具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本发明组合物的一种实施例，本实施例含有以下按重量百分比组成的组分：β-葡聚糖1％、甘露聚糖2％、酵母菌多肽类1％、透明质酸钠0.5％、卡波姆941 1％、甘油3％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量为水。

本实施例中的组合物的制作方法如下：

(1)在搅拌罐中加入适量纯化水，再加入1％卡波姆941，80℃搅拌使溶解，并80℃保温30分钟，开启冷却水，降温；

(2)将β-葡聚糖1％、甘露聚糖2％、酵母菌多肽类1％、透明质酸钠0.5％、甘油3％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量的水加入搅拌罐中使各组分溶解；

(3)将步骤(1)和(2)所得的混合物，混合搅拌10分钟。

实施例2

本发明制备的组合物一种实施例，本实施例中含有以下按重量百分比组成的组分：β-葡聚糖1％、甘露聚糖1％、酵母菌多肽类1％、透明质酸钠0.5％、卡波姆941 1％、甘油3％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量为水。

本实施例中的组合物的制作方法与实施例1相同。

实施例3

本发明制备的组合物一种实施例，本实施例中含有以下按重量百分比组成的组分：β-葡聚糖2％、甘露聚糖1％、酵母菌多肽类1％、透明质酸钠0.5％、卡波姆941 1％、甘油3％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量为水。

本实施例中的组合物的制作方法与实施例1相同。

实施例4

本发明组合物的一种实施例，本实施例含有以下按重量百分比组成的组分：β- 葡聚糖1％、甘露聚糖1％、酵母菌多肽类1％、透明质酸钠0.2％、卡波姆941 1％、甘油2％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量为水。

本实施例中的组合物的制作方法与实施例1相同。

实施例5

本发明组合物的一种实施例，本实施例含有以下按重量百分比组成的组分：β- 葡聚糖1％、甘露聚糖1％、酵母菌多肽类0.5％、透明质酸钠2％、卡波姆941 1％、甘油1％、羟苯甲酯钠0.1％和三乙醇胺1.5％，余量为水。

本实施例中的组合物的制作方法与实施例1相同。

对比例1

本发明组合物的一种对比例，本对比例中与实施例1的区别仅在于制备原料中去除β-葡聚糖。其余组分来源以及组合物的制作方法与实施例1相同。

对比例2

本发明组合物的一种对比例，本对比例中与实施例1的区别仅在于制备原料中去除甘露聚糖。其余组分来源以及组合物的制作方法与实施例1相同。

对比例3

本发明组合物的一种对比例，本对比例中与实施例1的区别仅在于制备原料中去除β-葡聚糖和甘露聚糖。其余组分来源以及组合物的制作方法与实施例1相同。

测试例

1、促进皮肤修复活性测试

(1)促进人皮肤成纤维细胞(HSF)增殖(MTT试验)

取对数生长期细胞，消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基制成浓度为1×10⁵/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔150μL，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h 后，更换培养基为含有100μg/mL实验组、阴性对照组(含等量细胞悬液)和空白对照组 (含等量的1％双抗的DMEM培养液)。试验组分别加入实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3，阴性对照组和空白对照组每孔加入1％双抗的DMEM培养基继续培养。每组设至少3个复孔，振荡均匀后继续培养24h、48h后，吸弃培养基，PBS 洗涤，加入20μLMTT溶液(5mg/mL)/孔，37℃、5％CO₂培养4h，吸弃上清，每孔加入 DMSO 150μL，摇床振荡10min，使结晶物充分溶解。采用酶标仪于490nm处测量各孔的吸光度。同时进行不含样品溶液的空白组的实验，并按照如下所示的计算公式计算增殖存活率，实验重复3次。

增殖存活率(％)＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。

表1

注：与阴性对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^▲P＞0.05

实验组在不同作用时间对HSF增殖存活率结果如表1所示，从表中可以看出，与阴性对照组比较，24、48h实验组对HSF均有增殖促进作用(p＜0.05)，且在给药48h后的作用效果较好。24h对比例3无增殖促进作用(p＞0.05)，24h、48h实施例1对HSF的增殖促进作用明显大于对比例1、对比例2和对比例3，实施例1的增殖促进作用最好，实施例3次之，三个实施例与对比例1(缺酵母β-葡聚糖)、对比例2(缺酵母甘露聚糖)和对比例3(缺酵母β-葡聚糖和酵母甘露聚糖)比较，三个实施例的增殖促进作用有更加明显的优势。同时，酵母β-葡聚糖与酵母甘露聚糖重量比例为1:2时对人皮肤成纤维细胞能够产生较好的增殖促进作用。

(2)促进人皮肤成纤维细胞迁移(细胞划痕试验)

取对数生长期细胞，消化，用含有15％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基制成浓度为1×10⁵/mL的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2mL，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h 后，用1mL移液枪尖端轻轻于各培养孔中央分别笔直划痕，PBS洗涤，加入2mL含有 100μg/mL组合物(实施例1、对照组1、对照组2和对照组3制备的组合物)、15％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，空白组加入2mL含有15％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，各3个复孔，继续培养24h后于倒置显微镜下观察并拍照。

细胞划痕试验结果如图1-4所示，从图中可以看出，加入了实施例1制备的组合物的细胞迁移速度最快，表明对创伤皮肤的愈合效果最显著。

2、自由基清除效果测试

1、实验材料：实施例1和对比例1～3制备的组合物，溶于水中制成含量为5％的水溶液，作为待测样品。

2、实验过程：

(1)羟自由基清除实验：取0.5ml浓度为0.75mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入2ml浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)和1ml待测样品，充分混匀后加入0.5ml浓度为0.75mmol/L的FeSO₄·7H₂O溶液，再次混匀后加入0.5ml浓度为0.01％(v/v)的H₂O₂，于37℃恒温水浴反应60min后，在536nm下分别测定各组混合物溶液的吸光度值，记为Ax，以蒸馏水作为空白组测定吸光度值，记为Ab，以蒸馏水替代H₂O₂作为损伤组，测定吸光度值，记为An，按照公式：羟自由基清除率＝(Ax-An) /(Ab-An)×100％，计算羟自由基清除率。

(2)DPPH自由基清除实验：取3ml浓度为0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液于比色皿中，再加入1ml待测样品，混匀，室温避光反应30min，在517nm波长处测定吸光度值，记为Ax；以3ml无水乙醇和1ml待测样品作为空白对照，测定吸光度值，记为Ab；以3ml 的DPPH无水乙醇溶液和1ml无水乙醇溶液作为对照组，测定吸光度值，记为An，按照公式：DPPH自由基清除率＝[1-(Ax-Ab)/An]×100％，计算DPPH自由基清除率。

表2组合物自由基清除效果测定

注：P均小于0.05。

3、实验结果：DPPH自由基清除结果如表2所示，从表中可以看出，本发明实施例1制备的组合物对羟自由基和DPPH自由基的清除率均在80％以上，可以显著延缓皮肤细胞的老化；而对比例1～3分别改变组合物组分的羟自由基和DPPH自由基清除率显著降低表明本申请方案的技术效果是通过β-葡聚糖和甘露聚糖协同作用实现的。

3、体外透皮吸收试验

采用立式改良Franz扩散池(20mL)及乳猪腹部离体皮肤。离体皮肤固定于样品池与接受池之间，角质层面向样品池，均匀涂抹试验例凝胶，皮肤背面与接受液(0.9％氯化钠注射液)紧密接触(不得有气泡)。有效扩散面积约3cm²，接受系统置于32℃±0.5℃的恒温系统中，电磁搅拌，转速为400转每分。于1h取接受液1mL，同时终止试验，立即取出乳猪皮，清洗表皮残留凝胶后，将接受液定容至10mL。高速离心(10000转/分)5min 后，取上清液滤过即得皮内残留测定溶液。

采用HPLC示差检测方法，按外标法以峰面积计算接受液中的β-葡聚糖和甘露聚糖的含，并计算皮肤透过透皮率。透皮率＝接受液中含量/样品含量×100％。

表3

实验结果如表3所示，从表中可以看出，本发明方案组合物的配方具有明显的协调增效作用。

4、抑菌试验

用于测试实施例1及对比例1-3对口腔致病菌的抑菌性，以牙髓卟啉单胞菌和变形链球菌为例。

将牙髓卟啉单胞菌悬浮于脑心浸液肉汤中，37℃培养48h；变形链球菌悬浮于胰酪胨大豆肉汤中，37℃培养48h；3000r/min离心10min，弃去上清液，菌液备用。将实验分成10组，分别为实施例1、对比例1-3及对照组生理盐水，实施例1和对比例1-3的样品均配制成等菌体浓度的水溶液。将经121℃灭菌15min的直径6mm圆形滤纸片，分别浸泡于各实施例及对比例的水溶液和生理盐水各1ml中，每种溶液5片滤纸片，5min 后取出沥干。用无菌棉签分别蘸取已制备好的牙髓卟啉单胞菌、变形链球菌菌液，在血琼脂板上4个方向轻轻平行交叉划线，均匀涂干。将浸有不同样品溶液的滤纸片分别放于已接种的细菌琼脂平板表面。每个样品均针对每种细菌重复实验6次。将各平板置于 37℃培养箱中培养48h，以游标卡尺测量各板上抑菌环直径。

表4

注：*P均小于0.05。

实验结果如表4所示，从表中可以看出，实施例1对牙髓卟啉单胞菌和变形链球菌的抑制作用最为明显，而卟啉单胞菌属和普雷沃菌属被认为是牙周病原体，口腔微生物在牙齿表明形成牙菌斑是龋齿发生的原因，在牙菌斑长期处于严重酸化的条件下，变形链球菌等嗜酸性微生物会占主导地位，如果从根源上避免牙菌斑的形成和抑制变形链球菌的生长，会显著预防龋齿的形成。实验结果表明实施例1制备的组合物在制备治疗口腔疾病的药物中具有良好的应用前景。

5、临床试验

(1)促进皮肤伤口愈合实验

选择60例浅表划伤患者，随机分成观察组与对照组，每组各30例，患者年龄在20岁～55岁之间。对照组涂抹市购皮肤修复药物，观察组涂抹实施例1，每天在损伤皮肤及周围涂抹2次，涂抹周期共10天。

观察指标：对比两组别患者治疗效果及皮肤功能检测结果。

显效：患者治疗后受损皮肤全部愈合，无疤痕残留。

有效：患者治疗后受损皮肤全部愈合，疤痕得到显著改善。

无效：患者治疗后受损皮肤无改善。

结果：对照组治疗效果明显低于观察组，组间数据无统计学差异(p＜0.05)，患者治疗效果如表5所示：

表5

注：p＜0.05。

从表5中可以看出，观察组对创伤皮肤的修复效果优于对照组，组间数据有统计学意义(p＜0.05)。

选取5岁浅表划伤患者1例，为知情同意患者，涂抹本申请方案实施例1制备的组合物，实验结果如图5所示，从图中可以看出，划伤患者使用3天后，伤口恢复正常。

(2)烫伤涂抹效果

选取烫伤患者1例，为知情同意患者，涂抹本申请方案实施例1制备的组合物，每日3次，以均匀覆盖表面皮肤，实验结果如图6所示，从图中可以看出，烫伤患者使用 10天后，伤口愈合、表面皮肤基本恢复正常。

(3)抑制牙菌斑的形成实验

选择20例20～55岁受试者，通过牙菌斑显示液(武汉伢典生物科技有限公司，商品名为严迪)对比用实施例1制备的组合物刷牙前后牙菌斑在牙齿上的牙菌斑着色效果。实验结果如图7所示，从图中可以看出，每天使用实施例1制备的组合物刷牙2～3分钟后，1个月后附着在牙齿上的红色牙菌斑明显减少，表明本发明方案制备的组合物能够抑制牙菌斑在牙齿表面的形成，可有效预防龋齿、口臭和口腔炎症。

本发明实施例和对比例中使用的酵母β-葡聚糖和酵母甘露聚糖均为市售所得常规产品。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。