯进行溶解；在-10℃下依次加入三乙胺和新戊酰氯，0℃反应2h，室温反应1h。反应结束后用4号砂芯漏斗过滤除去三乙胺盐酸盐，取滤液旋蒸，除去乙酸乙酯后得到的黄色粘稠液体为化合物2，然后用适量二氯甲烷稀释，备用；10g mPEG-PLA-(OH)4放入圆底烧瓶，加入100mL二氯甲烷溶解，依次加入4.62mL三乙胺、0.494g 4-吡咯烷基吡啶和上述化合物2，室温反应24h。反应结束后将反应物溶液用无水乙醚沉淀三遍，真空干燥后所得的白色产物为mPEG-PLA-(LA)4。
实验结果表明：该合成工艺所得的两亲性嵌段聚合物具有高纯度，各个基团比例和理论设计值吻合度高，且无明显的杂质引入，具体见图1。所得两亲性嵌段聚合物的数均分子量约为4040，PDI＝1.03。
实施例2：自组装的环孢素聚合物胶束溶液的制备
100mg mPEG-PLA-(LA)4和20mg环孢素溶于3mL乙醇，35℃旋蒸除去有机溶剂后向圆底烧瓶中加入10mL去离子水溶解后得到自组装的环孢素聚合物胶束溶液。
实施例3：环孢素聚合物胶束溶液的制备
100mg mPEG-PLA-(LA)4加热至45℃熔融形成透明的液体，加入20mg环孢素搅拌后形成均匀透明液体，冷却后即形成环孢素聚合物组合物。然后，加入20L超纯水溶解，得到澄清透明的溶液，即得环孢素聚合物胶束溶液。包封率(HPLC法)在95％以上。
实施例4：空白胶束的制备
依照上述实施例2的方法，区别在于不添加药物环孢素，从而制得空白胶束。
实施例5：胶束的稳定性
采用动态光散射测定实施例3得到的环孢素聚合物胶束溶液的稳定性。其在室温下的粒径分布的变化结果见图2。其中图2a为新鲜制备的胶束溶液的粒径分布，图2b为室温下放置24小时后的粒径分布。
结果表明：在室温下放置24h后，环孢素胶束的粒径分布基本没有变化。由此可见，该胶束具有良好的体外稳定性，可满足用药的需要。
实施例6：药物的体外释放
采用透析法研究环孢素胶束的体外释放行为。
实验方法如下：分别取实施例3的环孢素胶束溶液1mL置于透析袋(截留分子量3500)中，再将透析袋放入100mL含有0.2％(w/v)吐温80的PBS(pH＝7.4)透析介质中，然后放入37℃恒温摇床中震荡，转速100rpm。在预定时间点0.5、2、6、12、18、30、42、48和72h分别取样1mL，同时向透析介质中补加相同体积的新鲜透析介质。使用高效液相色谱仪对样品进行测试，计算药物释放率。结果见图3。
结果表明：所述环孢素胶束在72h内持续释放，72h的体外释放量大约为70％左右。
实施例7：急性毒性实验
实验方法：随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验室)30尾，每孔养鱼水容量为3mL，分别静脉注射给予mPEG-PLA-(LA)4111ng/尾、333ng/尾、1000ng/尾，注射容量均为10nl/尾(将mPEG-PLA-(LA)4用超纯水配置成相应浓度的溶液，即实施例4所述的空白胶束)。同时设置正常对照组(不进行任何注射)和溶剂对照组(超纯水注射组)。供试品处理期间，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除，供试品连续处理斑马鱼3天至7天后，在显微镜下观察记录斑马鱼心脏、脑部、下颚、眼、肝脏、肠、躯干/尾/脊索、肌肉/体节/运动、身体着色、循环系统、身体水肿、出血等反应情况。以各器官的反应情况统计各实验组的毒性发生率，对典型毒性器官进行拍照。结果见图4。
结果显示：各剂量组在注射后2、24、48和72h分别观察，均未见明显的毒性表型和毒性靶器官，与正常对照组斑马鱼类似。并至实验终点，各剂量组均未出现斑马鱼死亡。说明该两亲性嵌段聚合物对斑马鱼均无明显的毒副作用。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。