一种长链脂肪酸甘油醇类化合物Rubracin B、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种长链脂肪酸甘油醇类化合物Rubracin B、制备方法及其应用 (Long-chain fatty acid glycerol alcohol compound Rubracin B, preparation method and application thereof ) 是由 康冀川 钱声艳 曾学波 钱一鑫 卢永仲 陈丽庄 何张江 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本申请涉及微生物技术领域中的一种长链脂肪酸甘油醇类化合物Rubracin B,结构如下式所示：所述化合物由红棕毛筒腔菌发酵提取后获得,所述红棕毛筒腔菌命名为红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2,保藏单位：中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO：M2019957。该化合物具有制备肿瘤耐药逆转剂或肿瘤药物增敏剂的用途。(The application relates to a long-chain fatty acid glycerol alcohol compound Rubracin B in the technical field of microorganisms, the structure of which is shown as the following formula: the compound is obtained by fermenting and extracting the phaeosphaeria rubra, the phaeosphaeria rubra is named as phaeosphaeria rubra Tubeufia PF02-2, and the preservation unit is as follows: china center for type culture Collection, the preservation number is CCTCC NO: m2019957. The compound has the application of preparing tumor drug resistance reversal agent or tumor drug sensitizer.)
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种长链脂肪酸甘油醇类化合物RubracinB、制 备方法及其应用。
背景技术
癌症已经成为严重威胁人类健康及生命的疾病之一。肿瘤的治疗主要包括化疗、手术、 放射治疗等，化疗是癌症治疗的主要手段之一。在化疗过程中，肿瘤细胞产生耐药性是导致 化疗失败的最主要的原因。因此，寻找低度、活性良好的逆转剂是解决肿瘤耐药性最根本途 径，具有主要的研究价值。
P-糖蛋白(P-gp)是ABC转运蛋白家族最具有代表性的蛋白之一，分子量为170kD，由1280 个氨基酸残基组成。研究表明，P-gp能够转运化学性质和结构多样性的药物，包括部分抗癌 药物，如阿霉素、紫杉烷类等，引起多药耐药(MDR)现象，导致癌症治疗的失败。因此，P-gp 抑制剂和底物的研究对于癌症治疗具有重要的意义，可将P-gp抑制剂与化疗药物共同给药 作为克服MDR的有效策略。目前，已经开发了几代P-gp抑制剂，第一代逆转剂包括他莫昔 芬、环孢素A等，其中以维拉帕米和环胞菌素为典型代表。但是此类药物通常缺乏P-糖蛋 白的特异性，会产生严重的副作用，第一代逆转剂也在临床上受到很大程度的限制(Sato W.et al.1991)。第二代逆转剂孢菌素类似物伐司朴达(valspodar，PSC833)、右旋维拉帕米 (dexverapamil)等，其中以地塞米松为代表，然而，第二代逆转剂的开发由于高毒性和药物相 互作用而产生一系列副作用而受到限制(Rowinsky E.K.et al.1998；HyafilF.et al.1993；Keller R.P.et al.1992)。第三代P-糖蛋白抑制剂的主要代表药物有Tariquidar(XR9576)、 Zosuquidar(LY335979)、S9788等，其中以Tariquidar(XR9576)和WK-X-34为代表(Massey P.R.et al.2014)。而从天然产物及其衍生物中开发P-gp抑制剂已成为第四代抑制剂研发的新 方向和重点。
微生物来源天然产物一直都是创新药物研发重要来源，为新药研发提供物质基础。同时 微生物具有生长周期短、代谢易于调控、菌种易于选育可以通过大规模的发酵实现工业化生 产等优势，进一步奠定了其在新药研发中重要地位。目前有发现从微生物来源的天然产物中 开发P-gp抑制剂的具体报道，但是并未明确具体是何种物质。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种微生物来源的长链脂肪酸甘油醇类新化合物及其 制备方法以及它在制备逆转耐药肿瘤细胞活性药物中的应用。
本发明的目的之一是提供一种长链脂肪酸甘油醇新化合物Rubracin B，结构如下式所示：
本发明的目的之二是提供一种长链脂肪酸甘油醇新化合物Rubracin B的制备方法，所述 化合物由红棕毛筒腔菌发酵提取后获得，所述红棕毛筒腔菌命名为红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019957。
本发明所述的红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2，是由贵州大学生化工程中心分离获 得，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日： 2019.11.20，保藏登记号为CCTCC NO：M 2019957。
红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2的来源如下：
采样时间：2016年5月14日；
采样地点：广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区；
采样方式：采集位于广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区的腐木，塑料密封袋 带回实验室.
本发明的红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2菌株具有下述性质：
菌落形态特征：在自然腐木基质上，菌落平展，呈网状、点状，量大时连接成片状，新 鲜经分离得到的PF02-2纯菌落上呈无色透明到白色，经分离得到的PF02-2纯菌落自然干燥 后呈红棕色。部分菌丝体埋生于基质之下，但多为表生，菌丝体由有隔膜带分枝的菌丝组成， 无色至深棕色。分生孢子梗圆柱状，单生，弯曲生长，有隔膜，50-150微米长，4.5-6微米 宽，顶端逐渐变细，底部深棕色，顶部透明到浅棕色，表面光滑。产孢细胞单生或多生，圆 柱状，具柱状小齿突，合轴生长于分子孢子梗中部到顶部，10-19微米长，3-4微米宽，无色 透明状到浅棕色，表面光滑。分子孢子卷旋型，单生，顶侧生，透明，顶端圆形，紧密卷旋时卷曲2-3.5次，直径35-50微米，分生孢子丝3-5微米厚(平均直径45微米，厚度4.5微米)，在水中逐渐松散开，具不清晰的多隔膜，无色到浅棕色，表面光滑。分生孢子在水-琼脂培养基中12h后开始萌发生长。菌落在PDA培养基中置于25-28℃生长2周可达16mm，棕色， 呈圆形，表面粗糙，有明显的突出物，呈脉状皱褶，菌落边缘完整。
具体的，制备方法包括以下步骤：将红棕毛筒腔菌Tubeufia rubra PF02-2进行液体或固 体发酵培养，得到发酵物；将发酵物萃取，所得萃取物经分离纯化，得到长链脂肪酸甘油醇 类化合物Rubracin B。
制备方法具体包括以下步骤：
S1、菌株活化：取出保存的菌种，接种在基础培养基平板上，静置培养传代至第三代 后放大培养；
S2、发酵培养：取步骤S1活化后的菌种接种在固体培养基中，在26～30℃下静置发酵培养一段时间；
S3、萃取：取菌体连同培养基，加入乙酸乙酯萃取，将萃取液浓缩后得到发酵产物；
S4、发酵产物预处理：用氯:甲＝1:1溶剂溶解发酵产物，再与硅胶按质量比1:1～2混合 均匀，待溶剂挥发后作为一次上柱样品，再与硅胶粉和石油醚上分离柱，分别采用石油醚、 氯仿、乙酸乙酯和甲醇依次梯度洗脱，洗脱溶剂经旋转蒸发仪减压回收后，用氯仿、丙酮或 甲醇溶解，在用薄层层析点板，使用展开剂展开，选择在紫外可见光分析仪下254nm或365 nm有荧光的液体，再用8％硫酸乙醇香草醛显色剂显色；合并乙酸乙酯层溶剂洗脱液，回收 乙酸乙酯溶剂，得到乙酸乙酯浸膏；
S5、纯化分离：a、将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶剂溶解，与硅胶按质量比1:1～3混合均匀， 待溶剂挥发作上柱样品上预柱，采用10％甲醇水进行平衡反相中压柱，加入含样品预柱， 采用甲醇水依次10个梯度洗脱，洗脱液经旋转蒸发仪回收溶剂后，甲醇溶解后在用薄层层 析点板，使用展开剂展开，选择在紫外可见光分析仪下254nm或365nm有荧光的液体，再 合并8％硫酸乙醇香草醛显色剂显灰黑色的组分，得到Fr.12组分；
b、将组分Fr.12用甲醇溶剂溶解后，与硅胶按质量比约1:1～3混合均匀，待溶剂挥发 后作上柱样品；称取硅胶粉与氯:甲＝1:1溶剂混合均匀装入分离柱中，再加入柱样品，采用 用氯:甲:甲酸＝9:1:1滴梯度洗脱，洗脱液经旋转蒸发仪回收溶剂后，甲醇溶解后在用薄层层 析点板，使用展开剂展开，选择在紫外可见光分析仪下254nm或365nm有荧光的液体，再 合并8％硫酸乙醇香草醛显色剂显灰黑色的组分，得到Fr.12-5组分；
c、将Fr.12-5用甲醇溶解，与硅胶按质量比约1:1～3混合均匀，待溶剂挥发后作上柱 样品上预柱，采用50％甲醇水进行平衡反相中压柱，加入含样品预柱，采用甲醇水依次6个梯度洗脱，洗脱液经旋转蒸发仪回收溶剂后，甲醇溶解后在用薄层层析点板，使用展开剂展开，选择在紫外可见光分析仪下254nm或365nm有荧光的液体，再合并8％硫酸乙醇香 草醛显色剂显灰黑色的组分，得到Fr.12-5-4组分；
d、将Fr.12-5-4采用正相硅胶柱层析，采用氯:甲系统梯度洗脱，薄层层析点板合并得到 化合物Rubracin B。
其中，所述步骤S2的固体培养基为燕麦培养基，将200g燕麦以及150mL双蒸水混合后获得。
本发明的目的之三是提供上述化合物及药用载体在制备肿瘤耐药逆转剂或肿瘤药物增 敏剂中的应用。
进一步的，所耐药物或肿瘤药物为阿霉素。
进一步的，所述的肿瘤包括乳腺癌。
进一步的，所述肿瘤耐药逆转剂为转运泵抑制剂，所述转运泵抑制剂对耐药蛋白P-糖蛋 白和多药耐药蛋白中一种或几种具有抑制作用。
本发明的目的之四是提供上述化合物及药用载体在制备抗乳腺癌细胞药剂中的应用。
附图说明
图1为化合物Rubracin B分离纯化流程图；
图2为本发明中化合物Rubracin B的旋光谱图；
图3为本发明中化合物Rubracin B的红外光谱图；
图4为本发明中化合物Rubracin B的高分辨质谱图；
图5为本发明中化合物Rubracin B的DEPT图
图6为本发明中化合物Rubracin B的1H-NMR图；
图7为本发明中化合物Rubracin B的HSQC谱图；
图8为本发明中化合物Rubracin B的1H-1H COSY谱图；
图9为本发明中化合物Rubracin B的HMBC谱图；
图10为本发明中化合物Rubracin BΕΙ碎片离子谱图；
图11为本发明中化合物Rubracin B的细胞毒活性；
图12为本发明中不同浓度Rubracin B对MCF-7/ADR细胞加入不同浓度阿霉素的增值影 响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1、化合物Rubracin B的制备方法
如图1所示，
S1、菌株活化
从-80℃冰箱中取出甘油斜面保存的菌种，以无菌接种环挖取1环菌株Tubeufiarubra的 菌种，十字划线接种于直径11cm的基础培养基平板，28℃静置培养17d，传代至第三代 可放大培养。
S2、发酵培养
燕麦固体发酵，1L三角烧瓶分装200g燕麦以及150mL双蒸水，每瓶接种量为培养平板上面积1×1cm2的活化菌种量，在28℃下静置培养至105天。
S3、萃取
菌体连同燕麦培养基，加入乙酸乙酯提取三次，每次在160rpm振荡萃取24h，合并萃 取液，40℃减压浓缩，得到发酵产物，重复以上操作，合并发酵产物得2027.17g。
S4、发酵产物预处理
用氯:甲＝1:1溶剂溶解用丙酮溶剂溶解2027.17g的发酵产物，与硅胶按质量比约1:1.5 (即2027.17g发酵产物中加200-300目硅胶粉3041g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙 状样品，该样品作为一次上柱样品；称取200-300目硅胶粉6000g与石油醚溶剂混合均匀(在 此过程中不能产生气泡)装入长为1.5m，内径为200mm分离柱中，让硅胶粉缓缓下沉直至不再下沉时加入一次上柱样品，分别采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇，依次4个梯度 洗脱，每个梯度洗脱2～3个(大约每个柱体积洗脱36L～54L洗脱溶剂)柱体积，每1000mL 洗脱溶剂为一份进行收集，每份洗脱样品经旋转蒸发仪减压回收后，用10或15mL氯仿、 丙酮或甲醇溶解，移到规格为20mL西林瓶中，薄层层析(TLC)点板，用石油醚：氯仿＝1:1、 石油醚：丙酮＝10:1、氯仿：丙酮＝5:1、氯仿：甲醇＝10：1、乙酸乙酯：甲醇＝5:1展开剂展 开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否在254nm或365nm有荧光，再用8％硫酸乙醇香 草醛显色剂显色；合并乙酸乙酯层溶剂洗脱液，回收乙酸乙酯溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏61.4 g。
S5、纯化分离
a、乙酸乙酯层浸膏(61.4g)用甲醇溶剂溶解，与硅胶按质量比约1:1.5(即100g发酵 产物中加中压RP-18反相硅胶)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作上柱样 品；上柱样品加上长为10cm，直径为49mm的预柱；采用10％甲醇水进行平衡反相中压 柱(柱长460mm，直径49mm)，平衡大约5～6个柱体积(大约洗脱5～6L)后，加入含样 品预柱，采用甲醇水梯度洗脱(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 100％)，依次10个梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积，采用规格500mL的三角烧瓶接 收洗脱液，每份洗脱液经旋转蒸发仪回收溶剂后，用10mL甲醇溶解转移到规格为20mL 西林瓶中后，经TLC点板，用石油醚：丙酮＝2:1、氯仿：丙酮＝5:1、氯仿：甲醇＝10：1、乙 酸乙酯：甲醇＝2:1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否在254nm或365nm有 荧光，再用8％硫酸乙醇香草醛显色剂显色，合并8％硫酸乙醇香草醛显灰黑色的组分，(就 是80％甲醇水洗脱的组分)，得到第12组分(Fr.12 3.6g)
b、组分Fr.12(3.6g)用甲醇溶剂溶解后，与200-300目硅胶按质量比约1:2(即3.6g组分中加7.2g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作上柱样品；称取200-300目硅胶粉120g与氯:甲＝1:1溶剂混合均匀(在此过程中不能产生气泡)装入长为490mm， 内径为29mm分离柱中，让硅胶粉缓缓下沉直至不再下沉时加入一次上柱样品，采用氯:甲: 甲酸＝9:1:1滴梯度洗脱，每个梯度洗脱3-4个柱体积(大约720-960mL)，用规格50mL三 角锥形瓶收集洗脱液，每份洗脱液经旋转蒸发仪回收溶剂后，用大约10mL甲醇溶解转移 到规格20mL西林瓶后，经TLC点板，用氯仿:丙酮＝2:1、氯仿:甲醇:甲酸＝5:1:1滴、乙酸乙 酯：甲醇＝3:1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否在254nm或365nm有荧光， 再用8％硫酸乙醇香草醛显色剂显色，合并8％硫酸乙醇香草醛显灰黑色的组分，得到第5 组分(Fr.12-5 2.6g)。
c、Fr.12-5(2.6g)用甲醇溶解，与硅胶按质量比约1:2(即2.6g组分中加RP-18反相硅胶5.2g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作上柱样品；上柱样品加入长为10cm，直径为26mm的预柱；采用50％甲醇水进行平衡反相中压柱(柱长460cm,直 径26mm)，平衡大约5～6个柱体积(大约洗脱2～3L)后，加上含样品预柱，采用甲醇水梯 度洗脱(50％、60％、70％、80％、90％、100％)，依次6个梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个 柱体积，采用规格500mL的三角烧瓶接收洗脱液250mL，每份洗脱液经旋转蒸发仪回收溶 剂后，用10mL甲醇溶解转移到规格为20mL西林瓶中后，经TLC点板，氯仿:丙酮＝2:1、 氯仿:甲醇:甲酸＝5:1:1滴、乙酸乙酯：甲醇＝3:1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观 察是否在254nm或365nm有荧光，再用8％硫酸乙醇香草醛显色剂显色，合并8％硫酸乙醇 香草醛显灰黑色的组分，得到第4组分(Fr.12-5-4 1.8g)。
d、Fr.12-5-4(1.8g)采用正相硅胶柱层析，采用氯:甲系统梯度洗脱(20:1；15:1；10:1)， TLC点板合并得到化合物Rubracin B 9.8mg。
2、化合物Rubracin B结构鉴定
化合物Rubracin B的结构
Rubracin B无色油状，易容于甲醇、丙酮、DMSO等溶剂。(c 0.14,MeOH) 详见附图2；IR谱(详见附图3)在3412cm-1、1739cm-1、1628表明该化合物具有羟基和酯基基团。HRESI(详见附图4)显示分子量为732.57391[M+Na]+，分子式为C42H79NNaO7， 计算不饱和度为4；13C NMR结合DEPT(详见附图4)推断出该化合物有三个酯基基团[δC 174.9,174.6和171.6]，两条长链脂肪链[δC 14.5(q),23.6(t),23.7(t),26.1(t),28.2(t),30.2～30.8 (t),32.7(t),33.1(t),35.0(t),35.1(t),130.8(d),131.0(d)]，5个连接杂原子碳信号[63.9(t),68.7 (t),70.5(d),71.5(t),77.5(d)]，3个连接杂原子甲基基团[52.4(q)]，最后有1个亚甲基[29.1(t)]； 1H NMR(附图5)结合HSQC(附图6)显示该化合物具有两条脂肪链[0.90(6H,t,J＝7.1Hz), 1.28～1.37(m),1.60(4H,m),2.06(2H,m),2.31(2H,t,J＝7.5Hz),2.33(2H,t,J＝7.4Hz),5.34 (2H,m)],8个连接杂原子氢质子信号[3.53(1H,td,J＝9.6,4.4Hz),3.60(2H,dd,J＝5.2,4.1Hz), 3.69(1H,m),3.70(1H,m),3.94(1H,m),4.16(1H,dd,J＝12.0,6.9Hz),4.41(1H,dd,J＝12.0,3.1 Hz)],1个亚甲基[2.21(1H,m),2.09(1H,m)]，3个甲基信号[3.20(9H,s)]
化合物Rubracin B 1H-1H COSY
详细的1D NMR数据详见表1。
表1 化合物Rubracin B碳谱数据
1H-1H COSY谱图上(详见附图8)可以推断出该化合物H-1、H-2和H-3连接，H-4、 H-5和H-6连接，H-2′和H-3′连接，H-2″和H-3″连接，H-15′和H-16′连接H-15″和H-16″ 连接。
化合物Rubracin B关键的HMBC相关
在HMBC上(详见附图9)，氢质子信号δH[4.16(1H,dd,J＝12.0,6.9Hz,H-1),4.41(1H,dd, J＝12.0,3.1,H-1)]与δC 174.9(s,C-1′),71.5(d,C-2),70.5(t,C-3)相关，证明C-1与酯基基团C-1′ 连接；氢质子信号δH[5.21(1H,m,H-2)]与δC 174.6(s,C-1″),63.9(t,C-1),70.5(t,C-3)相关， 证明C-2与酯基基团C-1″连接；氢质子信号δH[3.60(2H,dd,J＝5.2,4.1Hz,H-3)]与δC 63.9(t, C-1),71.5(d,C-2),68.7(t,C-4)相关，结合氢质子信号δH[3.53(1H,td,J＝9.6,4.4Hz,H-4), 3.69(1H,m,H-4)]与70.5(t,C-3),29.1(t,C-5),77.5(d,C-6)相关，可以推断C-3与C-4通过氧 原子相连形成了醚的结构片断；最后氢质子信号δH[3.70(1H,m,H-6)与171.6(s,C-7),29.1(t, C-5),52.4(q,-NMe)相关，证明C-6与酯基基团δC171.6(s,C-7)连接。
仔细分析1D-NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY可知，该化合物含有甘油1,2长链 脂肪酸甘油醇结构片断。结合EI-MS(详见附图10)显示碎片离子m/z 650，238详见下式， 结合化合物Rubracin B高分辨质谱最终确定化合物Rubracin B结构。
化合物Rubracin B关键的EI碎片离子相关
3、化合物Rubracin B细胞毒活性筛选
3.1测试细胞株：MCF-7/ADR(2021年5月购买于上海美轩生物科技有限公司)
3.2 RPMI1640+10％胎牛血清
3.3细胞培养
3.3.1细胞复苏
从液氮管中取出细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到37℃的水浴锅中迅速解冻，并 要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1mL的冻存管内液体完全溶解后，无菌条件下 取出细胞接种到细胞培养皿中(RPMI1640+10％胎牛血清)，置37℃CO2培养箱中培养，次 日更换培养液，继续培养，观察生长情况。
3.3.2细胞传代
待细胞长到80-90％后，无菌操作条件下采用规格为3mL塑料吸管吸出细胞培养液， 加入1-2mL PBS冲洗1次(不含钙、镁离子)，加1mL消化液(0.25％Trypsin-0.53mMEDTA) 于培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻 敲几下培养瓶后加2mL完全培养基终止消化。在新的培养瓶分别加新的完全培养基4mL， 然后分别加入1mL含细胞的完全培养基。
3.4 CCK-8测试细胞毒活性
3.4.1浓度梯度：0、6.25、12.5、25、50、100、200、400ug/mL，3个重复
阳性对照：阿霉素
阴性对照：DMSO
3.4.2实验步骤
(1)细胞消化，细胞计数，调整细胞浓度为2×104个/mL。
(2)在96孔板中接种100uL的细胞悬液。将培养板在5％CO2培养箱、37℃的条 件下培养24h。
(3)根据分组，分别加入含不同浓度的化合物及阿霉素，继续置于培养箱于37℃条件下孵育48h。
(4)培养结束后，PBS(不含钙、镁离子)冲洗1次，每孔加10uL CCK-8试剂，置 于培养箱孵育3h。
(5)用酶标仪测定在490nm处的吸光度。
3.4实验结果
如图11所示，结果表明化合物Rubracin B对MCF-7/ADR没有细胞毒活性，可以继续进行逆转肿瘤细胞筛选。
四、化合物Rubracin B在逆转MCF-7/ADR肿瘤细胞耐药的活性应用
4.1测试细胞株：MCF-7/ADR(2021年5月购买于上海美轩生物科技有限公司)
4.2 RPMI1640+10％胎牛血清
4.3细胞培养
4.3.1细胞复苏
从液氮管中取出细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到37℃的水浴锅中迅速解冻，并要 不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1mL的冻存管内液体完全溶解后，无菌条件下取 出细胞接种到细胞培养皿中(RPMI1640+10％胎牛血清)，置37℃CO2培养箱中培养，次日 更换培养液，继续培养，观察生长情况。
4.3.2细胞传代
待细胞长到80-90％后，无菌操作条件下采用规格为3mL毫升塑料吸管吸出细胞培养液， 加入1-2mL PBS冲洗1次(不含钙、镁离子)，加1mL消化液(0.25％Trypsin-0.53mMEDTA) 于培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻 敲几下培养瓶后加2mL完全培养基终止消化。在新的培养瓶分别加新的完全培养基4mL， 然后分别加入1mL含细胞的完全培养基。
4.4 CCK-8测试逆转肿瘤细胞毒活性
4.4.1阿霉素浓度梯度：0、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL，3个重复
Rubracin B浓度：5、10、20μg/mL
阳性对照：维拉帕米
阴性对照：DMSO
4.4.2实验步骤
(1)细胞消化，细胞计数，调整细胞浓度为2×104个/mL。
(2)在96孔板中接种100uL的细胞悬液。将培养板在5％CO2培养箱、37℃的条件 下培养24h。
(3)根据分组，分别加入含不同浓度的化合物和阿霉素，继续置于培养箱于37℃条件 下孵育48h。
(4)培养结束后，PBS(不含钙、镁离子)冲洗1次，每孔加10μL CCK-8试剂，置 于培养箱孵育3h。
(5)用酶标仪测定在490nm处的吸光度。
4.4实验结果
实验结果见表2和图12。
表2：Rubracin B逆转MCF-7/ADR肿瘤细胞耐药的活性
结果表明：化合物Rubracin B浓度分别5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL具有逆转耐 药MCF-7/ADR活性，其IC50值分别为64.64μg/mL、59.92μg/mL、50.81μg/mL，阳性 对照维拉帕米在相同药物浓度的IC50值分别为46.55μg/mL、38.45μg/mL、31.79μg/mL。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描 述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若 干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专 利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方 式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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