一种木麻黄鞣宁的制备方法及其降糖用途
阅读说明：本技术 一种木麻黄鞣宁的制备方法及其降糖用途 (Preparation method and blood sugar reducing application of casuarina equisetifolia tannate ) 是由 陈卫 徐阳 艾哈迈德·K·拉什旺 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种木麻黄鞣宁的制备方法及其降糖用途,该制备方法包括醇提浓缩、乙酸乙酯萃取、高压制备液相色谱纯化及高速逆流色谱分离,通过将高压制备液相色谱与高速逆流色谱结合,再通过对工艺参数的优化,从物质组成复杂的地稔原料中分离制备得到高纯度的木麻黄鞣宁单体；经活性试验发现,该木麻黄鞣宁单体能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性,可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂,控制餐后血糖水平。(The invention discloses a preparation method of casuarina equisetifolia tannin and a hypoglycemic application thereof, wherein the preparation method comprises alcohol extraction concentration, ethyl acetate extraction, high-pressure preparation liquid chromatography purification and high-speed countercurrent chromatography separation, and a high-purity casuarina equisetifolia tannin monomer is obtained by separating and preparing a herba melastomae dodecandri raw material with complex composition of substances by combining the high-pressure preparation liquid chromatography with the high-speed countercurrent chromatography and optimizing process parameters; activity tests show that the casuarina tannine monomer can obviously inhibit the activity of alpha-glucosidase, and can be used for preparing an alpha-glucosidase inhibitor and controlling the postprandial blood sugar level.)
技术领域
本发明涉及天然产物的分离纯化与降糖用途领域，具体涉及木麻黄鞣宁的制备方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
背景技术
糖尿病是世界范围内常见的慢性疾病之一，糖尿病患者通常伴随着高血糖症状，长期的高血糖能够引起神经、心脏、血管和肾脏等组织器官的损害，并引起多种急慢性并发症的发生。据世界卫生组织(WHO)统计数据显示，2014年全球有4.22亿的糖尿病患者，其中2型糖尿病最为常见。近年来随着人们饮食习惯、生活方式的改变及老龄化进程的加速，我国糖尿病的患病率急速上升，至2016年底我国的糖尿病患者数量已达到1.1亿。因此，有关糖尿病防治的研究有着极为重要的意义。
α-葡萄糖苷酶(alpha-D-glucoside glucohydrolase,EC 3.2.1.20)又称为α-D-葡萄糖苷酶水解酶，是糖苷水解酶GH31家族中的膜结合酶，包括蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶等，主要存在于小肠绒毛粘膜刷状缘细胞中。进食后，α-葡萄糖苷酶可以将食物中的碳水化合物水解为葡萄糖，葡萄糖被吸收后进入血液循环导致血糖升高，因此，α-葡萄糖苷酶是控制餐后血糖的主要靶酶之一。目前，国内上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，使用这些抑制剂通常会引起胃肠道的不良反应，如腹胀、排气等。因此，挖掘安全有效的食品功能因子，靶向抑制α-葡萄糖苷酶活性，对于降低糖尿病的发病率及改善糖尿病患者的健康状况将是一个行之有效的策略。当前国内外大量的研究人员已聚焦于食源性功能因子，试图从食物中筛选出活性优良且不会对人体造成副反应的α-葡萄糖苷酶抑制剂。目前，已有报道，食源性来源的黄酮类化合物、生物碱、酚类化合物、姜黄素类化合物、萜类化合物在体外具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且活性优于阳性药物阿卡波糖，但有关地稔提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲜有报道。
地稔(Melastoma dodecandrum Lour.)为野牡丹科植物，又名地菍、地葡萄、金头石榴、铺地锦、地茄等，为畲族民间常用药，收载于2015年版《浙江省中药炮制规范》。地稔是2015年版《中国药典》收载的紫地宁血散、宫炎平滴丸和宫炎平片这3种中成药处方的主要药材之一。地稔产于我国南方，主要分布于长江以南的江西、福建、浙江等省区海拔1300m以下的山坡草丛和树林下，喜酸性土壤，生命力极强，具有耐寒、耐旱、生长迅速等特点。地稔是一种兼具观赏、药用和食用的植物。全草药用，味甘、涩、性凉，具有清热解毒、活血止血等功效，临床上应用于流行性脑脊髓膜炎、痔疮、盆腔炎、子宫出血等病症。专利发明人通过大量研究首次发现地稔提取物具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，进一步通过活性介导的分离纯化策略从地稔提取物中筛选到一个具有显著α-葡萄糖苷酶抑制活性的天然产物木麻黄鞣宁。目前有关木麻黄鞣宁的制备方法及其α-葡萄糖苷酶抑制活性与降糖用途均未被报道。
发明内容
本发明公开了一种木麻黄鞣宁的制备方法及其降糖用途，采用该方法制备的木麻黄鞣宁能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后血糖。
具体技术方案如下：
一种木麻黄鞣宁的制备方法，包括如下步骤：
(1)粗提：以新鲜地稔果实为原料，经醇提浓缩、乙酸乙酯萃取后得到地稔乙酸乙酯提取物粉末；
(2)高压制备液相色谱分离：将所述地稔乙酸乙酯提取物粉末溶解后注入高压制备液相色谱中，采用C18色谱柱，经流动相进行梯度洗脱，再经后处理得到木麻黄鞣宁提取物冻干粉；
所述流动相：A相为纯乙腈，B相为甲酸体积百分浓度为1.5～5％的甲酸-水体系；
所述梯度洗脱的程序为：A相的体积百分浓度在0～5min内保持5％不变，在5～30min内从5％上升至60％，收集24～26min的洗脱物；
(3)高速逆流色谱分离：以乙酸乙酯-水-三氟乙酸为两相溶剂体系，将所述木麻黄鞣宁提取物冻干粉用流动相溶解后注入高速逆流色谱分离，经分离、冻干后得到木麻黄鞣宁粉末；
所述乙酸乙酯、水和三氟乙酸的体积比为1：1：0.01～0.1；
如无特别说明，本发明中出现的所有原料的百分比均为体积百分浓度。
步骤(1)中，所述醇提浓缩，具体为：
将洗净的地稔果实与酸性乙醇溶液混合，超声提取完全后过滤并收集滤液，滤液在40～50℃下真空旋转蒸发除去乙醇并浓缩，得到地稔粗提液；
所述酸性乙醇溶液为酸的体积百分浓度为0.1～1.5％的乙醇溶液；
所述酸选自盐酸、甲酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；
所述乙醇溶液的体积百分浓度为50～95％；
所述地稔与酸性乙醇溶液的质量体积比(即料液比)为1：5～12g/mL。
优选地，所述超声提取时间为60～240min，该过程在25～49℃下、避光条件下进行。
为保证地稔提取完全，将首次提取后得到的滤渣再按照相同条件重复提取若干次。
进一步优选，所述乙醇溶液的体积百分浓度为60～70％，地稔与酸性乙醇的质量体积比为1：8g/mL。
步骤(1)中，所述有机溶剂萃取，以乙酸乙酯作为萃取剂，萃取3～5次，收集乙酸乙酯相，在40～50℃下真空旋转蒸发，氮吹，得到地稔乙酸乙酯提取物粉末。
步骤(2)中，所述高压制备液相色谱分离，具体为：
先将所述地稔乙酸乙酯提取物粉末经DMSO复溶后，再注入高压制备液相色谱仪中进行纯化；
所述复溶后的浓度为10～60mg/mL，进样量为1～3mL；
所述C18色谱柱的规格为20mm×250mm，温度为25～30℃；
步骤(3)中，所述高速逆流色谱分离，具体为：
配制所述两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，以20～30mL/min的流速将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，在25～35℃、主机转速为700～1000r/min的条件下，以1～8mL/min的流速泵入所述流动相，待两相达到平衡后，将所述木麻黄鞣宁提取物冻干粉用流动相溶解后进样，经液相检测后，收集包含目标产物的流出液，再经减压浓缩得到木麻黄鞣宁浓缩液。
优选地，所述两相溶剂系统中，乙酸乙酯、水和三氟乙酸的体积比为1：1：0.01；
以20～30mL/min的流速将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，在25～35℃、主机转速为850～950r/min的条件下，以3～4mL/min的流速泵入所述流动相；
所述木麻黄鞣宁提取物冻干粉用流动相溶解后的浓度为10～30mg/mL，进样体积为1～15mL。
经上述制备工艺优化后，分离纯化得到的木麻黄鞣宁单体的纯度高达98％。
经进一步的活性试验发现，分离纯化得到的木麻黄鞣宁单体对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果，IC50值为0.22μM，明显优于阳性药物阿卡波糖(IC50＝0.52mM)，可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次将高速逆流色谱与高压制备液相色谱技术相结合，再通过对工艺参数的优化，从地稔果实中分离制备得到高纯度的木麻黄鞣宁单体，其纯度最高可达98％；该分离方法具有样品处理量大、重复性好等优点，可大量制备得到高纯度的木麻黄鞣宁，使之能够实现工业化生产；经进一步活性试验发现，该木麻黄鞣宁能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可用于降低餐后血糖，目前尚未有研究报道木麻黄鞣宁的制备方法及其α-葡萄糖苷酶抑制活性与降糖用途。
附图说明
图1为实施例1中地稔乙酸乙酯提取物的液相色谱图；
图2为实施例1中经制备液相色谱纯化后木麻黄鞣宁的液相色谱图；
图3为实施例1中经高速逆流色谱纯化后木麻黄鞣宁的高效液相色谱图；
图4为实施例1中木麻黄鞣宁的质图谱及其碎裂方式；
图5对比例1中最终产物木麻黄鞣宁的高效液相色谱图；
图6为实施例1制备的地稔乙酸乙酯提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线；
图7为实施例1制备的木麻黄鞣宁的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
将1kg地稔洗净，按料液比1：8(w/v，g/mL)加入含0.1％(v/v)盐酸的70％(乙醇与水的体积比为70：30)的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为70：30)，在40℃下避光超声提取60min，之后真空抽滤，滤渣重复提取一次，滤液合并，并在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到地稔提取物粗提液。
将地稔提取物粗提液加入相同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，收集乙酸乙酯相，之后在45℃下真空旋转蒸发浓缩，氮吹，得到地稔乙酸乙酯提取物粉末，地稔乙酸乙酯提取物粉末的液相色谱图如图1所示。
使用制备液相柱Unitary C18 20mm×250mm，将地稔乙酸乙酯提取物粉末用DMSO溶解，使其浓度达到20mg/mL，注入制备型液相色谱中，进样量4mL，流动相：A相：纯乙腈，B相：甲酸(5％)：水(95％)；柱温为30℃，流速为10mL/min，梯度为：5％的A相0～5min，5％～60％A相5～30min。将地稔乙酸乙酯提取物注入制备液相中分离，单次进样量为4mL。在紫外检测器下检测，收集24～26min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到木麻黄鞣宁提取物冻干粉，木麻黄鞣宁提取物冻干粉的液相色谱图如图2所示。
将乙酸乙酯、水和三氟乙酸，按体积比为1：1：0.01的比例置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为25℃，将固定相以30mL/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至900r/min。转速稳定后，以3mL/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将200mg木麻黄鞣宁提取物冻干粉溶于15mL流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度的木麻黄鞣宁，其液相色谱图如图3所示。
通过对比图1～3的高效液相色谱图可知，地稔经过提取浓缩、乙酸乙酯萃取及高压制备液相色谱纯化后，得到的木麻黄鞣宁冻干粉主要以木麻黄鞣宁为主，含有少量其他杂质，进一步经过高速逆流色谱纯化，可以得到木麻黄鞣宁单体，且纯度为99.07％。
实施例2
将5kg地稔洗净，按料液比1：8(w/v，g/mL)加入含0.1％(v/v)盐酸的70％(乙醇与水的体积比为70：30)的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为70：30)，在40℃下避光超声提取60min，之后真空抽滤，滤渣重复提取一次，滤液合并，并在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到地稔提取物粗提液。
将地稔提取物粗提液加入相同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，收集乙酸乙酯相，之后在45℃下真空旋转蒸发浓缩，氮吹，得到地稔乙酸乙酯提取物粉末。
使用制备液相柱Unitary C18 20mm×250mm，将地稔乙酸乙酯提取物粉末用DMSO溶解，使其浓度达到40mg/mL，注入制备型液相色谱中，进样量4mL，流动相：A相：纯乙腈，B相：甲酸(5％)：水(95％)；柱温为30℃，流速为10mL/min，梯度为：5％的A相0～5min，5％～60％A相5～30min。将地稔乙酸乙酯提取物注入制备液相中分离，单次进样量为4mL。在紫外检测器下检测，收集24～26min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到木麻黄鞣宁提取物冻干粉。
将乙酸乙酯、水和三氟乙酸，按体积比为1：1：0.01的比例置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为25℃，将固定相以30mL/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至900r/min。转速稳定后，以3mL/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将300mg木麻黄鞣宁提取物冻干粉溶于15mL流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度的木麻黄鞣宁，纯度为98.64％。
实施例3
将10kg地稔洗净，按料液比1：8(w/v，g/mL)加入含0.1％(v/v)盐酸的70％(乙醇与水的体积比为70：30)的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为70：30)，在40℃下避光超声提取60min，之后真空抽滤，滤渣重复提取一次，滤液合并，并在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到地稔提取物粗提液。
将地稔提取物粗提液加入相同体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，收集乙酸乙酯相，之后在45℃下真空旋转蒸发浓缩，氮吹，得到地稔乙酸乙酯提取物粉末。
使用制备液相柱Unitary C18 20mm×250mm，将地稔乙酸乙酯提取物粉末用DMSO溶解，使其浓度达到60mg/mL，注入制备型液相色谱中，进样量4mL，流动相：A相：纯乙腈，B相：甲酸(5％)：水(95％)；柱温为30℃，流速为10mL/min，梯度为：5％的A相0～5min，5％～60％A相5～30min。将地稔乙酸乙酯提取物注入制备液相中分离，单次进样量为4mL。在紫外检测器下检测，收集24～26min的峰并减压浓缩，冷冻干燥，即可得到木麻黄鞣宁提取物冻干粉。
将乙酸乙酯、水和三氟乙酸，按体积比为1：1：0.01的比例置于分液漏斗中，充分摇匀，静置30min后，将上下相分开，超声脱气30min。将上相作为固定相，下相作为流动相。将高速逆流色谱仪启动预热30min后，循环水浴设置为25℃，将固定相以30mL/min的流速泵入仪器，然后正接正转，启动仪器，使主机转速至900r/min。转速稳定后，以3mL/min的流速泵入流动相，两相在管路中达到平衡后，将300mg木麻黄鞣宁提取物冻干粉溶于15mL流动相中，进样并在紫外检测器下检测，收集目标峰组分并减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度的木麻黄鞣宁，纯度为98.12％。
对比例1
制备工艺与实施例1相同，区别仅在于将高速逆流色谱分离的溶剂体系替换为：正丁醇：甲基叔丁基醚：甲醇：水：三氟乙酸按1：3：1：5：0.01的体积比混合。图5为对比例1中最终产物木麻黄鞣宁的高效液相色谱图；经测试，得到木麻黄鞣宁单体纯度仅为76.02％，远低于98％。
对比例2
对比于实施例1，去掉制备液相色谱纯化的步骤，其他步骤不变，经测试，无法得到高纯度的木麻黄鞣宁单体。
对比例3
对比于实施例1，将制备液相色谱纯化步骤中的收集时间调整为22-24min或26-28min，其他步骤不变，经测试，无法得到高纯度的木麻黄鞣宁单体。
应用例1
将实施例1制备得到的木麻黄鞣宁用DMSO溶解，配成一系列浓度(2μg/mL,3μg/mL,4μg/mL,5μg/mL,8μg/mL,10μg/mL)作为抑制剂。将α-葡萄糖苷酶用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.9)稀释至酶活为0.5U/mL。底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.9)配制成浓度为1mmol/L.酶促反应体系为20μL的酶与10μL的抑制剂混合，加入130μL的缓冲液和40μL的底物，在37℃下反应30min，之后加入200μL的1mol/L的碳酸钠溶液，于405nm下检测吸光值。空白组将抑制剂用缓冲液替代。酶活抑制率根据如下公式计算：抑制率％＝(A空白-A实验)/A空白*100％。在该反应体系下测得的木麻黄鞣宁的IC50值为0.22μmol/L，阳性对照阿卡波糖为0.52mmol/L。通过对比可知，本发明分离制备得到的木麻黄鞣宁对α-葡萄糖苷酶的抑制效果(IC50＝0.22μmol/L)显著优于阳性对照阿卡波糖。
图7示出了实施例1制备的木麻黄鞣宁的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线，本发进一步对实施例1制备的地稔乙酸乙酯提取物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，其α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线如图6所示。由图6和图7比较可知，经本发明方法提取得到的木麻黄鞣宁其α-葡萄糖苷酶抑制活性显著高于地稔乙酸乙酯提取物。因此，从地稔中分离制备得到的木麻黄鞣宁可作为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
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