具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种全液相合成地洛瑞林的方法，包括：

S1)将R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH与H-Arg(pbf)-Pro-NHEt进行缩合反应，得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt；R₃与R₄为氨基保护基团；

S2)将所述R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt在切割液中进行反应，得到地洛瑞林。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售或自制均可。

在本发明中，所述H-Arg(pbf)-Pro-NHEt优选按照以下方法制备：将R₅-Arg(pbf)-OH与H-Pro-NHEt·HCl进行缩合反应后，脱除R₅保护基，得到H-Arg(pbf)-Pro-NHEt；其中R₅为氨基保护基团，优选为Fmoc、Z或Boc；所述R₅-Arg(pbf)-OH与H-Pro-NHEt·HCl的摩尔比优选为1：(1.05～2)，更优选为1：(1.05～1.5)；所述缩合反应优选在有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述H-Pro-NHEt·HCl、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～2.4)：(1～1.2)，更优选为1：(1～2.2)：(1～1.05)；进一步还优选在活化剂存在的条件下进行；所述H-Pro-NHEt·HCl与活化剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中优选先将R₅-Arg(pbf)-OH、缩合剂在冰浴条件下与有机溶剂及部分有机碱混合，然后室温反应，然后加入包含H-Pro-NHEt·HCl与有机碱的有机溶剂，进行缩合反应；所述室温反应的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，再优选为20min；所述缩合反应的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，再优选为2h；缩合反应后，优选加入酸性溶液析出固体；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.5～1mol/L；在本发明中优选过滤、将固体干燥后脱除R₅保护基；所述脱除R₅保护基的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，在本发明中脱除R₅保护基所用的试剂优选为三氟乙酸(TFA)、氯化氢溶液、二乙胺、哌嗪与哌啶中的一种或多种；可根据R₅的种类进行选择，当R₅为Fmoc时，优选以二乙胺为脱保护试剂；当R₅为Boc时，优选以TFA为脱保护试剂；当R₅为Z时，可通过接触还原法进行脱保护；脱除R₅保护基后，优选浓缩，加入醚析出固体，过滤，干燥后得到H-Arg(pbf)-Pro-NHEt；所述醚优选为石油醚、异丙醚与乙醚中的一种或多种，更优选为石油醚。

在本发明中，所述R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH优选按照以下方法制备：将R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂水解，得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH；其中R₂为羧基保护基团，优选为Me、Et或Tr；R₃为氨基保护基团，优选为Boc或Trt；R₄为氨基保护基团，优选为Fmoc、Z或Boc；所述水解优选在醇溶剂中进行；所述醇溶剂优选为甲醇和/或乙醇；所述水解优选为碱性条件下进行；所述碱性条件优选以碱金属氢氧化物的水溶液提供，更优选为氢氧化钠水溶液和/或氢氧化钾水溶液；所述碱金属氢氧化物水溶液的浓度优选为1～3mol/L，更优选为1.5～2.5mol/L，再优选为2mol/L；所述碱金属氢氧化物与R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂的摩尔比优选为1.5～20：1，更优选为2～15：1，再优选为3～10：1，最优选为3～5：1；所述水解的时间优选为2～4h，更优选为3h；水解后，加入酸性溶液，沉淀，过滤，洗涤至中性后，得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.1～0.2mol/L。

在本发明中，所述R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂按照以下方法制备：将R₄-Pyr-OH与H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂进行缩合反应，得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述R₄-Pyr-OH与H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂的摩尔比优选为(1.05～2)：1；所述缩合反应优选在有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述R₄-Pyr-OH、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)：(1～1.05)；进一步还优选在活化剂存在的条件下进行；所述R₄-Pyr-OH与活化剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中，优选先将R₄-Pyr-OH与缩合剂溶于有机溶剂后，加入有机碱，然后再加入H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂的有机溶剂溶液进行缩合反应；所述缩合反应的时间优选1～3h，更优选为1.5～2h；缩合反应后，过滤，用酸性溶液沉淀，过滤收集固体洗涤至中性后，得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.5mol/L。

在本发明中，所述H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂优选按照以下方法制备：Fmoc-His(R₃)-OH与H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂进行缩合反应后，脱除Fmoc保护基，得到H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述Fmoc-His(R₃)-OH与H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂的摩尔比优选为(1.05～2)：1；所述缩合反应优选在活化剂与缩合剂存在的条件下进行；所述Fmoc-His(R₃)-OH、活化剂、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)：(1～1.05)；进一步还优选在有机碱存在的条件下进行；所述Fmoc-His(R₃)-OH与有机碱的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中，优选先将Fmoc-His(R₃)-OH、H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂与活化剂在有机溶剂中溶解后冷浴，加入缩合剂进行反应，过滤加入乙二胺继续反应；所述冷浴的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述反应的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2h；所述继续反应的时间优选为10～30min，更优选为20min；继续反应后优选加入酸性溶液析出固体，过滤，干燥；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.5mol/L；将干燥得到的固体脱除Fmoc保护基；所述脱除Fmoc保护基的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选以二乙胺、哌嗪与哌啶中的一种或多种为脱保护试剂；脱除Fmoc保护基后，优选浓缩，加入醚析出固体，过滤，干燥后得到H-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述醚优选为石油醚、异丙醚与乙醚中的一种或多种，更优选为石油醚。

在本发明中，所述H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂优选按照以下方法制备：将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH与H-D-Trp-Leu-OR₂进行缩合反应后，脱除Fmoc保护基，得到H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH与H-D-Trp-Leu-OR₂的摩尔比优选为1：(1.05～2)；所述缩合反应优选在有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述H-D-Trp-Leu-OR₂、活化剂、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.2)：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)：(1～1.05)：(1～1.05)；进一步还优选在活化剂存在的条件下进行；所述H-D-Trp-Leu-OR₂与活化剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中，优选先将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH与缩合剂在有机溶剂中溶解后冷浴，加入有机碱，再加入H-D-Trp-Leu-OR₂的有机溶剂溶液进行缩合反应；所述冷浴的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述缩合反应的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h；缩合反应后，优选浓缩，加入酸性溶液沉淀，过滤，干燥；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.5mol/L；将干燥后的固体脱除Fmoc保护基；所述脱除Fmoc保护基的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选以二乙胺、哌嗪与哌啶中的一种或多种为脱保护试剂；脱除Fmoc保护基后，优选浓缩，加入醚析出固体，过滤，干燥后得到H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OR₂；所述醚优选为石油醚、异丙醚与乙醚中的一种或多种，更优选为石油醚。

在本发明中，所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH优选按照以下方法制备：将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu与H-Tyr(tBu)-OH进行缩合反应，得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；所述Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu与H-Tyr(tBu)-OH的摩尔比优选为1：(1.05～2)；所述缩合反应优选在有机碱存在的条件进行；所述H-Tyr(tBu)-OH与有机碱的摩尔比优选为1：1.2，更优选为1：1.05，再优选为1：1；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自DMF、THF、甲醇、乙醇与NMP中的一种或多种；在本发明中，此步骤优选先将Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Osu溶于有机溶剂后，依次加入H-Tyr(tBu)-OH与有机碱进行缩合反应；所述缩合反应的时间优选为40～80min，更优选为50～70min，再优选为60min；缩合反应后，优选加入酸性溶液快速搅拌析出；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L；然后优选过滤、洗涤至中性，干燥，得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；所述干燥的温度优选为30℃～35℃。

在本发明中，所述H-D-Trp-Leu-OR₂优选按照以下方法制备：将R₁-D-Trp-OH与H-Leu-OR₂进行缩合反应，脱除R₁保护基团，得到H-D-Trp-Leu-OR₂；其中R₁为氨基保护基团，优选为Fmoc、Z或Boc；R₁-D-Trp-OH与H-Leu-OR₂的摩尔比优选为1：(1.05～2)；所述缩合反应优选在活化剂、有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述H-Leu-OR₂、活化剂、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.2)：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)：(1～1.05)：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中，此步骤优选具体为：将R₁-D-Trp-OH与活化剂溶于有机溶剂，得到第一溶液；将H-Leu-OR₂溶于有机溶剂后冷浴，加入有机碱，得到第二溶液；将第一溶液与第二溶液混合后继续冷浴，再加入缩合剂进行反应；所述冷浴的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述继续冷浴的时间优选为5～10min；所述缩合反应的时间优选为1～2h，更优选为1.5h；缩合反应后，优选过滤，在滤液中加入酸性溶液析出固体，过滤、水洗至中性，干燥；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L；将干燥后的固体脱除R₁保护基团；所述脱除R₁保护基的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，在本发明中脱除R₁保护基所用的试剂优选为三氟乙酸(TFA)、氯化氢溶液、二乙胺、哌嗪与哌啶中的一种或多种；可根据R₁的种类进行选择，当R₁为Fmoc时，优选以二乙胺为脱保护试剂；当R₁为Boc时，优选以TFA为脱保护试剂；当R₁为Z时，可通过接触还原法进行脱保护；脱除R₁保护基团可在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为DMF、甲醇、乙醇、DCM与THF中的一种或多种；脱除R₁保护基后，优选浓缩，加入醚析出固体，过滤，干燥后得到H-D-Trp-Leu-OR₂；所述醚优选为石油醚、异丙醚与乙醚中的一种或多种，更优选为石油醚。

将R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH与H-Arg(pbf)-Pro-NHEt进行缩合反应；所述R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH与H-Arg(pbf)-Pro-NHEt的摩尔比优选为1：(1.05～2)；所述缩合反应优选在有机碱与缩合剂存在的条件下进行；所述H-Arg(pbf)-Pro-NHEt、有机碱与缩合剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)：(1～1.05)；进一步还优选在活化剂存在的条件下进行；所述H-Arg(pbf)-Pro-NHEt与活化剂的摩尔比优选为1：(1～1.2)，更优选为1：(1～1.05)；所述活化剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为HOSu、HOBt、HOAt与HOOBt中的一种或多种；所述有机碱优选为DIEATEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂为本领域技术人员熟知的多肽合成常用的缩合剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为THF、DCM、DMF、NMP与二氧六环中的一种或多种；在本发明中，此步骤优选具体为：先将R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH与缩合剂在有机溶剂中溶解后，冷浴，加入有机碱，再加入H-Arg(pbf)-Pro-NHEt的有机溶剂溶液进行缩合反应；所述冷浴的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述缩合反应的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h；缩合反应后，优选加入酸性溶液析出固体，过滤、洗涤至中性后，干燥得到R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt；所述酸性溶液优选为盐酸溶液；所述酸性溶液的浓度优选为0.3～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L。

将所述R₄-Pyr-His(R₃)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt在切割液中进行反应；所述切割液优选包括TFA、TIS与H₂O；所述TFA、TIS与H₂O的体积比优选为(94～96)：(2～3)：(2～3)，更优选为95：2.5：2.5；所述反应的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，再优选为30min；反应后，优选用冷冻乙醚沉淀、过滤，得到地洛瑞林。

本发明通过全液相合成法，生产工艺绿色、温和，没有使用任何剧毒、易制毒试剂，并且生产的产品纯度高，粗品可达90％以上，成本极大降低，非常适合大规模生产。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种全液相合成地洛瑞林的方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售；在本发明中如无特殊说明，所述冷浴均为冰浴。

本发明权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1。

表1中英文对照表

实施例1

1、合成化合物1：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH

1.1投料：

按照表2的物料进行投料。

表2物料种类及用量

1.2操作过程

将合成Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OSu用DMF完全溶解后，再准确称取H-Tyr(tBu)-OH加入上述反应瓶，加TEA 110mmol开始反应。搅拌反应60min后，HPLC检测反应完全。

将反应液分两次倒入三角瓶中，再加入0.5M盐酸快速搅拌析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，30℃干燥。收集固体装至容器中，称重。

利用HPLC对得到的化合物1进行分析，得到液相色谱图如图1所示。

化合物1的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,70％B～90％B；

收率：97％；纯度：87.5％。

2、合成化合物2：Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl

2.1投料

按照表3的物料进行投料。

表3物料种类及用量

2.2操作过程：

准确称取Fmoc-D-Trp-OH、HOSU于反应瓶中，用DMF完全溶解后，再称取H-Leu-OMe.HCl于三角瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入TEA，快速摇匀，加入上述反应瓶中，继续冷浴5min后加入DCC开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全。

待完全反应后过滤反应液，用0.5M盐酸水溶液析出，过滤的固体，然后用纯化水洗至中性，30℃干燥。收集固体装至三角瓶中，称重。

利用HPLC对得到的化合物2进行分析，得到液相色谱图如图2所示。

化合物2的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B；

收率：103.6％，纯度：94.1％。

3、合成化合物3：H-D-Trp-Leu-OMe

3.1按照表4投料。

表4物料用量及种类

3.2操作过程

准确称取Fmoc-D-Trp-Leu-OMe.HCl于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥，得到化合物3。

利用HPLC对得到的化合物3进行分析，确定得到目标产物。化合物3的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，3％B～10％B；

收率：89.2％；纯度：89.4％。

4、合成化合物4：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

4.1投料：

表5物料用量及种类

4.2操作过程

准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-D-Trp-Leu-OMe用DCM溶解后加入反应中开始反应。反应1.0h后HPLC检测反应完全，浓缩，用0.5M盐酸沉淀，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，称重，得到化合物4。

利用HPLC对得到的化合物4进行分析，确定得到目标产物。化合物4的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B；

收率：92.3％；纯度：81％。

5、合成化合物5：H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

5.1投料

按照表6的物料投料。

表6物料用量及种类

5.2操作过程

准确称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥。

利用HPLC对得到的化合物5进行分析，确定得到目标产物。化合物5的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min；70％B～90％B；

收率：97％；纯度：85.4％。

6、合成化合物6：H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

6.1投料

按照表7的物料进行投料。

表7物料用量及种类

6.2操作过程

准确称取Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DCC开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全，过滤反应液，倒入反应瓶中，再加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入0.5M盐酸溶液析出固体，过滤，烘干。

取Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，烘干，得到化合物6。收率：85％，纯度：81.8％。

利用HPLC对得到的化合物6进行分析，得到液相色谱图如图3所示。

化合物6的分析方法为：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，70％B～90％B。

7.合成化合物7：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe

7.1投料

按照表8的物料进行投料。

表8物料用量及种类

7.2操作过程

准确称取Boc-Pyr-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe用DMF溶解后加入反应中开始反应。

反应1.5h后HPLC检测反应完全，过滤反应液，滤渣用DMF洗涤两次，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重；收率：81％，纯度：85.1％。利用以下检测条件确定得到目标产物。

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，80％B～95％B。

8、合成化合物8：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH

8.1投料

Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe 59.8mmol；

甲醇：1110ml；

2M NaOH:110ml；

0.1M盐酸溶液：2L。

8.2操作过程

称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OMe，置于甲醇中搅拌5min完全溶解后，取2M NaOH缓慢加入反应，开始反应。反应3h后HPLC检测反应完全，加入盐酸溶液，沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重，得到化合物8；收率：74％，纯度：88.9％。

利用HPLC对得到的化合物8进行分析，确定得到目标产物。检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,70％B～90％B。

9、合成化合物9：Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt

9.1投料

表9物料用量及种类

9.2操作过程

准确称取Fmoc-Arg(pbf)-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min，加入DIEA，撤掉冷浴，反应20min。

称取H-Pro-NHEt.HCl于三角瓶中，用DMF完全溶解后加入TEA，快速混匀后加入上反应中开始反应。

反应2h后HPLC检测反应完全，用0.5M盐酸沉淀，过滤后收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重；收率112％，纯度：99.4％。

利用HPLC对得到的化合物8进行分析，得到液相色谱图如图4所示。

检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min，50％B～90％B。

10、合成化合物10：H-Arg(pbf)-Pro-NHEt

10.1投料

Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt.HCl：150mmol；

二乙胺：500ml。

10.2操作过程

准确称取Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt.HCl于反应瓶中，加入二乙胺反应20min，浓缩至少量，加入石油醚析出固体，过滤，真空干燥，得到化合物10。收率88％，纯度70％。

利用HPLC对得到的化合物10进行分析，得到液相色谱图如图5所示。

检测方法：

流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％TFA/乙腈；

检测波长：210nm；流速：1ml/min；固定相：C18色谱柱，5μ，

梯度：0～30min,5％B～50％B。

11、合成化合物11：Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt

11.1投料

表10物料用量及种类

11.2操作过程

准确称取Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-OH、BOP于反应瓶中，用DMF完全溶解后冷浴10min后加入DIEA，再将H-Arg(pbf)-Pro-NHEt用DMF溶解后加入反应中开始反应。

反应1.0h后HPLC检测反应完全，加入0.5M盐酸析出固体，过滤收集固体，然后用纯化水洗至中性(pH试纸检测)，干燥，称重，得到化合物11。收率102.1％，纯度：74.9％。

利用HPLC对得到的化合物11进行分析，得到液相色谱图如图6所示。

12、合成地洛瑞林粗品

12.1投料

Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHE t：44.2mmol；

切割液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)：300ml。

12.2操作过程

将Boc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt加入反应瓶中，加入切割液反应30min后用冷冻乙醚沉淀，过滤，收集固体，得到产物粗品，产物用水溶解后HPLC检测分析。

收率：79.7％，纯度93.1％。