测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用
阅读说明：本技术 测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用 (Sequencing joint, construction method, nanopore library construction kit and application ) 是由 杨志 刘艺 赵多军 李萍 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用。测序接头包括接头顶链和目标连接头,接头顶链包括沿预设测序方向设置的纳米孔引导链和第一连接基团,所述纳米孔引导链用于引导待测序列经过纳米孔测序通道；目标连接头包括与第一连接基团进行点击化学反应的第二连接基团,所述第二连接基团用于与待测序列连接。本申请提供的测序接头可避免使用连接酶,从而省去上机测序前的纯化处理步骤,提高测序效率,还可以避免使用连接酶造成的模板自连,人为引入嵌合序列,影响结构变异分析。(The application discloses a sequencing joint, a construction method, a nanopore library construction kit and application. The sequencing joint comprises a joint top chain and a target connector, the joint top chain comprises a nanopore guide chain and a first connecting group, the nanopore guide chain is arranged along a preset sequencing direction and is used for guiding a sequence to be tested to pass through a nanopore sequencing channel; the target connector comprises a second connecting group which performs click chemical reaction with the first connecting group, and the second connecting group is used for connecting with a sequence to be detected. The sequencing joint provided by the application can avoid using ligase, thereby omitting the purification treatment step before the sequencing on the computer, improving the sequencing efficiency, and also avoiding the self-connection of a template caused by using the ligase, artificially introducing an embedded sequence and influencing the structural variation analysis.)
技术领域
本申请属于基因测序技术领域，尤其涉及一种测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用。
背景技术
现有技术中，无论二代高通量测序还是纳米孔测序，在文库构建过程中均需要通过DNA连接酶连接测序接头和待测序列，再进行上机测序。相较于现有技术中的二代测序平台，纳米孔测序平台的读长较长，添加的DNA连接酶不仅会使测序接头和待测序列连接，还会使部分待测序列发生自连，严重干扰后续测序序列的分析。通过DNA连接酶连接测序接头和待测序列后，必须进行纯化处理，以去除连接反应中的组分，以免对后续上机测序产生影响。纯化处理步骤会延长建库时间，降低测序效率。
发明内容
本申请实施例提供一种测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用，能够避免DNA连接酶的使用，从而省去纯化处理，提升测序效率，还可以避免使用连接酶造成的模板自连，人为引入嵌合序列，影响结构变异分析。
一方面，本申请实施例提供一种测序接头，测序接头包括：
接头顶链，包括沿预设测序方向设置的纳米孔引导链和第一连接基团，所述纳米孔引导链用于引导待测序列经过纳米孔测序通道；
目标连接头，包括与所述第一连接基团进行点击化学反应的第二连接基团，所述第二连接基团用于与所述待测序列连接。
可选地，所述目标连接头还包括与所述第二连接基团连接的转座酶识别序列。
可选地，所述目标连接头还包括与所述第二连接基团连接的连接序列，沿预设测序方向，所述连接序列远离所述第二连接基团的末端设置有突出粘性末端。
可选地，所述目标连接头还包括与所述待测序列上游或下游对应的引物，所述第二连接基团与所述引物的连接。
可选地，当所述目标连接头包括与所述第二连接基团连接的连接序列时，所述目标连接头还包括位于所述第二连接基团和所述引物之间的阻抗聚合酶修饰；优选的，所述阻抗聚合酶修饰为dspacer修饰。
可选地，所述第一连接基团和所述第二连接基团中一个为环辛烯，另一个为四嗪基；可选的，所述第一连接基团为环辛烯，所述第二连接基团为四嗪基；
或，所述第一连接基团和所述第二连接基团中一个为二苯基环辛炔，另一个为叠氮基。
可选地，所述接头顶链的摩尔数量小于所述目标连接头的摩尔数量。
可选地，所述测序接头还包括：
接头底链，包括与所述纳米孔引导链部分互补的接头互补链。
可选地，所述接头底链还包括第一粘性末端序列，所述第一粘性末端序列和所述接头互补链沿所述测序方向连接；所述目标连接头还包括与所述第一粘性末端序列互补的第二粘性末端序列，所述第二连接基团和所述第二粘性末端序列沿所述测序方向设置。
可选地，接头顶链和接头底链的摩尔数量比为1:1，接头顶链的摩尔数量小于目标连接头的摩尔数量。
另一方面，本申请实施例提供了一种文库的构建方法，如上述的测序接头应用于所述构建方法，所述构建方法包括：
提供如上述测序接头：
将所述目标连接头与待测序列连接；
使所述第一连接基团和所述第二连接基团发生点击化学反应，得到样本文库。
另一方面，本申请实施例提供了一种纳米孔建库试剂盒，纳米孔建库试剂盒包括如上述的测序接头和多核苷酸结合蛋白。
再一方面，本申请实施例提供了一种如上述测序接头、方法、或纳米孔建库试剂盒在表征生物聚合物或制备表征生物聚合物的产品中的应用。
本申请实施例的测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用，通过在接头顶链上设置第一连接基团，同时设置用于连接待测序列的第二连接基团，使得接头顶链和待测序列通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应连接，从而省去使用T4 DNA连接酶，并省去上机测序前的纯化处理，提高测序效率；通过设置纳米孔引导链，使得连接有待测序列的测序接头可以准确识别纳米孔，并引导连接的待测序列通过测序仪的纳米孔测序通道。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请一个实施例中接头顶链的部分化学式示意图；
图2是本申请一个实施例中目标连接头的部分化学式示意图；
图3是图1所示的接头顶链和图2所示目标连接头的退火产物的部分化学式示意图；
图4是本申请一个实施例中测序接头的结构示意图；
图5是本申请另一个实施例中测序接头的结构示意图；
图6是本申请又一个实施例中测序接头的结构示意图；
图7是本申请一个实施例的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8是本申请一个实施例的纳米孔测序过孔信号图；
图9是本申请另一实施例的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图10是本申请又一实施例的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图11是本申请再一实施例的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本申请进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅意在解释本申请，而不是限定本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本申请的示例来提供对本申请更好的理解。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
为了解决现有技术问题，本申请实施例提供了一种测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用。下面首先对本申请实施例所提供的测序接头进行介绍。
测序接头包括接头顶链和目标连接头，接头顶链包括沿预设测序方向设置的纳米孔引导链和第一连接基团，纳米孔引导链用于引导待测序列经过纳米孔测序通道；目标连接头包括与第一连接基团进行点击化学反应的第二连接基团，第二连接基团用于与待测序列连接。
本申请提供的测序接头应用于纳米孔测序平台。具体可以对多核苷酸进行测序，所述多核苷酸包括DNA和/或RNA。所述纳米孔测序包括使待测序列的模板链和/或互补链通过的纳米孔测序通道，检测所述待测序列的模板链和/或互补链通过纳米孔测序通道时，引起的电流等电信号变化，表征所述待测序列。例如根据电流变化信息得到待分析物的尺寸信息、序列信息、同一性信息、修饰信息等。
预设测序方向为本领域技术人员根据待测序列需求或纳米孔测序平台设定的方向，预设测序方向具体可以包括沿待测序列的5’端至3’端进行，还可以沿待测序列的3’端至5’端进行。当预设测序方向是3’端至5’端进行，则第一连接基团连接在纳米孔引导链的5’端；当预设测序方向是5’端至3’端进行，则第一连接基团连接在纳米孔引导链的3’端。测序接头还可以包括与接头顶链部分或全部互补的接头底链，接头底链还可以包括与纳米孔测序通道识别的序列，以引导待测序列到达纳米孔测序通道附近；接头底链还可以根据需要设置多核苷酸结合蛋白，如解旋酶结合位点等，以有利于待测序列各个小分子依次通过纳米孔测序通道。在一实施例中，接头顶链和接头底链可由两个部分互补的寡聚体组成，退火后形成y形结构；接头顶链和接头底链还可以是内部互补的单一寡聚体，形成发卡结构。本领域技术人员可以根据纳米孔测序平台、纳米孔测序通道类型、退火温度需求、识别标签的设计等设计接头顶链和和接头底链。接头顶链和接头底链还可以包括多种标记序列，例如检测日期标记序列、样品序号标记序列等，以通过碱基的不同排序区别不同的测序接头；当然接头顶链和接头底链还可以包括其他具有生物功能序列和修饰。
点击化学(click chemistry)为通过小单元的拼接，来快速地完成不同分子的化学合成。在本申请中第一连接基团和第二连接基团可以基于点击化学反应连接在一起，即可通过连接第一连接基团和第二连接基团，使得纳米孔引导链和待测序列连接，从而可进一步实现纳米孔引导链牵引待测序列经过纳米孔测序通道。第一连接基团和第二连接基团可以是通过碳碳多键加成反应连接、通过亲核开环化反应连接、通过环加成反应等点击化学反应。例如：第一连接基团可以是环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)或二苯并环辛炔(DICO)中的任意一种。第二连接基团可以是叠氮基(N3)、四嗪基(TZ)等。本领域技术人员可以理解的是，本实施例不限定第一连接基团和第二连接基团具体为哪种可发生点击化学反应的基团。
本申请中的第二连接基团可以通过多种方式与待测序列连接。例如将第二连接基团耦合至引物上，将待测序列作为模板，通过PCR(polymerase chainreaction)扩增得到多个连接有第二连接基团的待测序列；还可以将第二连接基团耦合至带有转座子的序列上，通过转座酶将连接有第二连接基团的序列与待测序列连接，从而得到连接有第二连接基团的待测序列；还可以通过TA连接将第二连接基团与待测序列连接，对待测序列5’端进行磷酸化和3’端进行加腺嘌呤(A)处理，同时第二连接基团与预设序列5’端连接，对预设序列3’端进行加胸腺嘧啶(T)处理，通过腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)互补连接第二连接基团和待测序列。本实施例不限制第二连接基团与待测序列的连接方式。
本申请中，通过在接头顶链上设置第一连接基团，同时设置用于连接待测序列的第二连接基团，使得接头顶链和待测序列通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应连接，从而省去使用DNA连接酶，并省去上机测序前的纯化处理，提高测序效率；通过设置接头顶链和接头底链，使得连接有待测序列的测序接头可以准确识别纳米孔，并引导连接的待测序列通过测序仪的纳米孔测序通道；同时避免使用连接酶造成的模板自连，人为引入嵌合序列，影响结构变异分析。
当第二连接基团通过引物与待测序列连接时，目标连接头还包括与待测序列上游或下游对应的引物，第二连接基团与引物连接。接头底链还包括第一粘性末端序列，所述第一粘性末端序列和所述接头互补链沿所述测序方向连接；目标连接头还包括与第一粘性末端序列互补的第二粘性末端序列，所述第二连接基团和所述第二粘性末端序列沿所述测序方向设置。在本申请中引物可以是上游引物或下游引物，第二粘性末端序列和第二连接基团一同设置于同一引物。为方便描述，以下均以第二连接基团、第二粘性末端和上游引物连接，测序方向为5’端至3’端为例进行说明。通过目标连接头和对应的下游引物可以以待测序列为模板进行PCR扩增，生成的扩增产物为携带有目标连接头的待测序列；再通过退火处理，第一粘性末端和第二粘性末端发生互补，接头顶链和目标连接头在空间上靠近，从而可提高第一化学基团和第二化学基团发生点击化学反应的效率。进一步增加目标连接头、接头底链和接头顶链连接的稳定性。
进一步地，目标连接头还包括位于第二连接基团和待测序列之间的阻抗聚合酶修饰。阻抗聚合酶修饰为阻止聚合酶继续延伸的化学修饰，例如：3’磷酸化修饰、双脱氧胞苷(3'ddC Dideoxy-C)等。该阻抗聚合酶修饰还可以为dspacer修饰，dspacer为只有磷酸骨架而没有碱基的核苷酸，所以其空间结构相比正常核苷酸小，使得DNA聚合酶延伸到dspacer修饰的位置时，因为无法识别而从扩增的待测序列上滑脱下来，从而停止聚合。
在一实施例中，第一连接基团和第二连接基团中一个为环辛烯(TCO)，另一个为四嗪基(Tz)。在另一实施例中，第一连接基团和第二连接基团中一个为二苯基环辛炔(DBCO)，另一个为叠氮基(N3)。TCO的化学式可以如图1所示，Tz的化学式可以如图2所示，Tco和Tz相互作用下，形成如下如图3所示化学式，其中，R1和R2分别为纳米孔引导链和待测序列。本领域技术人员可以理解的是，R1和R2还可以包括其他序列或修饰，使得TCO或Tz连接R1，形成本申请各实施例中的接头顶链，TCO或Tz连接R2，形成本申请各实施例中的目标连接头。图2为1,2,4,5-四嗪基，本领域技术人员可以理解的是，本申请中四嗪基(Tz)还可以为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或其衍生物以实现通过点击化学反应进行连接，同理本申请中的环辛烯(TCO)不局限于图1所示基团，还可以是图1所示基团的衍生物。
进一步地，接头顶链和接头底链的摩尔数量比为1:1，从而可确保接头顶链和接头底链可以全部一一互补，避免形成游离单链，影响后续上机检测。由于不是所有的接头顶链均能与目标连接头一一对应连接，将接头顶链的摩尔数量设置小于目标连接头的摩尔数量，以确保加入的接头顶链均能和目标连接头连接，避免游离的接头顶链，提高后续上机检测的准确率和速率。接头顶链与目标连接头的摩尔比可以为1:1～2。
本领域技术人员可以根据待测序列的结构，自行设计目标连接头中的引物，并根据待测序列的长度、CG含量等确定扩增体系，以使得扩增产物为带有第二连接基团的待测序列。请参阅图4，在一实施例中，测序方向为5’端至3’端，接头顶链11为：5’-AATGT ACTTC GTTC AGTTA CGTAT TGC-TCO-3’；
接头底链12为：5’-GCCG-GCAAT ACGT AACTG AACGA AGTAC ATT-GAGGC GAGCGGTCAA T-3’；
上游引物为228-F：5’-Tz-CGGC-dspacer-ATCGGCATCAGAGCAGAT TGTA-3’；
下游引物为228-R：5’-AACGTCGTGACTGGGAAAAC-3’。
其中，上游引物228-F中的“CGGC”为第二粘性末端，接头底链12中5’端的“GCCG”为第一粘性末端，“CGGC”序列和“GCCG”序列通过碱基互补配对连接；接头顶链11中“AATGTACTTCGTTCAGTTACGTATTGC”为模拟纳米孔引导链结构的多聚核苷酸，接头底链12中“GCAATACGTAACTGAACGAAGTA CATT”为与模拟纳米孔引导链的互补序列，在接头底链12的3’端还留有一段不与接头顶链互补配对的序列，从而当接头顶链11和接头底链12互补配对时，接头顶链11和接头底链12形成Y形结构。上游引物228-F中Tz为第二连接基团，接头顶链中TCO为第一连接基团，上游引物228-F和下游引物228-R以待测序列为模板，得到的扩增产物为228-F-待测序列，228-F-待测序列中的Tz基团和接头顶链中的TCO基团点击化学连接，从而实现纳米孔引导链和待测序列连接。本领域技术人员可以理解的是，第一粘性末端和第二粘性末端的长短、碱基类型等，均可根据上游引物和接头顶链的空间结构、序列长短、CG含量等自行设计，仅需保证第一粘性末端和第二粘性末端可通过碱基互补配对即可。
请参阅图5，当第二连接基团通过转座酶与待测序列连接时，所述目标连接头还包括与所述第二连接基团连接的转座酶识别序列。转座酶识别序列为能被转座酶识别的序列，转座酶与转座酶识别序列可以结合形成转座酶复合体。在转座酶作用下，第二连接基团引入到待测序列的末端。本领域技术人员可以理解的是，目标连接头中不仅仅包括与转座酶识别序列连接的第二连接基团，还可以包括第一粘性末端或者其他需要引入的序列或结合的蛋白。在一实施例中，测序方向为5’端至3’端，接头顶链11为：5’-AATGT ACTTC GTTC AGTTA CGTAT TGC-TCO-3’；
接头底链12为：5’-GCCG-GCAAT ACGT AACTG AACGA AGTAC ATT-GAGGC GAGCGGTCAA T-3’；
转座酶识别序列包括互补的：
Tn5-Top：TZ-CGGCAGATGTGTATAAGAGACAG；
Tn5-bottom：CTGTCTCTTATACACATCT。
其中，转座酶识别序列Tn5-Top中的“CGGC”为第二粘性末端，接头底链中5’端的“GCCG”为第一粘性末端，“CGGC”序列和“GCCG”序列通过碱基互补配对连接；接头顶链中“AATGTACTTCGTTCAGTTACGTATTGC”为模拟纳米孔引导链结构的多聚核苷酸，接头底链中“GCAATACGTAACTGAACGAAGTA CATT”为与纳米孔引导链的互补序列。转座酶识别序列Tn5-Top中Tz为第二连接基团，接头顶链中TCO为第一连接基团。转座酶识别序列Tn5-Top和Tn5-bottom退火后与Tn5转座酶孵育，可得到转座酶复合体，转座酶复合体与待测序列孵育后，“TZ-CGGC”与待测序列连接，从而实现纳米孔引导链和待测序列连接。在另一实施例中，接头顶链为“5’-(iSpC3)30-GCGTG ACTAT CGGAC TCGTG GTC TTTTT TTTTT-(iSp18)4-GTCAG TTCGC TTCTT ACGCA-TCO-3’”，接头底链为“5’-GCCG TGCGT AAGAA GCGAA CTGAC AGTCCAGCAC CGACC T-3’”，在该实施例中，接头顶链还包括(iSpC3)30修饰、(iSp18)4修饰、以及“TTTTT TTTTT”柔性序列等。
请参阅图6，当第二连接基团通过TA连接与待测序列连接时，所述目标连接头还包括与所述第二连接基团连接的连接序列，所述目标连接头还包括与所述第二连接基团连接的连接序列，沿预设测序方向，所述连接序列远离所述第二连接基团的末端设置有突出粘性末端，该连接序列通过突出粘性末端以TA连接的方式与待测序列连接。例如可以在所述连接序列3’端设置凸出的胸腺嘧啶核苷酸末端。本领域技术人员可以理解的是，连接序列远离第二连接基团的末端不是平末端，凸出的胸腺嘧啶核苷酸末端可以与进行加A处理的待测序列通过碱基互补配对连接，或者凸出的腺嘌呤核苷酸末端可以与进行加T处理的待测序列通过碱基互补配对连接。同样地，本领域技术人员可以理解的是，目标连接头不仅仅包括第二连接基因，还可以包括第一粘性末端或者其他需要引入的序列。连接序列的设计依据不与待测序列、接头顶链等发生互补、以及合适的CG含量等原则进行设计。在一实施例中，测序方向为5’端至3’端，接头顶链11为：5’-(iSpC3)30-GCGTG ACTAT CGGAC TCGTG GTCTTTTT TTTTT-(iSp18)4-GTCAG TTCGC TTCTT ACGCA-TCO-3’；
接头底链12为：5’-GCCG TGCGT AAGAA GCGAA CTGAC AGTCC AGCAC CGACC T-3’；
连接序列包括互补的：
TA-Top：TZ-CGGCAGATGTGTATAAGAGACAGT；
TA-bottom：5p-CTGTCTCTTATACACATCT。
其中，连接序列TA-Top中的“CGGC”为第二粘性末端，接头底链中5’端的“GCCG”为第一粘性末端，“CGGC”序列和“GCCG”序列通过碱基互补配对连接；连接序列TA-Top中Tz为第二连接基团，接头顶链中TCO为第一连接基团。连接序列TA-Top和TA-bottom退火后与进行加腺嘌呤核苷酸(A)处理的待测序列混合，连接序列与待测序列连接，“TZ-CGGC”与接头顶链连接，从而实现纳米孔引导链和待测序列连接。
另外，结合上述实施例中的测序接头，本申请实施例还提供一种文库的构建方法，如上述的测序接头应用于该构建方法中，所述构建方法包括：
步骤S1、提供如上述测序接头；
步骤S2、将所述目标连接头与待测序列连接；
步骤S3、使所述第一连接基团和所述第二连接基团发生点击化学反应，得到样本文库。
步骤S1中可以采用多种方式制备上述测序接头，同样地步骤S2中可以采用多种方式实现第二连接基团与待测序列连接，具体可参照上述实施例列举的方式，在此不再一一赘述。
在本申请步骤S3具体包括：将所述接头顶链和所述接头底链进行退火处理，得到退火产物；将所述退火产物和连接有所述第二连接基团的待测序列接触，以使所述第一连接基团和所述第二连接基团发生点击化学反应，得到样本文库。仅需将步骤S2中制备的退火产物和步骤S1中制备的连接有第二连接基团的待测序列混合，即可通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应，实现待测序列与接头顶链连接，制备得到样本文库。步骤S3中无需加入DNA连接酶，从而使得步骤S3中也无需进行纯化，即可制备得到能用于进一步生物分子表征的样本文库。
本申请实施例提供的测序接头，由于采用了以上任意一实施例提供的测序接头，因而具有相同的技术效果，这里不再赘述。
另外，结合上述实施例中的测序接头，本申请实施例还提供一种纳米孔建库试剂盒。该纳米孔建库试剂盒包括如上述的测序接头和多核苷酸结合蛋白。测序接头中接头顶链、目标连接头等可以采用冻干方式存储，也可以采用置于缓冲液存储方。本领域技术人员可以根据操作便利性、运输方便性或存储稳定性等原因，选择合适的方式形式保存测序接头。多核酸结合蛋白可以包括：解旋酶、核酸外切酶、端粒酶、拓扑异构酶、反转录酶、转位酶和/或聚合酶中的一种或两种以上，用于使得待测序列穿过纳米孔测序通道的转位速度小于核酸结合蛋白、解旋酶、核酸外切酶、端粒酶、拓扑异构酶、反转录酶、转位酶和/或聚合酶不存在时的转位速度。
在一实施例中，纳米孔建库试剂盒包括第一溶液和第二溶液，第一溶液包括第一缓冲液、以及置于第一缓冲液的接头顶链和接头底链；第二溶液包括第二缓冲液和置于第二缓冲液的目标连接头。本申请实施例提供的纳米孔建库试剂盒，由于采用了以上任意一实施例提供的测序接头，因而具有相同的技术效果，这里不再赘述。
第一缓冲液可以是磷酸缓冲液、TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)等可以稳定保存接头顶链和接头底链结构的缓冲液。第一缓冲液可以是DNA寡核苷酸退火缓冲液(Annealing Buffer)，从而稳定接头顶链和接头底链结构，同时保证接头顶链和接头底链结构可以有效杂交。例如：第一缓冲液包括10mM Tris、50mM NaC1和1mM EDTA，pH为7.5-8.0。通过将接头顶链和接头底链置于第一缓冲液中保存，可提高接头顶链和接头底链结构的稳定性。
同样地，第二缓冲液为用于稳定目标连接头的缓冲液。本领域技术人员可以根据目标连接头的结构选择合适的缓冲液。当目标连接头包括与待测序列对应的上游测序引物或下游测序引物时，第二缓冲液为有利于DNA结构稳定的缓冲液，例如：TE缓冲液；当目标连接头包括转座子序列时，第二缓冲液为有利于DNA结构稳定和转座酶反应的缓冲液。
本领域技术人员可以理解的是，本申请提供的纳米孔建库试剂盒还可以包括独立包装的Primer-index complex F(正向引物)、Primer-index complex R(反向引物)、Amplify enzyme(扩增酶)和Amplifybuffer(扩增缓冲液)、PCR tube(PCR管)、EP tube(EP管)等中的一样或多样，且不限于此，以方便用户制备可直接上机的样品。
另外，结合上述实施例中的纳米孔建库试剂盒，本申请实施例还提供一种纳米孔建库试剂盒在核苷酸测序上的应用。本申请实施例提供的纳米孔建库试剂盒在核苷酸测序上的应用，由于采用了以上任意一实施例提供的纳米孔建库试剂盒，因而具有相同的技术效果，这里不再赘述。
当目标连接头还包括与待测序列对应的上游引物或下游引物，第二连接基团位于引物的5’端；测序方法包括：
步骤S21，取第二溶液对待测序列进行扩增，得到扩增产物；
具体地，取第二溶液、PCR扩增缓冲液、dNTP、待测序列、聚合酶、与目标连接头的引物对应的引物等混合，根据待测序列和后续测序需求设置合适的扩增体系和扩增参数进行PCR扩增。
步骤S22，将扩增产物与第一溶液混合，以使第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应，扩增产物与接头顶链连接生成退火产物；
可以根据扩增产物的拷贝数，加入合适量的第一溶液，以使得第一连接基团的摩尔数量少于第二连接基团。室温下静置一段时间，以使得第一连接基团和第二连接基团具有充足时间发生点击化学反应。
步骤S23，通过纳米孔测序仪对退火产物进行测序，得到待测序列对应的核苷酸序列信息。
本申请不限定采用何种纳米孔测序平台的纳米孔测序仪，仅需保证采用的纳米孔测序仪与第一溶液中的接头顶链和接头底链适配即可。当需要对多个样品中可能存在的待测序列进行检测和测序时，可以预先根据该待测序列设计并合成具有第二连接基团的扩增引物，混合第二缓冲液后，制备成第二溶液。检测人员预先对各个样品提取核苷酸，再将提取的核苷酸作为模板进行扩增，参照上述步骤S21-S23，完成对各个样品的检测和测序。
与现有测序方法相比，本实施例不需要对待测序列进行末端补平、5’端磷酸化和3’端加A处理等，同时也不需要使用DNA连接酶，从而省去上机测序前的纯化步骤，提高测序效率；由于不使用DNA连接酶，避免待测序列自连，从而提高测序结果准确性，有利于后续序列分析的进行。
本申请还提供了以下验证试验，以说明本申请提供的测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用的效果。
实施例1：
(1)设计并合成模拟接头顶链结构的模拟接头顶链和模拟接头底链的模拟接头底链，其中，
模拟接头顶链为adaptor-top：
5’-AATGTACTTCGTTCAGTTACGTATTGC-TCO-3’；
模拟接头底链为adaptor-bottom：
5’-GCCGGCAATACGTAACTGAACGAAGTACATTGAGGCGAGCGGTCAAT-3’。
取退火缓冲液分别溶解合成的模拟接头顶链和模拟接头底链，制备得到20uM的储液A和储液B，将储液A和储液B等比混合后做退火处理，得到退火产物。
(2)根据pUC19质粒的已知序列，设计一对产物为228bp的引物，其中上游引物5’端做适当修饰后如下：
228-F：5’-Tz-CGGC-dspacer-ATCGGCATCAGAGCAGATTGTA-3’；
下游引物228-R为：5’-AACGTCGTGACTGGGAAAAC-3’。
(3)采用KAPA Biosystems公司制备的HiFi DNA聚合酶、以及上述228-F和228-R引物，参照以下扩增体系和反应参数进行扩增，扩增后用1x Ampure xp beads进行纯化处理，qubit4.0定量后根据长度换算出拷贝数。
95℃酶热启动2-5min；98℃变性120s，55℃退火15s，72℃延伸9s，30个循环；72℃延伸5min。
(4)根据换算出的拷贝数，取150fmol扩增产物到一新的离心管中，取300fmol模拟接头顶链和模拟接头底链的退火产物放入该离心管中，退火缓冲液将总体积补足至10μl，室温放置10min后，获得退火产物。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述退火产物、扩增产物和退火产物进行检测。如图7所示，为本申请提供的模拟测序接头连接待测序列的电泳图，其中，胶孔对应样品从左至右依次为，maker；1孔：接头顶链；2孔：扩增产物；3孔和4孔为连接有模拟测序接头的待测序列。从图7中可以看出，在2孔、3孔和4孔对应有一条约200bp多的条带，该条带与228-F引物、228-R引物对应的目标产物大小一致；在3孔和4孔中还有一条300bp左右的条带，该条带的大小与连接有模拟测序接头的待测序列的大小一致，证明扩增产物与模拟接头顶链连接成功；通过2孔、3孔和4孔的明亮程度可知，至少有一半以上的扩增产物连接上了模拟测序接头。
实施例2：
(1)设计并合成接头顶链和接头底链，其中，
接头顶链为adaptor-top：
5’-(iSpC3)30-GCGTG ACTAT CGGAC TCGTG GTC TTTTT TTTTT-(iSp18)4-GTCAG TTCGC TTCTT ACGCA-TCO-3’；
接头底链为adaptor-bottom：
5’-GCCG TGCGT AAGAA GCGAA CTGAC AGTCC AGCAC CGACC T-3’；
取退火缓冲液分别溶解合成的接头顶链和接头底链，制备得到20μM的储液A和储液B，将储液A和储液B等比混合后做退火处理。
将T4 Dda解旋酶装载到Y衔接子上，得到酶和接头的复合物。T4 Dda解旋酶的序列如SEQ ID NO.1。
(2)根据噬菌体(phage)的已知序列，设计一对产物为502bp的PCR扩增引物，上游引物修饰后为：
phage-502-F：5’-Tz-CGGC-dspacer-AATAACGTCGGCAACTTTGG-3’；
下游引物为：phage-502-R：5’-GTTACGCCACCAGTCATCCT-3’。
(3)参考实施例1的扩增体系和扩增参数进行PCR扩增、纯化、计算拷贝数。
(4)根据换算出的拷贝数，取100fmol扩增产物到一新的离心管中，取100fmol酶和接头的复合物放入该离心管中，退火缓冲液将总体积补足至10ul，获得连接有测序接头的待测序列；
(5)使用齐碳科技有限公司的基因测序仪QNome-9604、测序芯片Qcell-3841和测序试剂盒Qeagen-8对待测序列进行测序，将测序试剂盒Qeagen-8反应产物与连接有测序接头的待测序列混合，将混合物滴入测序芯片上，获得过孔信号图。
请参阅图8，为连接有测序接头的待测序列上机测序的过孔信号图。图8所示圆圈部分为Tco-Tz-CGGC-dspacer的过孔信号，该过孔信号右侧为不同碱基的过孔信号，证明本实施例提供的测序接头可以应用于纳米孔测序。
实施例3：
参考实施例2的方案制备连接有测序接头的待测序列，不同之处在于，将接头顶链中的Tco基团替换为DBCO基团，将上游引物中的Tz基团替换为N3基团；并设置3个对照组，3个对照组中分别将退火产物和扩增产物的混合物静置25min、2hour和6hour，以验证不同静置时间，对退火产物和扩增产物连接速率的影响。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述产物进行检测。请参阅图9至图11，图9为静置25min后产物的电泳图，其中，胶孔对应样品从左至右依次为：maker；1孔-3孔：静置25min的退火产物和扩增产物的混合物；4孔：扩增产物；5孔：接头顶链。如图10为静置2hour后产物的电泳图，其中，胶孔对应样品从左至右依次为：maker；1孔-3孔：静置2hour的退火产物和扩增产物的混合物；4孔：扩增产物；5孔：接头顶链。如图11为静置6hour后产物的电泳图，其中，胶孔对应样品从左至右依次为：maker；1孔-3孔：静置6hour的退火产物和扩增产物的混合物；4孔：扩增产物；5孔：接头顶链。
从图9、图10和图11中均可以看出，混合物对应有2条明显条带，证明待测序列与测序接头连成功接；并且图9、图10和图11相比较可以看出，静置25min、2hour和6hour情况下，连接有测序接头的待测序列随着时间增加逐渐增多。
纳米孔测序：方法与实施例2步骤(5)相同，结果：DBCO-N3-CGGC-dspacer的过孔信号与实施例2步骤(5)中Tco-Tz-CGGC-dspacer的过孔信号相近，即过孔信号与待测碱基明显不同，证明本实施例提供的测序接头可以应用于纳米孔测序。
实施例4：
(1)参考实施例2步骤(1)制备酶和接头的复合物；
(2)设计并合成连接序列，连接序列包括两条部分互补的序列，
Tn5-Top：5’-TZ-CGGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，
Tn5-bottom：5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’；
(3)将Tn5-Top和Tn5-bottom用annealbuffer稀释到40uM的浓度，然后等比例混合，进行两条序列的退火，得到退火产物；
(4)取一定量步骤(3)制备的退火产物与适当浓度的Tn5转座酶共同孵育，制备得到转座酶复合体；
(5)取一定量已知序列的长片段DNA，利用上述转座酶复合体进行片段化，以使“Tz-CGGC”被引入到片段化DNA的末端；
(6)参照实施例2步骤(4)和(5)，对连接有测序接头的待测序列进行测序，获得过孔信号，过孔信号分析得到的序列与已知序列一致。
实施例5：
(1)参考实施例2步骤(1)制备酶和接头的复合物；
(2)设计并合成连接序列，连接序列包括两条部分互补的序列，
TA-Top：5’-TZ-CGGCAGATGTGTATAAGAGACAGT-3’，
TA-bottom：5’-5p-CTGTCTCTTATACACATCT-3’；
(3)将TA-Top和TA-bottom用anneal buffer稀释到40uM的浓度，然后等比例混合，进行两条序列的退火，得到退火产物；
(4)将已知序列的待测序列进行末端修复，并进行加腺嘌呤核苷酸(A)处理，使其5’端磷酸化，3’端突出一个A碱基；
(5)用T4 DNA连接酶将步骤(3)中的退火产物和步骤(4)中处理后的待测序列进行连接，连接后Tz-CGGC会被引入到待测序列的末端，对退火产物进行纯化；
(6)参照实施例2步骤(4)和(5)，对连接有测序接头的待测序列进行测序，获得过孔信号，过孔信号分析得到的序列与已知序列一致。
另外，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。应理解，在本申请实施例中，“与A相应的B”表示B与A相关联，根据A可以确定B。但还应理解，根据A确定B并不意味着仅仅根据A确定B，还可以根据A和/或其它信息确定B。
以上，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 成都齐碳科技有限公司
<120> 测序接头、构建方法、纳米孔建库试剂盒及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 439
<212> PRT
<213> 肠道菌噬菌体T4(enterobacteria phage T4)
<400> 1
Gly Thr Pro Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Leu Ala Ala Pro Ala Ile
1 5 10 15
Val Met Leu Ala Ile Leu Gly Leu Leu His His Val Thr Ile Ala Gly
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Gly Leu Thr Thr Leu Thr Leu Pro Ile Ile Gly Ala
35 40 45
Leu Ile Ser Thr Gly Gly Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His
50 55 60
Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ile His Ser Ile Leu Leu Ile Ala Pro Val Thr Thr Gly Cys Ala Val
85 90 95
Leu Pro Gly Gly Leu Gly Val Pro Ala Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu
100 105 110
Ile Cys Ala Gly Val Ser Met Thr Ala Ala Leu Leu Pro Leu Ile Leu
115 120 125
Leu Ser Thr Ile Pro Pro Thr Ala Thr Ile Ile Gly Ile Gly Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Ile Ala Pro Val Ala Pro Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ile Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Thr His Leu Ala Pro Thr Gly Cys Gly Leu Thr Gly Val
165 170 175
Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ile Ile Ala Val Ala Thr Ala Val Ala Ala
180 185 190
Gly Leu Thr Ile Thr Ala Leu Val Val Ala Gly His Gly Val Ala Gly
195 200 205
Pro Thr Gly Ala Thr Ala Leu Ala Ala Pro Met Val Ala Thr Pro Ser
210 215 220
Ile Val Leu Ser Leu Ala Ala Leu Pro Gly Ala Ala Val Met Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ala Leu Ser Val Ala Leu Leu Ala Ser Ile Ile Ala Leu Leu Ile
245 250 255
Pro Gly Thr Ala Leu Ala Pro Ile Val Gly Gly Ile Ile Val Met Gly
260 265 270
Gly Pro Leu Pro Leu Thr Thr Leu Ile Ala Gly Leu Pro Val Ser Gly
275 280 285
Ile Ile Pro Ala Ala Gly Gly Leu Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr
290 295 300
Thr Ser Thr Pro Val Leu Ala Ala Gly Val Pro Gly Gly Thr Leu Ile
305 310 315 320
Ala His Thr Ala Leu Thr Val Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Ala Gly Leu Ile Leu Ile Ile Ser Ser Ala Gly Gly Leu Thr Leu Pro
340 345 350
Ala Leu Pro Leu Gly Leu Thr Cys Gly Thr Thr Leu Ala Thr Ala Leu
355 360 365
Gly Gly Leu Ala Pro Thr Ser Ala Pro Thr Ala Ala Leu Ser Gly Pro
370 375 380
Ser Leu Val Leu Ala Leu Pro Ala Ser Thr Pro His Leu Ala Gly Gly
385 390 395 400
Met Ser Val Ala Ala Ala Pro Ile Thr Thr Pro Cys Ile His Thr Ala
405 410 415
Ala Val Gly Leu Ala Gly Gly Leu Leu Thr Val Gly Val Thr Ala Gly
420 425 430
Ala Thr Ala Val Pro Thr Val
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