一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺
阅读说明：本技术 一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 (Fermentation process for improving production level of recombinant collagen ) 是由 周浩 郝东 王俊 魏文培 侯增淼 于 2021-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺,涉及基因重组工程菌发酵技术领域。一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺,包括以下步骤：S1：将毕赤酵母工程菌接种于种子罐中培养,待溶氧大幅度回升后补加甘油和补料培养基,待湿重增至大于100g/L时,移种至发酵罐中开始发酵培养；S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后,使用碳源培养基和补料培养基进行混合碳源补料,待物料湿重增至大于150g/L时,停止混合碳源补料；S3：碳源耗尽后,加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束。本发明可以提高重组胶原蛋白的表达量,缩短发酵周期,从而提高重组胶原蛋白的发酵生产水平,适用于稳定的工业化生产。(The invention provides a fermentation process for improving the production level of recombinant collagen, and relates to the technical field of fermentation of gene recombinant engineering bacteria. A fermentation process for improving the production level of recombinant collagen comprises the following steps: s1: inoculating pichia pastoris engineering bacteria into a seeding tank for culture, supplementing glycerol and a supplementing culture medium after dissolved oxygen is greatly increased back, and transferring the pichia pastoris engineering bacteria into a fermentation tank for starting fermentation culture when the wet weight is increased to be more than 100 g/L; s2: culturing pichia pastoris engineering bacteria in a fermentation tank until dissolved oxygen is greatly increased, then using a carbon source culture medium and a supplementing medium to supplement mixed carbon sources, and stopping supplementing the mixed carbon sources when the wet weight of the materials is increased to be more than 150 g/L; s3: after the carbon source is exhausted, adding methanol and a feed medium to perform induced expression until the end of fermentation. The invention can improve the expression quantity of the recombinant collagen and shorten the fermentation period, thereby improving the fermentation production level of the recombinant collagen and being suitable for stable industrial production.)
技术领域
本发明涉及基因重组工程菌发酵技术领域，具体而言，涉及一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。因为具有独特的结构，决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。
在现有技术中，胶原蛋白的主要来源是动物组织提取，而随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得的重组胶原蛋白已取得巨大成果，与天然胶原蛋白相比，利用该技术生产的重组胶原蛋白解决了传统提取法存在的病毒隐患缺陷，同时又显著提高了胶原蛋白的稳定性、亲水性和生物相容性。
目前，一般使用毕赤酵母工程菌进行发酵培养，生产重组胶原蛋白；但是目前发酵培养基多是以Invitrogen公司提供的BSM培养基为主，且在发酵阶段一般碳源补料阶段只使用甘油，诱导表达阶段只使用甲醇；这样的发酵方法存在以下一些问题：
(1)利用BSM培养基培养种子，湿重在90-100g/L，整体菌量偏低，移入发酵培养基后延滞期较长，影响整体生产水平；
(2)BSM培养基成分盐离子浓度过高，抑制菌体生长，影响菌种活力，难以快速达到高密度发酵水平；
(3)甘油粘稠，过高的占比影响氧传质及料液的均一性；
(4)BSM培养基的高盐及甘油、甲醇的单独使用易导致中后期菌体的衰亡、蛋白酶分泌的增加，蛋白降解的加剧，从而影响整体蛋白的质量；
(5)BSM培养基成分含高浓度磷酸，培养基初始pH低于1.5，对电极等元件都有极大地损伤，严重的影响发酵罐的使用寿命；
(6)BSM培养基及补料甘油、甲醇含PTM1，PTM1配制复杂且不能高温灭菌，需要无菌过滤，为工业化放大造成极大困扰；
(7)毕赤酵母工程菌在维持溶氧时，需要纯氧的引入，这样一方面增加生产成本，另一方面纯氧属于易燃易爆品，易造成安全事故。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，其可以提高重组胶原蛋白的表达量，缩短发酵周期，从而提高重组胶原蛋白的发酵生产水平，适用于稳定的工业化生产。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：
一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后补加甘油和补料培养基，待湿重增至大于100g/L时，移种至发酵罐中开始发酵培养；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用碳源培养基和补料培养基进行混合碳源补料，待物料湿重增至大于150g/L时，停止混合碳源补料；
S3：碳源耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束。
进一步地，所述步骤S1中种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.47～1.175g/L，K2SO4 7.28～18.2g/L，MgSO4·7H2O5.96～14.9g/L，KOH 1.625～4.13g/L，甘油20.0～40.0g/L；葡萄糖20.0～40.0g/L；(NaPO3)6 6.5～13.0g/L，白色玉米浆干粉3～7g/L。
进一步地，所述步骤S1中种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.5875～0.8225g/L，K2SO4 9.1～12.74g/L，MgSO4·7H2O7.45～10.43g/L，KOH 2.07～2.891g/L，甘油20.0～30.0g/L；葡萄糖20.0～30.0g/L；(NaPO3)6 6.5～9.1g/L，白色玉米浆干粉3～5g/L。
进一步地，所述补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.1～0.705g/L；K2SO4 0.15～10.92g/L；MgSO4·7H2O 0.25～8.94g/L；KOH 0.12～2.478g/L；白色玉米浆干粉0.3～4g/L。
进一步地，所述补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.25～0.5875g/L；K2SO4 5.46～9.1g/L；MgSO4·7H2O 4.47～7.45g/L；KOH 0.75～2.065g/L；白色玉米浆干粉2.1～3.5g/L。
进一步地，所述步骤S2中补料培养基的流加速率为5～8mL/h/L，碳源培养基的流加速率为8～15mL/h/L；所述步骤S3中补料培养基的流加速率为3～5mL/h/L，甲醇的流加速率为3～7mL/h/L。
进一步地，所述步骤S1中补料培养基的流加速率为5～8mL/h/L，甘油的流加速率为10～18mL/h/L。
进一步地，所述步骤S1中将毕赤酵母工程菌培养至湿重增至160～180g/L时，移种至发酵罐；所述步骤S2中将毕赤酵母工程菌培养至湿重增至180～200g/L后停止混合碳源补料。
进一步地，所述步骤S2中碳源培养基为甘油、葡萄糖或甘油和葡萄糖混合培养基。
进一步地，所述发酵培养的条件为：发酵温度28～32℃，氨水调节pH为4.8～5.5，诱导表达前溶氧不低于30％，罐压0.04～0.06MPa，诱导表达后溶氧不低于5％，罐压0.08～0.1MPa。
进一步地，所述毕赤酵母工程菌为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，于2020年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20458。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
1.本发明使用复配的发酵培养基，采用甘油和葡糖糖复配，一方面可以降低料液粘度，同时可以避免过多的有机酸产生而抑制菌种的生长；降低盐离子浓度，降低对菌种生长的抑制；提高菌种湿重至160～200g/L，缩短移入发酵培养基后的延滞期；从而有效提升菌种的生长速度，缩短发酵周期。
2.本发明在菌种转至发酵罐之前，使用甘油和补料培养基进行补料，在移入发酵罐之后的碳源补料阶段也使用碳源培养基和补料培养基进行混合碳源补料，诱导表达阶段使用甲醇和补料培养基进行混合补料诱导表达，提高发酵过程中的离子强度及补充微量元素，抑制胶原酶生成，有效提高重组胶原蛋白的表达量。
3.本发明使用复配的发酵培养基中不添加磷酸，可以避免初始pH过低对电极等元件造成损伤，避免影响发酵罐的使用寿命。
4.本发明使用的发酵培养基、补料培养基、甘油、碳源培养基和甲醇中均不添加PTM1，操作简便，更适合工业化生产。
5.本发明在在诱导阶段通过提高罐压，增加诱导压力以维持罐内一定的溶氧，达到不使用纯氧的目的，节约成本，生产操作更加安全。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺进行具体说明。
毕赤酵母工程菌为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，于2020年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20458。
实施例1
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照10％的接种量接种于含70L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度28℃，氨水调节pH为4.8，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为10mL/h/L，补料培养基的流加速率为5mL/h/L；待湿重增至160g/L时，移种至含有700L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度28℃，氨水调节pH为4.8，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为8mL/h/L，补料培养基的流加速率为5mL/h/L；待物料湿重增至185g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为3mL/h/L，温度28℃，氨水调节pH为4.8，罐压0.08MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.5875g/L，K2SO4 8.05g/L，MgSO4·7H2O 7.45g/L，KOH 3.59g/L，甘油20.0g/L；葡萄糖30.0g/L；(NaPO3)6 7.1g/L，白色玉米浆干粉3g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.1g/L；K2SO4 5.46g/L；MgSO4·7H2O 7.45g/L；KOH 0.23g/L；白色玉米浆干粉3.5g/L。
实施例2
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照6％的接种量接种于含50L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度30℃，氨水调节pH为5.5，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为16mL/h/L，补料培养基的流加速率为6mL/h/L；待湿重增至180g/L时，移种至含有600L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为5.5，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用葡萄糖和补料培养基进行混合碳源补料，葡萄糖的流加速率为9mL/h/L，补料培养基的流加速率为8mL/h/L；待物料湿重增至200g/L时，停止混合碳源补料；
S3：葡萄糖耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为5mL/h/L，温度30℃，氨水调节pH为5.5，罐压0.09MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.47g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 6.21g/L，KOH 2.07g/L，甘油21.0g/L；葡萄糖22.0g/L；(NaPO3)6 6.5g/L，白色玉米浆干粉3.5g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.6217g/L；K2SO4 0.15g/L；MgSO4·7H2O 6.55g/L；KOH 0.12g/L；白色玉米浆干粉2.1g/L。
实施例3
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照8％的接种量接种于含60L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度32℃，氨水调节pH为5.0，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为13mL/h/L，补料培养基的流加速率为6mL/h/L；待湿重增至180g/L时，移种至含有650L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度32℃，氨水调节pH为5.0，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为15mL/h/L，补料培养基的流加速率为7mL/h/L；待物料湿重增至190g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为4mL/h/L，温度32℃，氨水调节pH为5.0，罐压0.1MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 1.175g/L，K2SO4 16.15g/L，MgSO4·7H2O 5.96g/L，KOH 3.92g/L，甘油30.0g/L；葡萄糖20.0g/L；(NaPO3)6 8.8g/L，白色玉米浆干粉5g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.19g/L；K2SO4 8.56g/L；MgSO4·7H2O 0.25g/L；KOH 2.065g/L；白色玉米浆干粉0.4g/L。
实施例4
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照10％的接种量接种于含70L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度28℃，氨水调节pH为5.2，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为18mL/h/L，补料培养基的流加速率为7.5mL/h/L；待湿重增至175g/L时，移种至含有700L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为5.5，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和葡萄糖按1:1比例混合培养基和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油和葡萄糖的流加速率为12mL/h/L，补料培养基的流加速率为6.5mL/h/L；待物料湿重增至200g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油和葡萄糖耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为4mL/h/L，温度32℃，氨水调节pH为4.9，罐压0.09MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.8225g/L，K2SO4 9.1g/L，MgSO4·7H2O 9.15g/L，KOH 4.13g/L，甘油26.0g/L；葡萄糖23.0g/L；(NaPO3)6 10.2g/L，白色玉米浆干粉7g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.25g/L；K2SO4 10.92g/L；MgSO4·7H2O 4.47g/L；KOH 0.52g/L；白色玉米浆干粉2.7g/L。
实施例5
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照9％的接种量接种于含65L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度28℃，氨水调节pH为4.9，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为12mL/h/L，补料培养基的流加速率为8mL/h/L；待湿重增至170g/L时，移种至含有650L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为5.2，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为10mL/h/L，补料培养基的流加速率为7.5mL/h/L；待物料湿重增至185g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为4.5mL/h/L，温度28℃，氨水调节pH为5.2，罐压0.08MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.6521g/L，K2SO4 7.28g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 2.34g/L，甘油25.0g/L；葡萄糖24.0g/L；(NaPO3)6 13g/L，白色玉米浆干粉6.5g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.4622g/L；K2SO4 0.34g/L；MgSO4·7H2O 2.18g/L；KOH 2.478g/L；白色玉米浆干粉4g/L。
实施例6
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照10％的接种量接种于含70L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度30℃，氨水调节pH为4.9，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为15mL/h/L，补料培养基的流加速率为8mL/h/L；待湿重增至165g/L时，移种至含有650L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为5，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为14mL/h/L，补料培养基的流加速率为6.5mL/h/L；待物料湿重增至180g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为3.5mL/h/L，温度28℃，氨水调节pH为5，罐压0.08MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.4912g/L，K2SO4 10.55g/L，MgSO4·7H2O 12.42g/L，KOH 1.625g/L，甘油27.0g/L；葡萄糖21.0g/L；(NaPO3)6 11.5g/L，白色玉米浆干粉5g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.705g/L；K2SO4 2.75g/L；MgSO4·7H2O 8.94g/L；KOH 1.83g/L；白色玉米浆干粉1.6g/L。
实施例7
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照8％的接种量接种于含60L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度29℃，氨水调节pH为4.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为14mL/h/L，补料培养基的流加速率为7mL/h/L；待湿重增至175g/L时，移种至含有650L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度28℃，氨水调节pH为4.9，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为11mL/h/L，补料培养基的流加速率为8mL/h/L；待物料湿重增至190g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为3mL/h/L，温度28℃，氨水调节pH为4.9，罐压0.08MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.5105g/L，K2SO4 12.74g/L，MgSO4·7H2O 13.6g/L，KOH 2.891g/L，甘油22.0g/L；葡萄糖26.0g/L；(NaPO3)6 12.3g/L，白色玉米浆干粉6g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.3521g/L；K2SO4 9.1g/L；MgSO4·7H2O 0.51g/L；KOH 1.15g/L；白色玉米浆干粉3g/L。
实施例8
本实施例提供了一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照8％的接种量接种于含75L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度30℃，氨水调节pH为5，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加50％甘油和补料培养基，50％甘油的流加速率为12mL/h/L，补料培养基的流加速率为6.5mL/h/L；待湿重增至170g/L时，移种至含有650L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为5，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油和补料培养基进行混合碳源补料，50％甘油的流加速率为15mL/h/L，补料培养基的流加速率为5.5mL/h/L；待物料湿重增至195g/L时，停止混合碳源补料；
S3：甘油耗尽后，加入甲醇和补料培养基进行诱导表达至发酵结束，甲醇于流加速率为3～7mL/h/L范围内动态调整流加，补料培养基的流加速率为4mL/h/L，温度29℃，氨水调节pH为5.2，罐压0.08MPa，溶氧不低于5％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.9815g/L，K2SO4 14.1g/L，MgSO4·7H2O 10.43g/L，KOH 1.91g/L，甘油28.0g/L；葡萄糖20.0g/L；(NaPO3)6 9.1g/L，白色玉米浆干粉4g/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：CaSO4·2H2O 0.5875g/L；K2SO4 6.52g/L；MgSO4·7H2O 8.11g/L；KOH 0.75g/L；白色玉米浆干粉3.2g/L。
对比例
本对比例提供了一种重组胶原蛋白的发酵工艺，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母工程菌按照10％的接种量接种于含70L发酵培养基的100L种子罐中培养，温度30℃，氨水调节pH为4.6，罐压0.03MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后，移种至含有700L发酵培养基的1500L发酵罐中开始发酵培养，温度30℃，氨水调节pH为4.6，罐压0.03MPa，溶氧不低于30％；
S2：将发酵罐内的毕赤酵母工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用50％甘油进行碳源补料，50％甘油的流加速率为6mL/h/L；待物料湿重增至120g/L时，停止混合碳源补料；
S3：碳源耗尽后，加入甲醇进行诱导表达至发酵结束，甲醇的流加速率为8mL/h/L，温度30℃，氨水调节pH为4.6，罐压0.03MPa，加入液氧使溶氧不低于20％，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
种子罐和发酵罐中使用的毕赤酵母工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
其中，PTM1包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L。用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。
实验例
分别取实施例1～8和对比例发酵结束后的发酵液，通过HPLC检测重组胶原蛋白的浓度，并记录实施例1～8和对比例的发酵周期，计算发酵生产水平；结果如表1所示。
发酵生产水平(g/L·h)＝重组胶原蛋白的浓度(g/L)/发酵周期(h)
表1 发酵生产水平
由表1可以看出，本发明使用的发酵方法，实施例1～8与对比例相比，所得的重组胶原蛋白的浓度较高，发酵周期较短，则重组胶原蛋白的发酵生产水平较高。
综上，本申请提供的一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，其使用相对于现有技术使用的BSM培养基改良型的发酵培养基，且在发酵过程中，在菌种转至发酵罐之前，使用甘油和补料培养基进行补料，在菌种转至发酵罐之后的碳源补料阶段也使用碳源培养基和补料培养基进行混合碳源补料，诱导表达阶段使用甲醇和补料培养基进行混合补料诱导表达，有效提高重组胶原蛋白的表达量，缩短发酵周期，从而提高重组胶原蛋白的发酵生产水平，适用于稳定的工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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