一种壳聚糖衍生物递药载体及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种壳聚糖衍生物递药载体及其制备方法和应用 (Chitosan derivative drug delivery carrier and preparation method and application thereof ) 是由 喻樊 于 2021-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种精氨酸和熊果酸修饰的壳聚糖纳米递药载体及其制备方法和其作为抗肿瘤药物载体的应用,其化学结构如通式I所示。与现有技术相比,本发明制备方法工艺简单,由于采用熊果酸、精氨酸对壳聚糖进行修饰,制备的纳米胶束载体不仅能够有效提高抗肿瘤药物的递送效率,精氨酸与壳聚糖6-C上的羟基生成酯,水溶性更高,载药量高,使药物能更有效地被传递到肿瘤细胞,还具有良好的穿膜深渗透、抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药、防止肿瘤细胞转移的功能。该递药载体可以增加肿瘤对药物的敏感性,抑制P-糖蛋白对抗癌药物的外排,逆转肿瘤耐药,提高抗癌效果,减少抗癌药的用药量,提高治疗效率。(The invention discloses an arginine and ursolic acid modified chitosan nano drug delivery carrier, a preparation method thereof and application thereof as an anti-tumor drug carrier, wherein the chemical structure of the chitosan nano drug delivery carrier is shown as a general formula I. Compared with the prior art, the preparation method of the inventionThe preparation method has the advantages that the process is simple, the chitosan is modified by ursolic acid and arginine, the prepared nano micelle carrier can effectively improve the delivery efficiency of the antitumor drug, the arginine and hydroxyl on the chitosan 6-C generate ester, the water solubility is higher, the drug loading capacity is high, the drug can be more effectively transferred to tumor cells, and the nano micelle carrier also has good functions of penetrating through a membrane and deeply penetrating, inhibiting P-glycoprotein from reversing tumor drug resistance and preventing tumor cell metastasis. The drug delivery carrier can increase the sensitivity of the tumor to drugs, inhibit the discharge of P-glycoprotein to anticancer drugs, reverse tumor drug resistance, improve anticancer effect, reduce the dosage of the anticancer drugs and improve treatment efficiency.)
技术领域
本发明属于纳米递药载体
技术领域
，具体涉及一种精氨酸和熊果酸修饰的壳聚糖纳米递药载体及其制备方法和应用。背景技术
目前，化学治疗已和手术治疗、放射治疗成为恶性肿瘤不可或缺的重要治疗手段。
临床化疗过程中，恶性肿瘤化疗失败的现象屡见不鲜，其主要原因就是长期应用抗肿瘤药物后所形成的肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)现象。所谓肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞长期接触一种化疗药物产生耐药性后，此肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性。目前已知与MDR有关的化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、博来霉素、丝裂霉素、长春碱、依托泊苷、紫杉醇类以及顺铂和美法仑等；随着化疗药物的频繁使用，肿瘤治疗中的耐药问题显得越来越突出，目前已成为肿瘤化学治疗最严重的障碍之一。美国癌症协会估计90％的癌症患者的死亡在不同程度上与耐药性的产生有关。
到目前为止，人们已经尝试了多种方法努力克服肿瘤MDR，包括使用化学增敏剂和抗肿瘤药物的靶向治疗等。但目前的肿瘤MDR逆转剂普遍存在作用靶点单一、自身毒副作用大等问题，使其临床应用受到很大影响。此外，有报道尝试采用脂质体为载体同时包载抗肿瘤药物与其它药物共同治疗肿瘤，但通过进一步研究发现这些药物与抗肿瘤药物联用后仍不能很好的解决多药耐药的问题。另外，由于临床应用的大多数化疗药物为疏水性药物，需要载体增溶后才能使用，因此开发安全、有效的载药递送系统对于化疗药物实现临床应用具有重要价值。但载药系统的研究都面临着：1、载体本身的毒性问题，由于可用作高效递送载体的材料，往往显示出代谢、排出性差的问题，由此存在潜在的载体毒性问题；2、载体不能帮助药物达到治疗的目的，通常载体都是惰性的，没有功能，起不到协同治疗肿瘤的目的；3、肿瘤具有防御机制，周围组织盘根错节，药物很难深渗透进入肿瘤周围，难以进入肿瘤细胞，同样是载体的设计和构建者经常要面对的棘手问题；4、靶向性问题，如果具有对肿瘤微环境的敏感性，将可减少对正常器官的毒副作用，提高抗肿瘤的疗效；5、生物相容性问题，大量合成的高分子聚合物注射进入血液后引起毒副作用，不适合用于静脉注射给药；6、肿瘤转移的问题，肿瘤发生、生长、治疗过程中会发生转移，使癌症不易根治，降低治疗效果，给病人带来痛苦。7、抗癌药合成不易，价格昂贵，迫切需要用较少的量达到更好的治疗效果，减轻病人的经流畅负担。8、抗耐药性问题，如何逆转耐药肿瘤细胞的耐药性，增强耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，将对提高化疗效果具有重要价值。可见，如何从众多的备选材料中合理地进行选择，巧妙地构建出理想的载药系统，尤其是能抗耐药肿瘤的靶向载药系统并非一件易事，但却对耐药肿瘤的有效治疗具有重要价值和意义。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明利用熊果酸、精氨酸对壳聚糖进行修饰，制备了一种具穿膜深渗透、抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药的抗肿瘤转移的纳米递药载体，其可以用作抗肿瘤药物的载体，减少抗癌药的用药量，提高治疗效率。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种精氨酸和熊果酸修饰的壳聚糖纳米递药载体，其化学结构如通式I所示：
通式I表示了可参与反应的壳聚糖分子，n为脱乙酰基的壳聚糖单体的摩尔数，m表示精氨酸直接接枝在壳聚糖上的摩尔数，n-k表示熊果酸在壳聚糖上的摩尔数或熊果酸的取代度，k-m表示未参与反应的脱乙酰基的壳聚糖单体摩尔数。通常随分子量和反应条件的不同，m、k-m、n-k代表不同的数值。n＝10～3105，k＝8～776，m＝3～3074。
优选的，所述纳米递药载体中，壳聚糖的分子量为1～500kDa，脱乙酰度为70～95％，熊果酸的修饰比例为1～25％，精氨酸的修饰比例为10～200％。
所述的精氨酸和熊果酸修饰的壳聚糖纳米递药载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备熊果酸溶液，加入NHS和EDC，搅拌均匀，逐滴加入到壳聚糖水溶液中，调节pH至4-7范围，室温反应，得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖；
(2)制备N-熊果酰基-壳聚糖的混悬水溶液，加入NHS、EDC和DMAP，搅拌均匀，逐滴加入精氨酸水溶液，调节pH至4-7范围，室温反应，制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，即为所述纳米递药载体。
优选的，步骤(1)中，所述熊果酸溶液为熊果酸溶于DMSO中，浓度为1-30mg/ml；所述熊果酸、NHS、EDC、壳聚糖的摩尔比为0.5～2∶1～2∶3～6∶1～3；所述壳聚糖分子量为1～500kDa，所述壳聚糖水溶液的浓度为1-30mg/ml；所述室温反应的时间为40-56h。
优选的，步骤(1)中，室温反应结束后，无水乙醇沉淀，抽滤，二氯甲烷、乙醇、水充分洗涤沉淀，冻干，即制得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖。
优选的，步骤(2)中，所述N-熊果酰基-壳聚糖的混悬水溶液的浓度为1～30mg/ml；所述精氨酸、NHS、DMAP、EDC的摩尔比为1∶1∶0.1∶3～5；所述精氨酸水溶液的浓度为1～300mg/ml，精氨酸与N-熊果酰基-壳聚糖的摩尔比为1～10∶1；所述室温反应的时间为40-56h。
优选的，步骤(2)中，室温反应结束后，透析，抽滤，滤液冻干，即制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖。
优选的，空白纳米胶束的制备方法包括：将0-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖溶于水中，溶液浓度0.1～50mg/ml，水浴超声后冻干即得目标产物，即O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束。
上述制备工艺，具有操作简便、工艺简单以及制造成本低廉等优点，可以通过改变投料比及反应时间来调整双亲性共聚物的取代度，进而改变纳米胶束的粒径，所形成的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束为规则球形，平均粒径在50-500nm。
本发明还提供了所述的精氨酸和熊果酸修饰的壳聚糖纳米递药载体作为抗肿瘤药物载体的应用。
优选的，所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素等。
优选的，应用方法包括将所述纳米递药载体溶解，制备胶束溶液，然后与含抗肿瘤药物的溶液混合，孵育，除去游离药物，即得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束。
本发明研究显示，O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束具有抑制P-gp逆转肿瘤多药耐药能力，且O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束具有显著的抗肿瘤活性。
本发明首次以精氨酸、熊果酸和壳聚糖为材料，合成两亲性胶束材料，制备一种具穿膜深渗透和抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药的紫杉醇纳米胶束，使药物以最小的损失到达作用部位，可以提高紫杉醇的药效，减少用量，是一种新型的剂型，是技术创新的结果。现有技术是直接采用熊果酸和紫杉醇联合用药，但是，紫杉醇是一种疏水性化合物，在水中溶解性较差，且为P-gp的底物，易受到P-gp的外排，很容易产生耐药，且肿瘤具有防御机制，周围组织盘根错节，药物很难深渗透进入肿瘤周围，难以进入肿瘤细胞。而在本发明中，我们合成一种新型两亲、具穿膜和抑制P-gp逆转多药耐药，同时具备抗肿瘤转移作用的壳聚糖衍生物——O-精氨酰基-N-熊果酰基壳聚糖胶束(O-arginine-N-ursolic-chitosan，OAUCS)，其中精氨酸可以模仿穿膜肽促进药物更好的进入肿瘤，熊果酸能起到抑制P-gp的外排作用，逆转肿瘤耐药的作用。纳米制剂有更好的组织渗透效果，还采用亲水的精氨酸来对壳聚糖进行修饰，亲水的精氨酸与疏水的熊果酸分别位于6-和2-C上，有利于高分子壳聚糖分子在水中的伸展，水溶性更好，且更稳定。富集精氨酸的壳聚糖不仅能改善壳聚糖的亲水性，还能携带药物，深渗透进入肿瘤细胞。精氨酸还能帮助水解出来的熊果酸成盐，增大熊果酸在肿瘤细胞处的溶解度，达到更好的效果。此外，一定浓度的精氨酸有利于阻止肿瘤的转移，熊果酸不仅能作为疏水性部分提高疏水药物的携载能力，还能起到抑制P-gp对药物的外排作用，逆转肿瘤耐药，减少抗肿瘤药物的用量。因此，精氨酸和熊果酸的修饰，能够达到协同增效，增加治疗的效果。
技术效果：与现有技术相比，本发明制备方法工艺简单，由于采用熊果酸、精氨酸对壳聚糖进行修饰，制备的纳米胶束载体不仅具有良好的穿膜深渗透、抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药、抗肿瘤转移的功能，还能够有效提高抗肿瘤药物的递送效率，而且载药量更高，水溶性更好，使药物能更有效地被传递到肿瘤细胞，该制剂可以增加肿瘤对药物的敏感性，抑制P-糖蛋白对药物的外排，逆转肿瘤耐药，抗肿瘤转移，减少抗癌药的用药量，增强抗癌效果，提高治疗效率。
附图说明
图1为O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的红外图谱。
图2为O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的核磁图谱。
图3为O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束透射电镜照片。
图4为OAUCS对MCF-7/PTX细胞的毒性实验结果。
图5为PTX-OAUCS对MCF-7/PTX细胞的毒性实验结果。
图6为各组对MCF-7/PTX细胞的凋亡水平的影响。
图7为各组对小鼠体内肿瘤的影响；其中图A为瘤体生长曲线；图B瘤体剥离后体积；图C为瘤体剥离后重量。
图8为罗丹明外排试验结果。
图9为OAUCS下调P-gp的表达。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步说明，以便全面了解本发明。
实施例1
称取熊果酸500mg溶于50ml二甲基亚砜中，加入适量0.125g NHS和0.58gEDC，搅拌均匀，逐滴加入1mg/ml的壳聚糖溶液(1％醋酸水∶二甲基亚砜体积比1∶1)中，调节pH至5.0范围，室温反应48h，1000ml无水乙醇沉淀，抽滤，30ml二氯甲烷、30ml乙醇、30ml水充分洗涤沉淀3次，冻干即制得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖；称取500mgII所示的N-熊果酰基-壳聚糖，混悬于水中，加入1gNHS、0.11gDMAP和4.7gEDC，搅拌均匀，加入精氨酸1.5g，调节pH至5.0，室温反应48h，透析，抽滤，滤液冻干即制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖；将100mg O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖溶于20ml水中，冰浴超声即得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束(OAUCS)。
O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为200w，工作2s停3s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取紫杉醇，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL紫杉醇的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的紫杉醇，收集上清液，得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束(PTX-OAUCS)。
利用HPLC测定载药胶束中紫杉醇的载药量和包封率。取紫杉醇载药胶束，用流动相稀释，色谱柱为Supersil ODS2 C18(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水(70∶30，v/v)，流速为1ml/min，检测波长为227nm，进样量为20μl。根据标准曲线计算载药胶束中药物浓度。
包封率＝(紫杉醇投药质量-未被包封的游离紫杉醇质量)/紫杉醇投药质量×100％
载药量＝胶束中的紫杉醇质量/胶束质量×100％。
经计算得到载药胶束的载药量为22.7％，包封率为84.6％。
制备空白胶束和载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，载药胶束的粒径为127.5±3.47nm，Zeta电位为23.2±3.21mV。
1.1傅里叶红外光谱分析(FTIR)
红外光谱用Nicolet 2000型傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)进行测定。测定的方法为：将约1～2mg上述制得的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖冻干样品加入到200mg左右经过研磨并干燥的KBr粉末中，充分混合后压片，置于红外光谱仪内扫描，扫描范围：4000cm-1～400cm-1，记录其红外光谱，如图1所示。
1.2核磁共振1H-NMR
上述制得的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖冻干样品溶于D2O或氘代DMSO，150MHz频率照射，在20℃下用Bruker(AVACE)AV-500型核磁共振仪(德国Bruker公司)记录图谱，如图2所示。
1.3熊果酰基与精氨酰基取代度的测定
1.3.1熊果酰基取代度的测定
用Elementar Vario EL III元素分析仪(德国Elementar公司)分别测定上述壳聚糖和熊果酰基壳聚糖的C、N、H元素质量百分比。
元素分析熊果酸的取代度，结果20.91％。
1.3.2精氨酰基取代度的测定
用Elementar Vario EL III元素分析仪(德国Elementar公司)分别测定上述壳聚糖、熊果酰基壳聚糖、O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的C、N、H元素质量百分比。
元素分析精氨酸的取代度为178％.
1.4透射电镜
取适量制得的载药纳米粒，蒸馏水稀释100倍，滴在铜网上，静置一段时间，用滤纸吸干，滴加2％磷钨酸溶液负染5～10min，自然挥发干，通过透射电子显微镜观察形态。结果如图3所示，镜下粒径＜200nm，为较圆整颗粒。
实施例2
称取熊果酸250mg溶于25ml二甲基亚砜中，加入适量0.125g NHS和0.58gEDC，搅拌均匀，逐滴加入1mg/ml的壳聚糖溶液(1％醋酸水∶二甲基亚砜体积比1∶1)中，调节pH至5.0范围，室温反应48h，1000ml无水乙醇沉淀，抽滤，30ml二氯甲烷、30ml乙醇、30ml水充分洗涤沉淀3次，冻干即制得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖；称取250mgII所示的N-熊果酰基-壳聚糖，混悬于水中，加入1gNHS、0.11gDMAP和4.5gEDC，搅拌均匀，加入精氨酸1.5g，调节pH至5.0，室温反应48h，透析，抽滤，滤液冻干即制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖；将100mgO-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖溶于20ml水中，冰浴超声即得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束。
O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为100w，工作2s停1s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取紫杉醇，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL紫杉醇的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的紫杉醇，收集上清液，得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束。
利用HPLC测定载药胶束中紫杉醇的载药量和包封率。取紫杉醇载药胶束，用流动相稀释，色谱柱为Supersil ODS2 C18(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水(70∶30，v/v)，流速为1ml/min，检测波长为227nm，进样量为20μl。根据标准曲线计算载药胶束中药物浓度。
包封率＝(紫杉醇投药质量-未被包封的游离紫杉醇质量)/紫杉醇投药质量×100％
载药量＝胶束中的紫杉醇质量/胶束质量×100％。
经计算得到载药胶束的载药量为21.8％，包封率为83.5％。
制备空白胶束和载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，载药胶束的粒径为129.2±3.20nm，Zeta电位为24.6±1.73mV。
实施例3：
1.MTT法检测OAUCS对MCF-7/PTX肿瘤细胞增殖能力的影响
MTT法检测将培养的细胞接种于96孔的培养板中，置于饱和湿度的CO2培养箱中继续培养24h(37℃、5％CO2)，弃去培养液，然后每孔加入DMEM培养液适量，对照组、BlankOAUCS组加入不含PTX的空白OAUCS胶束、阳性药组加入含3μM PTX、3μM PTX-OAUCS、6μMPTX-OAUCS、9μM PTX-OAUCS，分别加小牛血清。继续培养24h，制得受试细胞液。每孔加入MTT溶液，37℃孵育4h，吸去每孔中的培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡后采用酶联免疫反应检测仪测定各孔OD值，在一定波长下测定，调零孔只含有DMSO。所得各孔平均OD值按下述公式计算肿瘤细胞抑制率：
抑制率(％)＝(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％。
数据处理：将OD值输入Excel表，根据公式计算细胞抑制率，数据统计及处理均通过软件SPSS进行，计量资料组间比较采用Student′s t-检验，多组之间比较采用one-wayANOVA进行，p＜0.05表示具有统计学差异，p＜0.01表示具有显著的统计学差异。
结果显示：OAUCS不同浓度(1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、60mg/ml)作用后，1-30mg/ml，各浓度对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率无统计学差异；30mg/ml OAUCS作用后，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。OAUCS在0-20mg/ml范围对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率较低，无毒。后面考查PTX-OAUCS杀灭肿瘤作用时，选择20mg/ml以下的载体浓度，以排除药物载体对肿瘤的杀灭效应(如图4)。
2.OAUCS对MCF-7/PTX耐药性的逆转作用
取对数期生长的人乳腺癌耐紫杉醇细胞株(MCF-7/PTX)细胞，调整细胞密度，按每孔8×103个细胞接种于96孔板中，每孔加180μL细胞悬液，培养24h后，吸取培养基换液，PTX组和PTX-OAUCS组更换为100μL DMEM培养基，OAUCS组加入终浓度为1mg/ml OAUCS 100μL培养24h，后用不同浓度的PTX，其终浓度分别为0、1、5、25、125、250μg/mL，每孔总体积200μL；设对照孔为不加药物的；调零孔为不加细胞的培养液，每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中继续培养48h，各孔加入MTT(5mg/mL)10μL，继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μL摇床上摇10min，测定各孔OD570值，计算紫杉醇对MCF-7/PTX细胞增殖的抑制率及IC50值、耐药指数。另取PTX-OAUCS，采用与PTX组相同的PTX浓度和实验方法，计算抑制率及IC50值、耐药指数。
计算公式为：细胞生长抑制率(％)＝[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100％；采用SigmaPlot 10.0软件计算IC50值；耐药逆转倍数(RI)＝药物作用前细胞IC50/作用后细胞IC50。
结果如表1所示，OAUCS能增强PTX对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制作用，提高细胞对PTX的敏感性。该结果表明，OAUCS能降低MCF-7/PTX细胞对PTX的抗性。
表1各样品对MCF-7/PTX耐药性的逆转作用
样品
IC<sub>50</sub>(μM)
耐药逆转倍数
紫杉醇PTX
30.89
/
OAUCS
10.44
2.95
PTX-OAUCS
1.95
15.84
综上，OAUCS和PTX-OAUCS可以开发成逆转乳腺癌对紫杉醇耐药性的药物。
实施例4：OAUCS逆转MCF-7/PTX细胞对紫杉醇耐药的作用
1.MTT法检测PTX-OAUCS对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制
实验方法同实验例3。取对数期生长的人乳腺癌耐紫杉醇细胞株(MCF-7/PTX)细胞，调整细胞密度，按每孔8×103个细胞接种于96孔板中，每孔加180μL细胞悬液，培养24h后，加入不同浓度的PTX-OAUCS及PTX，每孔总体积200μL；设对照孔为不加药物的；调零孔为不加细胞的培养液，每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中继续培养48h，各孔加入MTT(5mg/mL)10μL，继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μL摇床上摇10min，测定各孔OD570值，计算肿瘤细胞抑制率。
结果显示：3μM PTX-OAUCS与单用PTX 3μM相比，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；6μM PTX-OAUCS与3μM PTX-OAUCS相比，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。表明PTX-OAUCS能明显的抑制MCF-7/PTX细胞的增殖(如图5)。
2.流式细胞术检测PTX-OAUCS促进MCF-7/PTX细胞的凋亡
将MCF-7与MCF-7/PTX细胞分为6组：对照组、3μM PTX组、6μM PTX组、3μM PTX-OAUCS组、6μM PTX-OAUCS组。取生长于对数期的细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×105个/ml，接种于六孔板内，即5×105个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将PTX或PTX-OAUCS稀释到需要的浓度加入六孔板内，培养箱继续培养48小时；准备好PBS磷酸盐缓冲液、吸管、不含EDTA的胰酶、流式管、BD凋亡试剂盒等备用；标记好流式管，将六孔板内旧培养基分别吸入相应的流式管内，用PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，加入0.5mL的不含EDTA的胰酶，消化充分后用旧培养基中和，将细胞放入相应标记的流式管内；离心，1000rmp，5min，弃上清，每管加入1mL PBS缓冲液，旋涡震荡器上轻微震荡后离心，2000rmp，10min，重复3次，弃掉上清；将10倍的Annexin V Binding Buffer稀释为1倍，每管内加入100μL，继续加入7-AAD和PE Annexin V，每管各2.5μL，避光30min，加入1倍的Annexin V Binding Buffer，200μL/孔；上机分析，实验本记录各组细胞凋亡率。
结果表明：3μM PTX-OAUCS与单用3μM PTX相比，MCF-7/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；3μM PTX-OAUCS与6μM PTX-OAUCS相比，MCF-7/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。表明PTX-OAUCS能明显促进MCF-7/PTX细胞的凋亡水平(如图6)。
实施例5：熊果酸逆转小鼠皮下移植瘤对紫杉醇耐药的作用
取生长于对数期的MCF-7/PTX细胞，用PBS重悬，将细胞调整为3×107个/mL，每只小鼠自腋下注射3×106个细胞，100μL/只。细胞注射10天后，将小鼠随机分组，分别进行给药，动物分为6组：对照组(每3天注射PBS 100μL)、空白载体OAUCS组(每3天注射OAUCS10mg/kg)、LPTX组(每3天注射PTX 10mg/kg)、低剂量LPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS10mg/kg)、中剂量MPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS 25mg/kg)、高剂量HPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS 50mg/kg)，LPTX、LPTX-OAUCS、MPTX-OAUCS和HPTX-OAUCS组注射剂量按药物PTX计，用药4周，剥离瘤体。
每3天通过游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算瘤体体积(V＝L×W2×0.5，L表示肿瘤的长度；W表示肿瘤的宽度)，记录数据，绘制成瘤体在小鼠体内的增长曲线。在最终药物施用3天后，取出肿瘤，天平称取剥离后瘤体重量，游标卡尺测量瘤体剥落后长和宽，记录数据，绘制成图。
结果表明：低剂量L-PTX-OAUCS组相对于L-PTX组，小鼠皮下的肿瘤生长较慢，差异具有统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，小鼠皮下的肿瘤生长较慢，差异具有统计学意义(P＜0.05)；瘤体剥落后，低剂量L-PTX-OAUCS组相对于L-PTX组，瘤体体积较小，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，瘤体体积下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；瘤体剥落后，高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，瘤体重量较轻，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明L-PTX-OAUCS作用相对于单用L-PTX作用能明显抑制肿瘤在小鼠体内的生长(如图7)。
实施例6：罗丹明外排试验测定P-gp的功能
1.P-gp的功能采用经典的方法：能将细胞染色的荧光染料罗丹明123(R123)来确定，罗丹明也是公认的、经典的P-gp的底物。有许多报道称，P-gp的功能显著地与罗丹明外排有关，和P-gp的抑制可导致染料保留。罗丹明可以是几乎完全包封于纳米胶束系统中。罗丹明对在细胞中的积累，用流式细胞仪检测。
R123-OAUCS的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为100w，工作2s停1s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取R123，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL R123的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，避光，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的R123，收集上清液，得R123-OAUCS。
取生长于对数期的MCF-7/PTX细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×105个/ml，接种于六孔板内，即5×105个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将罗丹明溶液和R123-OAUCS加入以培养基，都含5μg/mL的罗丹明于37℃孵育2h，对照组为DMEM培养基。弃去上清，加入200μlPBS洗涤3次，胰酶消化，加入500μL预冷PBS重悬细胞，于流式细胞仪检测，激发波长480nm，发射波长540～660nm，细胞内罗丹明浓度以荧光强度平均值表示。
罗丹明123(R123)为经典的P-gp底物，受到P-gp的外排，且自身带有荧光，可以通过细胞内荧光的强弱反映受P-gp外排的强弱。OAUCS对罗丹明受P-gp外排的影响，如图8所示，从图中可以看出R123单独与细胞孵育2h，进入细胞内的R123非常少，而将R123制成R123-OAUCS胶束，进入到细胞中R123大大增加，胞内R123荧光强度增加，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；表明OAUCS确实可以起到抑制P-gp对R123的外排作用。
2.Western blot检测P-gp的表达
取生长于对数期的细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×105个/ml，接种于六孔板内，即5×105个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将对照组、低剂量OAUCS组(L-OAUCS，0.1mg/ml)、中剂量OAUCS组(M-OAUCS，1mg/ml)、高剂量OAUCS组(H-OAUCS，10mg/ml)组稀释到需要的浓度加入六孔板内，200μL，培养箱继续培养48小时。取经不同浓度OAUCS孵育处理的MCF-7/PTX细胞，提取总蛋白，BCA法定量蛋白量，上样电泳，凝胶上蛋白转至PVDF膜，室温封闭1h，加一抗(P-gp一抗，β-actine一抗)，4℃孵育过夜，将PVDF膜置于GST兔二抗孵育，洗3次后显影，检测并记录P-gp的表达。
采用OAUCS与MCF-7/PTX细胞孵育48h，用Western blot检测P-gp的表达，OAUCS对P-gp表达的影响结果如图9所示，低剂量L-OAUCS组相对于对照组，P-gp的表达下降显著，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-OAUCS组相对于低剂量L-OAUCS组，P-gp的表达下降显著，差异具有极显著统计学意义(P＜0.001)。随着OAUCS浓度增加，MCF-7/PTX细胞P-gp的表达逐渐下降，表明OAUCS可以下调P-gp的表达。
实施例7：
MTT法测定细胞的粘附情况
10g/L BSA；25mg/L Matrigel 50μl/孔分别加入96孔培养板，风干过夜，BSA为对照基底。每孔加入50μl含0.1％BSA的无血清培养液37℃1h水化基底膜。取常规传代培养或与不同浓度的的OAUCS(1mg/ml、10mg/ml)共孵育有48h的MCF-7细胞，经消化洗涤后，以0.1％BSA-1％新生牛血清的RPMI1640调细胞密度为1×105个/ml，分别将100μl细胞悬液加入96孔板，每组平行4个样本。常规培养1h，吸弃培养液，PBS冲洗除去未粘附细胞，每孔加MTT溶液20μl，CO2培养箱温育4h，弃MTT液，每孔加入150μl DMSO，酶标光度计490nm波长测量各孔吸光度(OD值)。计算细胞在人工基底膜Matrigel上的粘附率和粘附抑制率。
计算公式为：粘附率(％)＝[(Matrigel组细胞OD值/BSA组细胞OD值)-1]×100％。粘付抑制率(％)＝[1-(用药组细胞粘附率/未用药组细胞粘附率)]×100％。
表2 OAUCS处理的MCF-7/PTX细胞在Matrigel上的粘附
OAUCS(mg/ml)
粘附率(％)
粘附抑制率(％)
0
66.42±5.42
/
1
43.95±5.11*
33.83
10
29.17±4.79**
56.08
经OAUCS处理的各组与对照组比较t检验(*P＜0.05；**P＜0.01)
粘附是癌细胞侵袭、转移的始动步骤，抑制肿瘤细胞粘附，可以防止肿瘤细胞转移。实验结果表明：OAUCS不同浓度(1mg/ml、10mg/ml)对MCF-7/PTX细胞的粘附抑制作用明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。表明1mg/ml和10mg/ml OAUCS能抑制MCF-7/PTX肿瘤细胞的粘附作用，防止肿瘤细胞转移。
综上所述：本发明是一种新型具穿膜深渗透、抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药的抗肿瘤转移的纳米递药载体，包封率、载药量高，本发明的药物载体，细胞毒性实验、细胞摄取和外排实验、粘附实验表明本发明中的新型载药系统有更好的细胞穿膜摄取效果、P-gp的抑制作用和抑制粘附抗转移作用，作用显著优于对照组实验组，小鼠皮下移植瘤实验表明，该制剂有更好的抗癌作用，达到了更好的治疗效果。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
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