植物精油的纳米乳液及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 植物精油的纳米乳液及其制备方法和应用 (Nano emulsion of plant essential oil and preparation method and application thereof ) 是由 尹玉洁 戎春驰 徐晴 黄和 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及纳米乳液制备技术,公开了一种植物精油的纳米乳液及其制备方法和应用。本发明提供的植物精油的纳米乳液含有广藿香精油、乳化剂、包封剂、交联剂和水,以10重量份的广藿香精油为基准,所述乳化剂的含量为1-60重量份,所述包封剂的含量为1-20重量份,所述交联剂的含量为0.1-10重量份,所述水的含量为80-1000重量份。纳米乳液的制备方法包括以下步骤：(1)将广藿香精油、乳化剂、包封剂和交联剂混合后,进行均质得到混合料；(2)将混合料与水混合后,进行搅拌得到粗乳液；(3)将粗乳液进行超声乳化后得到所述纳米乳液。该纳米乳液的稳定性高、挥发性低,可用于治疗耐药菌感染。(The invention relates to a nano-emulsion preparation technology, and discloses a nano-emulsion of plant essential oil, a preparation method and an application thereof. The nanoemulsion of the plant essential oil provided by the invention contains patchouli essential oil, an emulsifier, an encapsulant, a cross-linking agent and water, wherein the content of the emulsifier is 1-60 parts by weight, the content of the encapsulant is 1-20 parts by weight, the content of the cross-linking agent is 0.1-10 parts by weight and the content of the water is 80-1000 parts by weight based on 10 parts by weight of the patchouli essential oil. The preparation method of the nano emulsion comprises the following steps: (1) mixing patchouli essential oil, an emulsifier, an encapsulant and a cross-linking agent, and homogenizing to obtain a mixture; (2) mixing the mixture with water, and stirring to obtain a coarse emulsion; (3) and carrying out ultrasonic emulsification on the crude emulsion to obtain the nano emulsion. The nanometer emulsion has high stability and low volatility, and can be used for treating drug-resistant bacterial infection.)
技术领域
本发明涉及纳米乳液制备技术，具体地，涉及一种植物精油的纳米乳液及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素自从被发现以来就一直是现代医学的奠基石，当细菌、真菌等微生物对用来治疗的药物产生耐受时，抗生素耐药性就会发生。而抗生素在人类和动物卫生中的持续过度使用和滥用，助长了抗生素耐药性的出现和蔓延。抗生素耐药性在世界各地发生，新的耐药机制也在不断出现并在全球蔓延，使越来越多的细菌性感染变得更难治疗，有时甚至无药可治。
尽管已经在开发新型抗生素，但这些抗生素从研制到审批上市要耗费巨大的人力、财力、物力和时间，使用后也同样会面临着耐药性问题，在这样严峻的形式下，研发人员开始转变思路，越来越多的国内外研究学者将目光投放到天然植物的提取物开发上，探索能够对抗细菌耐药性的新方法。
植物精油是控制有害生物的最有效的天然植物产品之一，其成分一般由小分子、蕲烯类、醇类、醛酮类等物质组成，作用机理复杂，较难使病原菌产生抗性，在农林生物防治等领域具有较好的应用前景。然而由于植物精油的挥发、光解和氧化等原因，在环境中存留时间过短、降解过快而无法发挥其生物活性，在很大程度上会进一步降低制剂的防治效果和持效期；又由于其稳定性及溶解性较差且长期放置易变质而很少能够直接提取利用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的植物精油稳定性及溶解性较差、降解过快的问题，提供一种植物精油的纳米乳液及其制备方法和应用，该纳米乳液的稳定性高、挥发性低，可用于治疗耐药菌感染。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种植物精油的纳米乳液，所述纳米乳液含有广藿香精油、乳化剂、包封剂、交联剂和水，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的含量为1-60重量份，所述包封剂的含量为1-20重量份，所述交联剂的含量为0.1-10重量份，所述水的含量为80-1000重量份。
优选地，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的含量为3-10重量份，所述包封剂的含量为1-5重量份，所述交联剂的含量为0.1-2重量份，所述水的含量为80-150重量份。
更优选地，所述乳化剂选自Tween80、卵磷脂、聚氧乙烯月桂醚58和聚乙烯醇中的至少一种，所述包封剂选自壳聚糖、明胶、甲壳素、海藻酸钠和阿拉伯胶中的至少一种，所述交联剂为焦磷酸硫胺素；所述纳米乳液的平均粒径为200-250nm。
本发明第二方面提供一种植物精油的纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将广藿香精油、乳化剂、包封剂和交联剂混合后，进行均质得到混合料；
(2)将步骤(1)得到的混合料与水混合后，进行搅拌得到粗乳液；
(3)将步骤(2)得到的粗乳液进行超声乳化后得到所述纳米乳液；
其中，所述广藿香精油、乳化剂、包封剂、交联剂和水的重量比为1：0.1-6：0.1-2：0.01-1：8-100。
优选地，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的用量为3-10重量份，所述包封剂的用量为1-5重量份，所述交联剂的用量为0.1-2重量份，所述水的用量为80-150重量份。
优选地，所述乳化剂选自Tween80、卵磷脂、聚氧乙烯月桂醚58和聚乙烯醇中的至少一种，所述包封剂选自壳聚糖、明胶、甲壳素、海藻酸钠和阿拉伯胶中的至少一种，所述交联剂为焦磷酸硫胺素；所述纳米乳液的平均粒径为200-250nm。
优选地，步骤(1)中所述均质的条件至少满足：转速为10000-15000rpm、均质时间为10-15min；
优选地，步骤(2)中所述搅拌的条件至少满足：转速为1500-2500rpm、搅拌时间为1-3min。
优选地，步骤(3)中所述超声乳化的条件至少满足：超声变幅杆的规格为4-8mm、功率为200-500w、温度为0-5℃、乳化时间为10-20min。
本发明第三方面提供上述的纳米乳液和/或根据上述的制备方法制得的纳米乳液在抑制细菌中的应用。
优选地，所述细菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；
优选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的纳米乳液选择具有良好抑菌功效的广藿香精油为原料，在与乳化剂、包封剂和交联剂的配合下，通过超声乳化法制备得到，该体系制得的纳米乳液易溶于水，可直接应用于饮水中，同时提升了外用的可吸收性。与传统乳液相比，本发明提供的纳米乳液属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心均不能使之分层，并兼具缓释的作用，能够实现长效抑菌，可作为治疗耐细菌感染的天然抗菌剂，对开发抑制细菌类的药物或产品具有重要的意义。
附图说明
图1是实施例1制得的纳米乳液的颜色观察图；
图2是实施例1制得的纳米乳液的粒径分析图；
图3是实施例1制得的纳米乳液的显微镜分析图；
图4是实施例5制得的纳米乳液的粒径分析图；
图5是对比例1制得的纳米乳液的粒径分析图；
图6是对比例2制得的纳米乳液的粒径分析图；
图7是实施例1制得的纳米乳液的抑菌曲线图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种植物精油的纳米乳液，所述纳米乳液含有广藿香精油、乳化剂、包封剂、交联剂和水，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的含量为1-60重量份，所述包封剂的含量为1-20重量份，所述交联剂的含量为0.1-10重量份，所述水的含量为80-1000重量份。
本发明提供的纳米乳液选择具有良好抑菌功效的广藿香精油作为精油原料，并与乳化剂、包封剂和交联剂相配合，使得纳米乳液易溶于水，可直接应用于饮水中，同时提升了外用的可吸收性。与传统乳液相比，本发明提供的纳米乳液属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心均不能使之分层，并兼具缓释的作用，能够实现长效抑菌。
根据本发明，广藿香精油可以直接市购获得，也可以通过现有技术中已公开的制备方法制得。
根据本发明，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的含量为3-10重量份，所述包封剂的含量为1-5重量份，所述交联剂的含量为0.1-2重量份，所述水的含量为80-150重量份。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高纳米乳液的稳定性和抑菌效果。
根据本发明，乳化剂可以采用常规的乳化物质，包封剂也可以采用常规的作为包覆壁材的物质，水可以采用去离子水、蒸馏水或者其他规格的水。优选情况下，所述乳化剂选自Tween80、卵磷脂、聚氧乙烯月桂醚58和聚乙烯醇中的至少一种，所述包封剂选自壳聚糖、明胶、甲壳素、海藻酸钠和阿拉伯胶中的至少一种，所述水采用去离子水。
根据本发明，所述交联剂采用焦磷酸硫胺素，本发明的发明人在研究过程中发现，焦磷酸硫胺素能够明显提升以广藿香精油制备纳米乳液时的稳定性和外用吸收性。
根据本发明，所述纳米乳液的平均粒径可以设置为常规的纳米颗粒粒径，优选情况下，所述纳米乳液的平均粒径为200-250nm，具体可以为200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm，或者上述两个值之间的任意值。
第二方面，本发明提供了一种植物精油的纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将广藿香精油、乳化剂、包封剂和交联剂混合后，进行均质得到混合料；
(2)将步骤(1)得到的混合料与水混合后，进行搅拌得到粗乳液；
(3)将步骤(2)得到的粗乳液进行超声乳化后得到所述纳米乳液；
其中，所述广藿香精油、乳化剂、包封剂、交联剂和水的重量比为1：0.1-6：0.1-2：0.01-1：8-100。
根据本发明，将广藿香精油、乳化剂、包封剂和交联剂通过超声乳化法制备得到纳米乳液，制备过程简单，有利于节约成本。
根据本发明，上述的制备方法中也可以将广藿香精油、乳化剂、包封剂和交联剂先与部分水混合，形成混合料，再将混合料与剩余的水混合后，进行所述搅拌。
根据本发明，以10重量份的广藿香精油为基准，所述乳化剂的用量为3-10重量份，所述包封剂的用量为1-5重量份，所述交联剂的用量为0.1-2重量份，所述水的用量为80-150重量份。
根据本发明，乳化剂可以采用常规的乳化物质，包封剂也可以采用常规的作为包覆壁材的物质。优选情况下，所述乳化剂选自Tween80、卵磷脂、聚氧乙烯月桂醚58和聚乙烯醇中的至少一种，所述包封剂选自壳聚糖、明胶、甲壳素、海藻酸钠和阿拉伯胶中的至少一种。
根据本发明，所述交联剂为焦磷酸硫胺素，以提升制得的纳米乳液的稳定性和外用吸收性。
根据本发明，通过控制步骤(1)中均质、步骤(2)中搅拌和步骤(3)中超声乳化的过程参数，以实现所述纳米乳液的平均粒径为200-250nm。
本发明中，所述均质可以选用任意一种能够进行均质的设备和工艺，例如高压均质机。优选情况下，步骤(1)中所述均质的条件至少满足：转速为10000-15000rpm，具体可以为10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm，或者上述两个值之间的任意值；均质时间为10-15min，，具体可以为10min、11min、12min、13min、14min、15min，或者上述两个值之间的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高纳米乳液的稳定性和抑菌效果，提升生产效率。
本发明中，所述搅拌可以选用任意一种能够进行搅拌的设备和工艺，例如磁力搅拌器。优选情况下，步骤(2)中所述搅拌的条件至少满足：转速为1500-2500rpm，具体可以为1500rpm、1700rpm、1900rpm、2100rpm、2300rpm、2500rpm，或者上述两个值之间的任意值；搅拌时间为1-3min，具体可以为1min、2min、3min，或者上述两个值之间的任意值。
根据本发明，步骤(2)中混合料与水混合的过程为：将所述混合料边搅拌边滴加所述水，直至水滴加结束，然后进行所述搅拌的过程。示例性地，水滴加可以采用移液枪缓慢滴加。
本发明中，所述超声乳化可以选用任意一种能够进行超声的设备和工艺，例如超声波细胞破碎仪。优选情况下，步骤(3)中所述超声乳化的条件至少满足：超声变幅杆的规格为4-8mm，具体可以为4mm、5mm、6mm、7mm、8mm，或者上述两个值之间的任意值；功率为200-500w，具体可以为200w、300w、400w、500w，或者上述两个值之间的任意值；温度为0-5℃，具体可以为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃，或者上述两个值之间的任意值；乳化时间为10-20min，具体可以为10min、12min、14min、16min、18min、20min，或者上述两个值之间的任意值。
第三方面，本发明提供了上述的纳米乳液和/或根据上述的制备方法制得的纳米乳液在抑制细菌中的应用。
本发明中，纳米乳液在抑制细菌中的应用具体可以是用于制备细菌抑制剂，或者以其它常规的形式用于抑制细菌。
优选地，所述细菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；示例性地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌。
以大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)为受试对象进行的抗菌试验中，结果显示本发明提供的方法制得的纳米乳液表现出比未包埋的广藿香精油更好的抑菌效果，抑菌时间更长，具有缓释作用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538均购自美国菌种保藏中心，广藿香精油购自江西华隆植物香料有限公司，其他原料为常规的市售品。
实施例1
(1)将8g广藿香精油、4g的Tween80、1.5g壳聚糖和0.5g焦磷酸硫胺素混合后，利用高压均质机在转速为12000rpm的条件下进行均质13min，得到混合料；
(2)将86g水用移液枪滴加到搅拌状态下的步骤(1)得到的混合料中，再利用磁力搅拌器以转速为2000rpm进行搅拌2min，得到粗乳液；
(3)取步骤(2)得到的粗乳液置于容器中，利用超声变幅杆为6mm的超声波细胞破碎仪，在功率为400W的条件下冰水浴超声乳化15min得到纳米乳液。
实施例2
(1)将10g广藿香精油、3g的聚氧乙烯月桂醚58、1g海藻酸钠和0.1g焦磷酸硫胺素混合后，利用高压均质机在转速为15000rpm的条件下进行均质10min，得到混合料；
(2)将80g水用移液枪滴加到搅拌状态下的步骤(1)得到的混合料中，再利用磁力搅拌器以转速为2500rpm进行搅拌1min，得到粗乳液；
(3)取步骤(2)得到的粗乳液置于容器中，利用超声变幅杆为4mm的超声波细胞破碎仪，在功率为500W的条件下冰水浴超声乳化10min得到纳米乳液。
实施例3
(1)将10g广藿香精油、5g卵磷脂、5g聚乙烯醇、5g甲壳素和2g焦磷酸硫胺素混合后，利用高压均质机在转速为10000rpm的条件下进行均质15min，得到混合料；
(2)将150g水用移液枪滴加到搅拌状态下的步骤(1)得到的混合料中，再利用磁力搅拌器以转速为1500rpm进行搅拌3min，得到粗乳液；
(3)取步骤(2)得到的粗乳液置于容器中，利用超声变幅杆为8mm的超声波细胞破碎仪，在功率为200W的条件下冰水浴超声乳化20min得到纳米乳液。
实施例4
(1)将10g广藿香精油、60g的Tween80、10g阿拉伯胶、10g明胶和10g焦磷酸硫胺素混合后，利用高压均质机在转速为12000rpm的条件下进行均质13min，得到混合料；
(2)将1000g水用移液枪滴加到搅拌状态下的步骤(1)得到的混合料中，再利用磁力搅拌器以转速为1500rpm进行搅拌3min，得到粗乳液；
(3)取步骤(2)得到的粗乳液置于容器中，利用超声变幅杆为8mm的超声波细胞破碎仪，在功率为200W的条件下冰水浴超声乳化20min得到纳米乳液。
实施例5
按照实施例3的方法制备纳米乳液，不同的是，将交联剂焦磷酸硫胺素替换为N，N-亚甲基双丙烯酰胺。
对比例1
(1)将10g广藿香精油、5g卵磷脂、5g聚乙烯醇和5g甲壳素混合后，利用高压均质机在转速为10000rpm的条件下进行均质15min，得到混合料；
(2)将150g水用移液枪滴加到搅拌状态下的步骤(1)得到的混合料中，再利用磁力搅拌器以转速为1500rpm进行搅拌3min，得到粗乳液；
(3)取步骤(2)得到的粗乳液置于容器中，利用超声变幅杆为8mm的超声波细胞破碎仪，在功率为200W的条件下冰水浴超声乳化20min得到纳米乳液。
对比例2
(1)在室温下，将10g广藿香精油与5g非离子表面活性剂(tween20)混合，然后在温和搅拌下加入2g助表面活性剂(丙二醇)、5g乳化剂(卵磷脂)和100g水，制得粗乳液；
(2)用匀浆机在转速为8000rpm的条件下对步骤(1)得到的粗乳液进行精细匀浆20min得到纳米乳液。
测试例1
将广藿香精油与实施例1制得的纳米乳液进行颜色观察，如图1所示，实施例1制得的纳米乳液呈乳白色均匀的乳状液体；采用Malvern粒度分析仪测定实施例1制得的纳米乳液的平均粒径，粒径分析结果如图2所示，实施例1制得的纳米乳液的平均粒径为236nm，并且无杂峰。经显微镜观察，实施例1制得的纳米乳液的液体分布均匀，大小均一，显微镜分析结果如图3所示。
将实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液分别进行粒度分析，如图4至图6所示，可见实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液的粒径分布不够均匀，且存在杂峰，相应地，实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液存在一定的不稳定性。
实施例1-实施例5制得的纳米乳液均易溶于水，可直接应用于饮水中，且属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心均不会分层。
测试例2临床分离菌株耐药性检测
参照临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)发布的标准，采用微量肉汤稀释法测定临床分离大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)对实施例1制得的纳米乳液以及广藿香精油的敏感性。本试验中的质控菌株选用大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739和金色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538，所有抗生素和培养基均在质控范围内。测试结果显示，实施例1制得的纳米乳液表现出比未包埋的广藿香精油更好的抑菌效果，抑菌时间更长。
测试例3纳米乳液的抑菌活性测定
参照CLSI发布的标准，采用稀释涂布平板法测定实施例1制得的纳米乳液以及广藿香精油的抑菌活性，结果显示，实施例1制得的纳米乳液比未包埋的广藿香精油表现出更好的抑菌活性。
测试例4纳米乳液对细菌生长的影响
以大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739和金色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538为测试细菌，采用纸片扩散法分析实施例1制得的纳米乳液对细菌生长的影响。
具体的分析过程为：分别将大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739和金色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538经过培养，使LB液体培养基中相应细菌的浓度达到107CFU/mL，再分别转接至LB琼脂平板上；将5μL实施例1制得的纳米乳液用移液枪点到直径为6mm的滤纸片上，然后将滤纸片分别放在接种有两种细菌的LB琼脂平板上，在温度为(37±1)℃的条件下培养，每天定点测量并记录抑菌圈直径(DD)，两种细菌的抑菌圈直径(DD)与培养时间的关系图见图7。
从纸片扩散法的结果中可以得出，实施例1制得的纳米乳液具有很强的抑菌能力，供试菌中大肠杆菌ATCC 8739对实施例1制得的纳米乳液最敏感，其抑菌圈直径最大(17.15mm)；实施例1制得的纳米乳液对金黄色葡萄球菌ATCC 6538和大肠杆菌ATCC 8739的抑制圈直径范围分别为7-11mm和10-17mm。结果表明，实施例1制得的纳米乳液表现出较强的抑制大肠杆菌ATCC 8739生长的能力，且实施例1制得的纳米乳液与乳酸链球菌素联用时的抑菌效果比单独的乳酸链球菌素抑菌效果更好，说明实施例1制得的纳米乳液具有一定的缓释作用。
以大肠杆菌(E.coli)ATCC 8739和金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538为测试细菌，采用上述同样的纸片扩散法分析实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液分别对两种细菌的抑菌圈直径范围，测试结果为：实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的抑制圈直径范围分别为6-10mm、6-7mm、6-9mm；实施例5、对比例1和对比例2制得的纳米乳液对大肠杆菌ATCC 8739的抑制圈直径范围分别为9-15mm、8-13mm、9-14mm。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。