一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法 (Method for preparing rhamnosyl fructose by enzyme method ) 是由 葛林 杨成德 苗向阳 严丹红 于 2021-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于糖工程技术领域,具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法及其在催化果糖制备鼠李糖基果糖的方法应用,所述α-L-鼠李糖具有具有反向水解能力,当以L-鼠李糖为糖基供体,果糖为糖基受体时,该酶能反向水解合成新型二糖鼠李糖基果糖,摩尔转化率为23.4%。通过本发明制备的α-L-鼠李糖苷酶具有反向水解活性,可应用于新型二糖鼠李糖基果糖的酶法制备,并且温度稳定性较好,摩尔转化率较高。(The invention belongs to the technical field of sugar engineering, and particularly relates to a preparation method of alpha-L-rhamnosidase and application of the alpha-L-rhamnosidase in a method for preparing rhamnosyl fructose by catalyzing fructose, wherein the alpha-L-rhamnose has reverse hydrolysis capacity, and when L-rhamnose is taken as a glycosyl donor and fructose is taken as a glycosyl acceptor, the enzyme can be subjected to reverse hydrolysis to synthesize novel disaccharide rhamnosyl fructose, and the molar conversion rate is 23.4%. The alpha-L-rhamnosidase prepared by the invention has reverse hydrolysis activity, can be applied to the enzymatic preparation of novel disaccharide rhamnosyl fructose, and has good temperature stability and high molar conversion rate.)
技术领域
本发明属于糖工程技术领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法及其在催化果糖制备鼠李糖基果糖的方法应用。
背景技术
低聚糖在自然界中广泛分布，在膜结构调节、细胞-细胞识别、通讯、细胞粘附和病毒感染等许多过程中发挥着重要作用。传统的化学合成低聚糖需要采取复杂的步骤来控制反应的立体性和区域特异性。相比之下，通过酶合成低聚糖具有一步完成、特异性强、环境友好等优点。糖基转移酶和糖苷水解酶可用于合成特定的低聚糖。利用糖基转移酶合成低聚糖，需要使用到昂贵的糖基供体，而利用糖苷水解酶合成低聚糖只需要使用廉价易得的糖基供体，因此，对于大规模生产低聚糖，糖苷水解酶比糖基转移酶更有利。
α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的糖苷水解酶，可以水解许多天然产物的非还原性鼠李糖残基，少部分来源的α-L-鼠李糖苷酶具有反向水解能力，能反向水解合成含有鼠李糖基的化合物。如来源于土曲霉Aspergillus terreus CCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶能通过反向水解将L-鼠李糖连接到芳香醇上。
从肺炎克莱贝菌Klebsiella pneumoniae和克莱贝菌Klebsiella planticola培养物中获得的富含鼠李糖基的低聚糖和多糖可以保护正常人类真皮成纤维细胞预防AGE(晚期糖基化终产物)诱导的细胞毒性。这表明在对抗高血糖诱导的细胞毒性作用方面的潜在治疗应用，如对 II 型糖尿病的治疗。此外，来源于肖韶子Dimocarpus fumatus茎皮的两种含有长链脂肪醇糖苷的鼠李糖在体外对口腔上皮癌 KB 细胞有细胞毒活性。尽管含有鼠李糖基的化合物有很多特殊活性，但目前用酶法合成的鼠李糖基化合物很少。这可能归因于具有广泛受体特异性的α-L-鼠李糖苷酶的缺乏。目前还没有酶法合成含有鼠李糖基化合物的相关专利。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法。
本发明包括以下技术方案：
一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，利用具有糖基化活性的α-L-鼠李糖苷酶制备鼠李糖基果糖。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，所述α-L-鼠李糖苷酶来源于米曲霉Aspergillus oryzae，由以下步骤制备获得：
a、米曲霉Aspergillus oryzae在发酵时，通过添加适量的L-鼠李糖或芦丁或柚皮苷或橘皮苷进行诱导，获得粗酶液；
b、粗酶液通过超滤、DEAE SFF 阴离子柱和 Superdex 200 10/300 GL 分子筛纯化后获得电泳纯的α-L-鼠李糖苷酶。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，所述步骤a具体包括以下步骤：
先用PDA培养基活化菌株，然后将活化的Aspergillus oryzae孢子用无菌生理盐水重悬，接种3 mL于250 mL液体诱导培养基中，28℃，180 r/min恒温振荡培养7 days；
所述液体诱导培养基的配方为：0.5 g/L KCl，1.5 g/L KH2PO4，4 g/L NH4Cl，5g/L 酵母提取物，1 g/L 酪蛋白氨基酸，5 g/L 诱导物，1 mL/L Vishniac微量元素，调节培养基的pH为6.0。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，所述诱导物为L-鼠李糖。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，所述步骤b具体包括以下步骤：
4℃，12000 rpm 离心收集上清得粗酶，随后进行分离纯化：
（1）用分子量10 000 Da的超滤膜浓缩至15 mL，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液分四次透析，每次透析6 h；
（2）透析过的粗酶加到装好的DEAE SFF 柱子中，柱子结合的蛋白用浓度0-1 mol/L 的NaCl梯度洗脱；
（3）分步收集洗脱液，测酶活并用SDS-PAGE 蛋白电泳检测目的蛋白条带；
（4）取合适浓度的NaCl洗脱下的酶液，浓缩至300 μL，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液分四次透析，每次透析6 h；
（5）透析过的粗酶加到装好的Superdex 200 10/300 GL ChromatographicSeparation Column柱子中，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，流速0.3 mL/min平衡并洗脱。
（6）收集洗脱液，测酶活并用SDS-PAGE 蛋白电泳检测目的蛋白条带，选取高纯度样品在 4℃下于pH 4.5 的 20 mmol/L 柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液分四次透析，每次透析6 h。加入甘油至 30%后混匀，-20℃下保存备用。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，包括以下步骤：
向反应体系中添加0.05-1.0 mol/L 的果糖和0.05-3.0mol/L的L-鼠李糖，控制α-L-鼠李糖苷酶浓度为1-10U/mL，添加pH为3.0-7.0的缓冲液，控制反应温度为40-80℃，在水浴中反应12 -72h，即获得鼠李糖基果糖。
进一步的，上述一种酶法制备鼠李糖基果糖的方法，合成鼠李糖基果糖的pH 为4.5；合成鼠李糖基果糖的温度为65℃；合成鼠李糖基化果糖的果糖添加量为0.1 mol/L，鼠李糖添加量为0.2 mol/L；合成鼠李糖基果糖的反应时间为36 h，α-L-鼠李糖苷酶的浓度为2U/mL。
进一步的，由上述酶法制备得到的鼠李糖基果糖。
进一步的，上述鼠李糖基果糖的质量检测方法，包括以下步骤：
使用高效液相色谱-蒸发光散射发检测，检测条件为：色谱柱：PrevailCarbohydrate ES column（5 μm；4.6 × 250 mm）；进样量：10 μL；流动相：乙腈：超纯水=70:30（V:V）；时间：15 min。
进一步的，上述鼠李糖基果糖的质量检测方法，包括以下步骤：使用LC-MS进行检测，质谱仪器型号： Waters LTQ Orbitrap XL LC/MS ；N2 气流速： 5 L/min，电压：3.5kV，压力：25 psi，温度：300℃。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明公开了一种通过诱导剂诱导野生菌Aspergillus oryzae生产α-L-鼠李糖苷酶的方法，发现该酶的最适反应温度为65℃，温度稳定性较好。
2. 本发明第一次利用具有反向水解能力的α-L-鼠李糖苷酶制备新型二糖鼠李糖基果糖，最高摩尔转化率能达到23.4 %，是目前首次报道合成新型二糖鼠李糖基果糖。
3. 本发明探索并公开了酶转化果糖为鼠李糖基果糖的最佳反应条件。
附图说明
图1为酶法转化果糖为鼠李糖基果糖示意图；
图2为不同诱导剂对α-L-鼠李糖苷酶产量的影响；
图3为α-L-鼠李糖苷酶纯化过程的SDS-PAGE图（M：标准蛋白；1：超滤后的粗酶；2：使用DEAE SFF 阴离子柱分离后的酶；3：使用Superdex 200 10/300 GL 分子筛处理过的酶）；
图4为不同反应条件对鼠李糖基果糖产量的影响；
图5为鼠李糖基果糖的HPLC-ELSD检测图谱；
图6为鼠李糖基果糖的LC-MS检测图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。附图1为本发明的酶法转化果糖为鼠李糖基果糖示意图。
实施例1
诱导Aspergillus oryzae产α-L-鼠李糖苷酶诱导物的筛选。
Aspergillus oryzae液体培养基配方为：0.5 g/L KCl，1.5 g/L KH2PO4，4 g/LNH4Cl，5 g/L 酵母提取物，1 g/L 酪蛋白氨基酸，5 g/L 诱导物，1 mL/L Vishniac微量元素，调节培养基的pH为6.0。先用PDA培养基活化菌株，然后将活化的Aspergillus oryzae孢子用无菌生理盐水重悬，接种3 mL于250 mL液体诱导培养基中，28℃，180 r/min恒温振荡培养7 days。分别选取芦丁、L-鼠李糖、柚皮苷和橘皮苷作为诱导Aspergillus oryzae生产α-L-鼠李糖苷酶的诱导物。结果显示以L-鼠李糖为诱导物时，Aspergillus oryzae的产酶量最高，酶活为1.6 U/mL（如附图2所示）。
实施例2
Aspergillus oryzae α-L-鼠李糖苷酶的纯化。
以L-鼠李糖作为诱导物进行定向产酶。4℃，12000 rpm 离心收集上清得粗酶。粗酶的分离纯化：（1）用分子量10 000 Da的超滤膜（Millipore, Billerica, MA, USA）浓缩至15 mL，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液分四次透析，每次透析6 h。（2）透析过的粗酶加到装好的DEAE SFF 柱子中，柱子结合的蛋白用浓度0-1 mol/L 的NaCl梯度洗脱；（3）分步收集洗脱液，测酶活并用SDS-PAGE 蛋白电泳检测目的蛋白条带；（4）取合适浓度的NaCl洗脱下的酶液，浓缩至300 μL，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液分四次透析，每次透析6 h。（5）透析过的粗酶加到装好的Superdex 200 10/300 GL ChromatographicSeparation Column（10×300 mm, GE Healthcare）柱子中，用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，流速0.3 mL/min平衡并洗脱。（6）收集洗脱液，测酶活并用SDS-PAGE 蛋白电泳检测目的蛋白条带，选取高纯度样品在 4℃下于pH 4.5 的 20 mmol/L 柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液分四次透析，每次透析6 h。加入甘油至 30%后混匀，-20℃下保存备用。SDS-PAGE检测结果如附图3所示。
实施例3
酶法催化转化果糖制备鼠李糖基果糖的工艺研究。
为了获得Aspergillus oryzae来源α-L-鼠李糖苷酶合成鼠李糖基化果糖的最适pH、最适温度、最适L-鼠李糖含量及最适反应时间，设置了如下实验：
不同pH 对α-L-鼠李糖苷酶合成鼠李糖基化果糖的影响：向50 μL 反应体系中添加0.1 mol/L 的果糖，0.3 mol/L鼠李糖，控制酶浓度为2 U/mL，添加50 mmol/L pH 分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液，并且控制温度在60℃，在水浴中反应18 h，样品处理后使用HPLC-ELSD 检测果糖的残留量。
不同温度对α-L-鼠李糖苷酶合成鼠李糖基化果糖的影响：向50 μL 反应体系中添加0.1 mol/L 的果糖，0.3 mol/L 鼠李糖，控制酶浓度为2 U/mL，添加50 mmol/L pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，控制温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃，在水浴中反应18 h，样品处理后使用HPLC-ELSD 检测果糖的残留量。
不同L-鼠李糖添加量对α-L-鼠李糖苷酶合成鼠李糖基化果糖的影响：向50 μL 反应体系中添加0.1 mol/L 的果糖，控制酶浓度为2 U/mL，添加50 mmol/L pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，温度控制在65℃，分别添加鼠李糖为0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L、0.35 mol/L、0.4 mol/L、0.45 mol/L和0.5mol/L，在水浴中反应18 h，样品处理后使用HPLC-ELSD 检测果糖的残留量。
不同反应时间对α-L-鼠李糖苷酶合成鼠李糖基化果糖的影响：向50 μL 反应体系中添加0.1 mol/L 的果糖，0.2 mol/L 鼠李糖，控制酶浓度为2 U/mL，添加50 mmol/L pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，温度控制在65℃，在水浴中分别反应6 h、12 h、18 h、24h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h和60 h，样品处理后使用HPLC-ELSD 检测果糖的残留量。
结果如附图4所示，合成鼠李糖基化果糖的最适pH 为4.5；合成鼠李糖基化果糖的最适温度为65℃；合成鼠李糖基化果糖的最适鼠李糖添加量为0.2 mol/L；合成鼠李糖基化果糖的最佳反应时间为36 h，最高转化率达到23.4%。
实施例4
果糖糖基化反应后 HPLC-ELSD和LC-MS检测结果。
果糖糖基化反应后使用高效液相色谱-蒸发光散射发（HPLC-ELSD）检测，检测条件为：色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column（5 μm；4.6 × 250 mm）；进样量：10 μL；流动相：乙腈：超纯水=70:30（V:V）；时间：15 min。结果如图附5所示，糖基化反应后有新的产物鼠李糖基果糖生成。
鼠李糖基果糖使用LC-MS进行检测，质谱仪器型号： Waters LTQ Orbitrap XLLC/MS， N2 气流速： 5 L/min，电压：3.5 kV，压力：25 psi，温度：300℃。结果如附图6所示，鼠李糖基果糖的分子量为326，这与理论分子量相符。
上述实施例1-4说明通过本发明制备的α-L-鼠李糖苷酶具有反向水解活性，可应用于新型二糖鼠李糖基果糖的酶法制备，并且温度稳定性较好，摩尔转化率较高。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
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