一种同位素标记的n-(1,3-二甲基丁基)-n`-苯基对苯醌的制备方法
阅读说明：本技术 一种同位素标记的n-(1,3-二甲基丁基)-n`-苯基对苯醌的制备方法 (Preparation method of isotope-labeled N- (1, 3-dimethylbutyl) -N' -phenyl p-benzoquinone ) 是由 蔡宗苇 曹国栋 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的制备方法。方法包括步骤：对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应,得到氘代的对苯醌-2-苯胺；所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应,得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。本发明采用对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺和1,3-二甲基丁胺的连续氧化加成反应,实现了简单、高效、且可以在较为温和的条件下制备同位素D标记的6ppd-醌。本方法制备的同位素D标记的6ppd-醌作为标准品可广泛地用于环境样品的含量检测及细胞和动物毒理实验等相关研究中。(The invention discloses a preparation method of isotope-labeled N- (1, 3-dimethylbutyl) -N' -phenyl-p-benzoquinone. The method comprises the following steps: p-benzoquinone reacts with aniline with all deuterated benzene ring hydrogen protons to obtain deuterated p-benzoquinone-2-aniline; and reacting the deuterated p-benzoquinone-2-aniline with 1, 3-dimethylbutylamine to obtain N- (1, 3-dimethylbutyl) -N' -phenyl-p-benzoquinone marked by isotope D. The invention adopts the continuous oxidation addition reaction of p-benzoquinone, aniline with all deuterated hydrogen protons of a benzene ring and 1, 3-dimethylbutylamine, realizes the simple and efficient preparation of isotope D-labeled 6 ppd-quinone under the mild condition. The isotope D-labeled 6 ppd-quinone prepared by the method can be widely used for content detection of environmental samples and related researches such as cell and animal toxicology experiments and the like as a standard substance.)
技术领域
本发明涉及环境分析领域，尤其涉及一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌(6ppd-醌)的制备方法。
背景技术
6ppd，即N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯二胺，CAS号为793-24-8，是化工产业中一种常用的橡胶抗老化剂。该化合物因具有较好的抗氧化和抗臭氧特性，目前被广泛地应用于橡胶产业用来提高轮胎的抗高温疲劳与抗屈挠性能。据统计，每辆家用小轿车的轮胎中约含有140-700克的6ppd；而一辆重型卡车轮胎中的6ppd含量可高达3600-18000克。随着轮胎的磨损和老化，6ppd会随着轮胎碎屑进入到环境中。现有研究表明在不同的环境介质中，包括土壤、湖泊、城市径流和大气粉尘中均有不同浓度6ppd的存在。然而由于6ppd的生物毒性较低，长期以来其在自然界的广泛存在并未引起足够的重视。
2021年1月，有Science的文章指出，6ppd在自然环境中经光照及臭氧催化产生氧化产物N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌，即6ppd-醌，具有极强的生物毒性；该化合物的产生机理和分子结构式如图1所示。该研究证实6ppd-醌会随着雨水冲刷进入到城市径流，并引起太平洋西海岸等多个地区洄游产卵银鲑鱼的大量死亡。通过对比数据显示，6ppd-醌对银鲑鱼的半数致死量为0.8-1.5μg/L，远低于其母体6ppd的半数致死量(250±60μg/L)。此外研究发现6ppd-醌具有较高的化学稳定性，即使在长时间的高温加热条件下(80℃，72小时)，其生物毒性也没有明显降低。
上述现象引起了世界各个国家的环境及毒理学家的广泛关注。可以预见的是，今后几年有关6ppd-醌在不同环境介质中的含量测定、生物毒性检测以及人体健康风险评估将成为研究热点。然而无论是对于环境样品6ppd-醌的含量测定，亦或是针对细胞和动物实验的毒性机理研究，均需制备或购买同位素标记的6ppd-醌分析标准品，从而极大程度地降低样品测定时的背景干扰、减少基质效应，并用于毒理研究的同位素示踪等相关实验中。然而目前缺乏简便、高效可用于制备同位素标记的6ppd-醌的方法。在上述Science的文章中，其作者利用紫外光照射以及通入臭氧的方式催化工业级的6ppd粉末，使得部分6ppd转化为6ppd-醌，随后利用酸洗和多次柱分离技术(包括离子交换色谱、C18固相萃取柱和制备型高效液相)分离纯化得到6ppd-醌标准品。该方法同样也可用于制备同位素标记的6ppd-醌，但是具有转化效率低、成本高以及对环境不友好等缺点，不适用于工业化生产。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌(6ppd-醌)的制备方法，旨在解决现有缺乏简单高效地制备同位素标记的6ppd-醌标准品的方法的问题。
本发明的技术方案如下：
一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的制备方法，其中，包括步骤：
对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺；
所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
可选地，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺在水溶剂中进行反应。
可选地，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应的温度为50-60℃，反应的时间为20-40分钟。
可选地，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应。
可选地，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺在甲醇水溶液或乙醇水溶液中进行反应，所述甲醇占甲醇水溶液的体积分数为90％-100％，所述乙醇占乙醇水溶液的体积分数为90％-100％。
可选地，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应的温度为室温，反应的时间为3.5-4.5h。
可选地，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应。
可选地，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺的反应结束之后，还包括步骤：将反应后的体系进行硅胶柱层析分离或重结晶处理，得到所述同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
可选地，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺的步骤具体包括：
将对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺溶解于水溶剂中，得到第一反应溶液；
在所述第一反应溶液中加入酸至pH在6.5-7.0之间，进行反应，得到所述氘代的对苯醌-2-苯胺；
和/或，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的步骤具体包括：
将氘代的对苯醌-2-苯胺溶解于甲醇水溶液或乙醇水溶液中，然后加入酸至pH在6.5-7.0之间，得到第二反应溶液；
在所述第二反应溶液中加入1,3-二甲基丁胺，进行反应，得到所述同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的制备方法，其中，包括步骤：
氢质子全部氘代的对苯醌与苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺；
所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
有益效果：本发明采用对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺和1,3-二甲基丁胺的连续氧化加成反应，实现了简单、高效、且可以在较为温和的条件下制备同位素D标记的6ppd-醌(即氘代的6ppd-醌)。相比于传统的臭氧催化法，本发明方法具有更高的转化效率、更好的经济适用性以及对环境友好等优点，适用于工业生产和技术转化。本发明方法制备的同位素D标记的6ppd-醌作为标准品可广泛地用于环境样品的含量检测及细胞和动物毒理实验等相关研究中。
附图说明
图1为环境中的6ppd经光照和臭氧氧化生成6ppd-醌的示意图。
图2为本发明实施例提供的同位素D标记的6ppd-醌的制备路线示意图。
图3为本发明具体的实施例中氘代的对苯醌-2-苯胺(上)和氘代的6ppd-醌(下)的液相色谱图。
图4为本发明具体的实施例中氘代的对苯醌-2-苯胺(上)和氘代的6ppd-醌(下)的质谱二级碎片图谱。
具体实施方式
本发明提供一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌(6ppd-醌)的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌(6ppd-醌)是轮胎抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯二胺(6ppd)经臭氧和光照催化所产生的氧化产物，该物质会随着轮胎的磨损和老化进入并滞留在各种环境介质中。最近研究发现，环境中的6ppd-醌具有较高的生物毒性，其存在可引起太平洋西海岸等多个地区洄游产卵银鲑鱼大量死亡。然而目前缺乏简单高效地制备同位素标记的6ppd-醌标准品的方法，极大程度上限制了该化合物的广泛研究。
基于此，本发明实施例提供一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的制备方法，其中，包括步骤：
S1、对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺；
S2、所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到氘代的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
本实施例提供一种简便、高效的制备同位素标记的6ppd-醌的方法。其采用对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺和1,3-二甲基丁胺的连续氧化加成反应制备同位素D标记的6ppd-醌，具体制备路线如图2所示：首先对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺发生氧化加成反应，生成同位素标记的对苯醌-2-苯胺；然后该物质无需纯化，即可与1,3-二甲基丁胺发生氧化加成反应，生成所述同位素D标记的6ppd-醌。该制备步骤简单、反应条件温和、且易于操作，具有较高的经济性和适用性，同时具有高的转化效率、对环境友好等优点。以此方法制备的同位素D标记的6ppd-醌标准品可广泛地用于环境样品的含量测定以及细胞和动物毒理实验等相关研究中。
步骤S1中，在一种实施方式中，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺在水溶剂中进行反应。以水作为反应溶剂，使得本实施例制备方法具有较高的经济性和适用性。
在一种实施方式中，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应的温度为50-60℃(如55℃)，反应的时间为20-40分钟(如30分钟)。
在一种实施方式中，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应，如按摩尔比2:1进行反应。
在一种实施方式中，所述对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺的步骤具体包括：
将对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺溶解于水溶剂中，得到第一反应溶液；
在所述第一反应溶液中加入酸(如冰醋酸、盐酸等)至pH在6.5-7.0之间，进行反应，得到所述氘代的对苯醌-2-苯胺。
因为苯环氢质子全部氘代的苯胺具有较强的亲核性，其与对苯醌反应的活性较高，若不控制则生成苯醌与胺类物质多取代的副产物；本实施例通过加入特定比例的酸来调节反应的pH并改变苯环氢质子全部氘代的苯胺的亲核性，从而起到控制反应速率，减少副反应，提高产率的效果。
步骤S2中，在一种实施方式中，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺在甲醇水溶液或乙醇水溶液中进行反应。以甲醇水溶液或乙醇水溶液作为反应溶剂，进一步确保了本实施例制备方法的经济性和适用性。
在一种实施方式中，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应的温度为室温(指的是16-25℃)，反应的时间为3.5-4.5h(如4h)。
在一种实施方式中，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应，如按摩尔比2:1进行反应。
在一种实施方式中，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺的反应结束之后，还包括步骤：将反应后的体系进行硅胶柱层析分离或重结晶处理，得到所述同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
在一种实施方式中，所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的步骤具体包括：
将氘代的对苯醌-2-苯胺溶解于甲醇水溶液或乙醇水溶液中，然后加入酸(如冰醋酸、盐酸等)至pH在6.5-7.0之间，得到第二反应溶液；
在所述第二反应溶液中加入1,3-二甲基丁胺，进行反应，得到所述同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。
具体因为1,3-二甲基丁胺具有较强的亲核性，其与氘代的对苯醌-2-苯胺反应的活性较高，若不控制则生成对苯醌与胺类物质多取代的副产物；本实施例通过加入特定比例的酸来调节反应的pH并改变1,3-二甲基丁胺物质的亲核性，从而起到控制反应速率，减少副反应，提高产率的效果。
本实施例利用对苯醌与氘代的苯胺和1,3-丁二胺的连续氧化加成反应，实现了简单、高效、且可以在较为温和的条件下制备氘代的6ppd-醌。另外，本实施例对反应物料比和所用溶剂进行了优化，并且利用加入特定比例的冰醋酸来调节及控制反应的pH，从而抑制副反应的发生，并提高了反应收率。相比于传统的臭氧催化法，本实施例方法具有更高的转化效率、更好的经济适用性以及对环境友好等优点，适用于工业生产和技术转化。
本发明实施例还提供一种同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌的制备方法，其中，包括步骤：
S1’、氢质子全部氘代的对苯醌与苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺；
S2’、所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌；
上述反应路线如下所示：
本实施例提供一种简便、高效的制备氘代的6ppd-醌的方法。其采用氘代的对苯醌与苯胺和1,3-二甲基丁胺的连续氧化加成反应制备氘代的6ppd-醌，具体制备路线：首先氘代的对苯醌与苯胺发生氧化加成反应，生成氘代的N-(1,3-二甲基丁基)-对苯醌；然后该物质无需纯化，即可与1,3-二甲基丁胺发生氧化加成反应，生成所述氘代的6ppd-醌。该制备步骤简单、反应条件温和、且易于操作，具有较高的经济性和适用性。以此方法制备的氘代的6ppd-醌标准品可广泛地用于环境样品的含量测定以及细胞和动物毒理实验等相关研究中。
本实施例与上述实施例方法相比，主要不同之处：对苯醌与苯胺在反应中的投料比。考虑到反应中对苯醌与苯胺的投料摩尔比为2：1，且目前市售的同位素标记的对苯醌较为高昂的价格，上述实施例方法具备更高的经济适用性。
在一种实施方式中，所述氢质子全部氘代的对苯醌与苯胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应，如按摩尔比2:1进行反应；
所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺按摩尔比(2-2.4):1进行反应，如按摩尔比2:1进行反应。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
本实施例同位素标记的6ppd-醌的制备步骤如下：
1.氘代对苯醌-2-苯胺的制备
在100毫升的圆底反应烧瓶里加入1.08克的对苯醌(10mmol)和50毫升的去离子水，随后将反应烧瓶置于55℃的水浴锅中匀速搅拌，直至原料完全溶解，得到对苯醌水溶液。将456微升的氘代苯胺(5mmol)溶于15毫升水中，然后逐滴滴加至对苯醌水溶液中，滴加时长为5分钟。随后在反应溶液中加入100微升的冰乙酸，调整反应液的pH为7.0。反应保持在55℃匀速搅拌30分钟。反应结束后，将反应溶液抽滤，并用55℃热水和体积分数10％的乙醇水溶液对所得固体进行洗涤。产物烘干得到1.87克(9.15mmol)红棕色氘代对苯醌-2-苯胺粉末，产率为92％。
产物经核磁共振检测，数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):6.72(dd,J＝10.0,2.8Hz,1H),6.19(d,J＝2.8Hz,1H)；13C NMR(400MHz,CDCl3):δ186.7,183.8,143.1,139.8,137.2,132.5,101.1。红外光谱数据如下：3234,1676,1632,1583,1560,1492,1440,1279,865,555cm–1。高分辨电喷雾质谱正离子模式下，氢质子化的氘代苯醌-2-苯胺[C12H5D5NO2]+的理论值为205.1015，实测值为205.1020。
2.氘代6ppd-醌的制备
称取408毫克的氘代对苯醌-2-苯胺(2mmol)置于25毫升圆底烧瓶中，加入10毫升95％甲醇水溶液，室温匀速搅拌直至固体完全溶解，得到氘代对苯醌-2-苯胺溶液。随后在氘代对苯醌-2-苯胺溶液中加入80微升的冰乙酸，调整其pH为6.5。随后将101毫克的1,3-二甲基丁胺(1mmol)溶于5毫升甲醇中，逐滴滴加至氘代对苯醌-2-苯胺溶液中。反应液在室温下维持匀速搅拌，并用薄层硅胶色谱监测反应进程。四个小时后反应结束，将反应溶剂减压蒸馏，所得粗产物过硅胶柱，用正己烷-二氯甲烷洗脱剂(v:v＝1:1)洗脱。将洗脱剂蒸出得444毫克同位素标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌，即6ppd-醌，其产率为73％。
产物经核磁共振检测，数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.23(s,1H),6.39(d,J＝8.0Hz,1H),5.97(s,1H),5.43(s,1H),3.55(m,1H),1.67(m,1H),1.53(m,1H),1.38(m,1H),1.22(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝6.4Hz,3H),0.91(d,J＝6.4Hz,3H)；13C NMR(400MHz,CDCl3):δ180.1,178.5,149.6,147.7,137.2,95.7,92.8,46.8,45.6,25.2,22.7,20.2。红外光谱数据如下：3268,3232,2959,1641,1574,1552,1483,1358,1288,1266,834,816,555,464cm–1。高分辨电喷雾质谱正离子模式下，氢质子化的氘代6ppd-醌[C18H18D5N2O2]+的理论值为304.2068,实测值为304.2061。
3.高效液相-高分辨质谱联用对氘代6ppd-醌和氘代对苯醌-2-苯胺的表征
对上述反应中制得的氘代6ppd-醌以及中间产物氘代对苯醌-2-苯胺，采用超高效液相-高分辨质谱联用进行了表征。所用色谱柱为ACQUITY HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱，流速为0.3毫升/分钟；流动相为体积分数0.1％的甲酸/水(A相)和体积分数0.1％的乙腈(B相)。流动相梯度为：0-1分钟，2％B；1-19分钟，2％B-100％B；19-21分钟，100％B；21-21.1分钟，100％B-12％B；21.1-25分钟，2％B。其结果如图3所示，氘代对苯醌-2-苯胺和氘代6ppd-醌的出峰时间分别为11.04和15.74分钟，二者的出峰时间与其分子极性大小一致。此外，利用配备了电喷雾离子源的高分辨质谱对氘代6ppd-醌和氘代对苯醌-2-苯胺的二级质谱碎片进行了表征。其模式为正离子模式，碰撞能量为10，20，40eV叠加。图4展示了氘代6ppd-醌和氘代对苯醌-2-苯胺的二级碎片和对应的结构归属。其中304.2061.1747和205.1015分别对应氘代6ppd-醌和氘代对苯醌-2-苯胺的母离子峰，其分子式为[C12H5D5NO2]+和[C12H5 D5NO2]+。氘代对苯醌-2-苯胺的特征离子碎片为188.0988、177.1067、149.1118、119.0791和99.0740；而氘代6ppd-醌的特征离子碎片为261.1515、246.1280、220.1125、192.1176和177.1068。上述结果证实了氘代对苯醌-2-苯胺和氘代6ppd-醌的成功制备，也证实了上述制备路线的可行性。
综上所述，本发明提供一种简便、高效的制备同位素标记的6ppd-醌的方法。具体制备路线：对苯醌与苯环氢质子全部氘代的苯胺进行反应，得到氘代的对苯醌-2-苯胺；所述氘代的对苯醌-2-苯胺与1,3-二甲基丁胺进行反应，得到同位素D标记的N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯醌。该制备步骤简单、反应条件温和、且易于操作。所用的反应溶剂可以分别为水和甲醇水溶液/乙醇水溶液，具有较高的经济性和适用性。以此方法制备的同位素标记的6ppd-醌标准品可广泛地用于环境样品的含量测定以及细胞和动物毒理实验等相关研究中。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。