金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用
阅读说明：本技术 金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用 (Staphylococcus aureus alpha-toxin specific antibody and application thereof ) 是由 赵子渊 张瀞文 曹一孚 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本揭示涉及与金黄色葡萄球菌α-毒素特异结合的抗体或抗原结合片段。本揭示还涉及一种医药组合物、一种所述的抗体或抗原结合片段的用途,其是用于制备治疗和/或预防一所需个体中由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和/或病症的药物、一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂盒、一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法以及一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂盒。(The present disclosure relates to antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind to staphylococcus aureus alpha-toxin. The disclosure also relates to a pharmaceutical composition, the use of one of said antibodies or antigen binding fragments for the preparation of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease and/or condition caused by a staphylococcus aureus infection in a subject in need thereof, a kit for detecting staphylococcus aureus alpha-toxin in a sample, a method for detecting staphylococcus aureus alpha-toxin in a sample and a kit for detecting staphylococcus aureus alpha-toxin in a sample.)
技术领域
本揭示涉及金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体或抗原结合片段及其用途。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种机会致病菌，通常在人体内无症状携带。致病菌株通常通过产生强大的蛋白毒素和其他逃避人类免疫系统的毒力因子来促进感染。金黄色葡萄球菌可引起一系列疾病，从轻微的皮肤感染到危及生命的疾病，如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征、菌血症和败血症。它仍然是五种最常见的医院感染原因之一，并且经常是手术后伤口感染的原因。
耐抗生素金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现是一个世界性的临床医学问题。目前关于MRSA毒力机制的概念包括一系列显著的细胞表面和分泌毒力因子。细胞表面毒力因子包括识别粘附基质分子的微生物表面成分(microbial surface components recognizingadhesive matrix molecules，MSCRAMMs)、铁调节蛋白、细胞间多醣粘附素和荚膜多醣。所述分泌的毒力因子通常在指数生长后期和稳定期产生，包括外酶、外毒素α、β、γ和δ毒素、潘顿-瓦伦丁白细胞介素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)、超抗原、毒性休克综合征毒素1(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)和脱落毒素(exfoliative toxins)A和B。
α-毒素(alpha-toxin，AT)是一种细胞溶解性成孔毒素，在金黄色葡萄球菌临床分离株中具保留性，并已被证明在肺炎、皮肤坏死、心内膜炎和败血症中起作用。AT是一种可在真核细胞表面组装成环状结构的可溶性单体蛋白。组装好的毒素可插入细胞膜，形成一个孔，破坏细胞膜的完整性，从而导致细胞损伤和死亡。几十年来，毒素作为免疫预防的靶点，并作为疫苗或被动免疫疗法的一部分，对白喉、破伤风和肉毒杆菌中毒等细菌性疾病已经取得了成功。与有时需要反复强化和长时间才能产生最大的免疫反应的主动免疫不同，被动免疫为未接种疫苗的患者提供即时治疗，以帮助降低急性金黄色葡萄球菌病的严重程度。
因此，需要开发一种治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的新方法。
发明内容
本揭示提供一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素表位或其片段。根据本揭示的抗体可用于治疗和/或预防由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和/或病症。本揭示的抗体也可用于检测金黄色葡萄球菌α-毒素。
本揭示提供一种医药组合物，其包含上述抗体或抗原结合片段及医药上可接受的载体或赋形剂。
本揭示提供一种用于治疗和/或预防一所需个体中由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向所述个体施用一医药物组合物，所述医药组合物包含上述的抗体或抗原结合片段。
本揭示提供一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法，包括将所述样品与上述的抗体或抗原结合片段接触。
本揭示提供一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂盒，其包括上述的抗体或抗原结合片段。
本发明将于下述段落中详述，本发明的其他特征、目的及优点可见于实施方式及申请专利范围中。
图式简单说明
图1：抗α-毒素单克隆抗体提高了A549细胞在α-毒素存在下的细胞活力。将浓度为4和40μg/ml的纯化抗体加入到8μg/mlα-毒素存在下的细胞溶解试验中，以获得1:0.1(4μg/ml)或1:1(40μg/ml)的α-毒素抗体比。用MTT比色法检测细胞活力。“＊”显示抗体具有防止α-毒素诱导的细胞溶解能力。
图2：小鼠25A1单克隆抗体结合至α-毒素。在Biacore T100的活性流细胞上捕获的25A1抗原结合谱。在1.56～50nM的浓度范围内，线代表了25A1对α-毒素的结合反应。
图3(A)各种抗α-毒素VH和VL结构域的氨基酸序列。人类种系的IGHV1-2和IGVK3-11序列用于嫁接。小鼠抗体和人类种系的氨基酸序列差异用下底线表示；CDR残基用外框标记；反向突变用粗斜体标记。图3(B)抗体与重组α-毒素结合动力学的SPR传感器图。结合动力学采用BIAcore T200单循环动力学法测定。图3(C)25A1-B5B6AQT的氨基酸序列。
图4:25A1、25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT抑制重组α-毒素或天然α-毒素诱导的兔红血球细胞裂解。抗体系列稀释液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78mg/mL)与重组α-毒素(400ng/mL)或粗菌上清液(1:8～1:16稀释度)与兔红血球细胞共同孵育。溶血是通过上清液中血红蛋白的释放量来衡量的。溶血抑制率计算为((2％TritonX-100的OD450–试验抗体的OD450)/2％TritonX-100的OD450)×100％。
图5：给予SYN100的金黄色葡萄球菌BAA-1717感染小鼠的Kaplan-Meir生存曲线。在第0天静脉注射USA300 MRSA、BAA-1717，接种量为8x 107CFU/只小鼠。在感染前二十四(24)小时腹腔注射50、25、10和5mg/kg的25A1。感染前24小时腹腔注射25和10mg/kg的对照抗体。动物死亡率监测10天。与溶媒对照组相比，50％或更多(50％)的动物存活表明具有显著的抗感染活性。
图6：给予SYN100的金黄色葡萄球菌BAA-1556、NRS261和SF8300感染小鼠的Kaplan-Meir生存曲线。SYN100预防性治疗可提高小鼠肺炎模型的存活率。在第0天将接种量为1.62x 107CFU/小鼠的BAA-1556、接种量为3.3×107CFU/小鼠的NRS261或接种量为2.82x 107CFU的SF8300经鼻接种C57BL/6J小鼠。在感染前二十四(24)小时对于BAA-1556感染小鼠，25A1-B5B6AQT以10、5和1mg/kg的剂量腹腔注射，对于NRS261和SF8300感染小鼠，以100、50和10mg/kg的剂量给药，並对感染动物的存活率进行7天的监测。
具体实施方式
本揭示提供一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素表位或其片段。
在下面的描述中，使用了许多术语，并提供了以下定义，以便于理解所要求保护的主题。此处未明确定义的术语应按照其简单和普通的含义使用。
除非另有规定，否则“一”表示“一个或多个”
如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的抗原上的位点。
本文所用术语“抗体”是指任何抗原结合分子或分子复合物，其包含至少一个特异性结合或与特定抗原(例如α-毒素)相互作用的互补决定区(CDR)。术语“抗体”包括由四条多肽链、两条重链(H)和两条由二硫键相互连接的轻链(L)组成的免疫球蛋白分子，以及它们的多聚体(例如，IgM)。每个重链包括重链可变区(在这里缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括CH1、CH2和CH3三个结构域。每个轻链包括轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH和VL区域可进一步细分为高变异性区域，称为互补决定区(CDR)，并穿插在较保守的区域中，称为框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FRs组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本揭示的不同实施例中，抗α-毒素抗体(或其抗原结合部分)的FRs可与人类种系序列相同，或可经自然或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于两个或多个CDR的并排分析来定义。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非邻接抗原结合位点。CDR由Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat etal.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of proteins ofimmunological interest"(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；及MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)所描述，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合片段”等，包括任何自然发生、酶可获得、人工合成或基因工程多肽或醣蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。
如本文所用，术语“治疗”涵盖哺乳动物疾病的任何治疗，尤其是人类疾病，并且包括：(a)防止疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的个体中发生；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)减轻疾病，即引起疾病的消退。
在本文中，术语“个体”、“主体”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于小鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当向哺乳动物或其他受试者施用以治疗疾病时，足以对该疾病实施该等治疗的抗体量。
如本文所用，术语“样本”包括从个体、受试者或患者获得的各种样本类型，可用于诊断或监测分析。这一定义包括血液和其他生物来源的液体样本，固体组织样本，如活检标本或组织培养物或从中衍生出的细胞及其后代。
优选的，所述种抗体或抗原结合片段包含：重链可变区的互补决定区和轻链可变区的互补决定区，其中，所述重链可变区的互补决定区域包括CDRH1、CDRH2和CDRH3区域，所述轻链可变区的互补决定区域包括CDRL1、CDRL2和CDRL3区域，其中：
CDRH1区域包括选自SEQ ID NOs:1至2组中的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括选自SEQ ID NOs:3至6及31组中的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括选自SEQ ID NOs:7至9组中的氨基酸序列或其实质相似序列；以及
CDRL1区域包括选自SEQ ID NOs:10至13组中的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括选自SEQ ID NOs:14至15组中的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括选自SEQ ID NOs:16至18组中的氨基酸序列或其实质相似序列。
序列表如表1所示。
表1：
根据本揭示的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)，或者可以只包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab')2或scFv片段)，并且可以根据需要修改以影响功能性。
根据本揭示的抗体或抗原结合片段为特异性结合至金黄色葡萄球菌的α-毒素。α-毒素作为一种细胞溶解性成孔毒素，在金黄色葡萄球菌临床分离株中具保留性。α-毒素是一种33kDa的可溶性单体蛋白，它能在真核细胞表面组装成环状结构，然后将组装好的毒素插入细胞膜，形成一个孔，通过破坏细胞膜的完整性而导致细胞损伤和死亡。
本揭示包括一种抗α-毒素抗体及其抗原结合片段，其以高亲和力结合α-毒素分子的单体或环状结构。
本领域普通技术人员已知的各种技术可用于确定抗体是否“特异地结合到多肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸”。示例性技术包括，例如，常规交叉阻断试验，如Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,N.Y.)所述、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽裂解分析。此外，还可以采用表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一种可以用来鉴别抗体特异结合的多肽中的氨基酸的方法是质谱法检测氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换法包括以氘标记感兴趣的蛋白质，然后将抗体与氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，使氢氘交换发生在除抗体保护的残基(保留氘标记)之外的所有残基上。分离抗体后，对目标蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示出与抗体相互作用的特定氨基酸相对应的氘标记残基。例如，见Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本揭示还包括特异性结合到同一表位的抗α-毒素抗体。
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定一抗体是否与一参考抗α-毒素抗体特异性结合到相同的表位上，或与一参考抗α-毒素抗体竞争结合。例如，为了确定试验抗体是否与本发明的参考抗α-毒素抗体结合到相同的表位上，使参考抗体与α-毒素蛋白质(例如，α-毒素的单体或环状结构)结合。接下来，评估测试抗体与α-毒素分子结合的能力。如果测试抗体能与以参考抗α-毒素抗体饱和结合后的α-毒素结合，则可以推断所述测试抗体与参考抗α-毒素抗体结合的表位不同。另一方面，如果试验抗体不能与以参考抗α-毒素抗体饱和结合后的α-毒素分子结合，则所述试验抗体的结合表位可与本揭示的参考抗α-毒素抗体的结合表位相同。然后可以进行额外的常规试验(例如肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体结合的缺乏是否实际上是由于与参考抗体的同一表位结合所致，还是空间阻断(或其他现象)的原因导致观察到的结合缺乏。此类试验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域现有的任何其他定量或定性抗体结合分析来执行。根据本揭示的某些实施例，如果一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍抑制另一种抗体的结合至少50％，但最优选是75％、90％或甚至99％，则两种抗体结合到同一(或重叠)表位上。或者，如果在抗原中实质上将所有氨基酸突变可减少或消除一种抗体的结合，也可减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体与同一表位结合。如果只有氨基酸突变子集可减少或消除一种抗体结合，也可减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。
本文所用术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可例如使用任何适当的标准技术(例如蛋白质水解消化或重组基因工程技术)从全抗体分子中衍生，所述技术涉及DNA编码抗体可变区和视需要恒定结构域的操纵和表达。此类DNA已知和/或容易从商业来源、DNA库(包括，例如，噬菌体抗体库)获得，或可合成。DNA的测序和操作可以采用化学方法或分子生物学技术，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成适当的结构，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修改、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，一个孤立的互补性决定区(CDR)，如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、迷你体(minibodies)、奈米体(Nanobody)(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小型模块化免疫药物(SMIPs)，和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包含在如本文所用的“抗原结合片段”表达中。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任何大小或氨基酸组成，并且通常将包括至少一个CDR，所述CDR与一个或多个框架序列相邻或位在框架中。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何适当的排列彼此相对。例如，可变区域可以是二聚体并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可包含至少一个共价连接至至少一个恒定结构域的可变结构域。在本揭示的抗体的抗原结合片段内可发现的可变和恒定结构域包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-Cl；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何配置中，包括上面列出的任何示例性配置，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，也可以通过完全或部分铰链或链接器区域连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多)氨基酸组成，这些氨基酸在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间形成柔性或半柔性连接。此外，本揭示的抗体或抗原结合片段可包含一个或多个任何上述可变及恒定结构域配置的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)，并以非共价结合(例如，通过二硫键)彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域结合。
與完整抗體分子一樣，抗原結合片段可以是單特異性或多專一性(例如，雙特異性)。抗體的多特異性抗原結合片段通常包括至少兩個不同的可變結構域，其中每個可變結構域能夠與單獨的抗原或同一抗原上的不同表位特異結合。任何多特異性抗體形式，包括本揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用本領域現有的常規技術而適於本揭示抗體的抗原結合片段。
优选的，所述的抗体或抗原结合片段，其是一個哺乳动物抗体。
本文所用术语“哺乳动物抗体”旨在包括具有源自哺乳动物生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本揭示的哺乳动物抗体可包括非由哺乳动物种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，尤其是在CDR3中。
本文所用术语“重组哺乳动物抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有哺乳动物抗体，例如使用转染到宿主细胞(下文进一步描述)的重组表达载体表达的抗体、从重组体分离的抗体、组合哺乳动物抗体库(下文进一步描述)、从动物(例如，小鼠)分离的抗体，所述动物为以哺乳动物免疫球蛋白基因转基因、或通过任何其他方式制备、表达、创建或分离的涉及哺乳动物免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接的抗体。这种重组哺乳动物抗体具有来自哺乳动物生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组哺乳动物抗体经受体外突变(或当使用动物转基因以获得人类Ig序列时，在体内进行体细胞突变)，因此，虽然源于人类生殖系VH和VL序列并与之相关，但在体内哺乳动物抗体生殖系中可能不自然存在。
哺乳动物抗体，如人类抗体，可以两种形式存在，这与铰链的异质性有关。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含稳定的约150-160kDa的四链结构，其中二聚体通过重链间二硫键连接在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且由共价耦合的轻链和重链(半抗体)形成约75-80kDa的分子。即使经过亲和纯化，这些形式也很难分离。
与衍生抗体的相应种系序列相比，本揭示的抗α-毒素抗体可包括重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域中的一个或多个氨基酸替换、插入和/或缺失。通过将本揭示的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本揭示包括一种抗体及其抗原结合片段，其衍生自本揭示的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或另一哺乳动物生殖系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(该等序列改变在此统称为“种系突变”)。本领域技术人员从本揭示的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生许多抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个单个种系突变或其组合。在某些实施例中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在衍生抗体的原始生殖系序列中发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基突变回原始生殖系序列，例如，突变残基仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的最后8个氨基酸中发现，或突变残基仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现。在其它实施例中，框架和/或CDR残基中的一个或多个突变为不同种系序列的对应残基(即，与最初衍生抗体的生殖系序列不同的种系序列)。此外，本揭示的抗体可包含框架和/或CDR区域内两个或更多种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基被保留或突变为不同种系序列的相应残基。一旦被制备，含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段可以容易地测试一个或多个期望的特性，例如，改进的结合特异性、增加的结合亲和力、改进或增强的拮抗或激动性生物特性(视情况而定)、降低免疫原性，以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段亦包含在本揭示中。
本揭示还包括一种抗α-毒素抗体，其包含本揭示的具有一个或多个保守取代的VH、VL和/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括具有VH、VL和/或CDR氨基酸序列的抗α-毒素抗体，所述VH、VL和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸替换。
当提到核酸或其片段时，术语“实质性同一性”或“基本相同”表示，当与另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失相匹配时，至少在约95％中存在核苷酸序列同一性，以及更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基，如下文所讨论的任何已知序列识别算法(例如FASTA、BLAST或Gap)所测量。与参考核酸分子具有实质性相同性的核酸分子可在某些情况下编码与参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“实质相似性”或“基本相似性”是指两个肽序列在优化排列时，例如通过程序GAP或使用默认间隙权重的BESTFIT，共享至少95％的序列一致性，甚至更优选至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置通过保守的氨基酸置换而不同。“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的氨基酸残基取代。一般来说，保守的氨基酸替代不会显著改变蛋白质的功能特性。在两个或两个以上氨基酸序列通过保守替换而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同源性百分比或相似程度，以校正替换的保守性。本领域技术人员熟知进行这种调整的方法。具有类似化学性质之侧链之氨基酸群之实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸，和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；(7)含硫侧链为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是指在Gonnet etal.(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，通过引用并入本文中。“适度保守”替换是指PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列相似性，也称为序列识别，通常使用序列分析软件进行测量。蛋白质分析软件使用分配给各种替代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸替换)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit这样的程序，这些程序可以与默认参数一起使用，以确定密切相关的多肽之间的序列同源性或序列一致性，例如来自不同物种的同源多肽，或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列一致性。多肽序列也可以FASTA使用默认参数或推荐参数进行比较，这是gcg6.1版中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的对齐和百分比序列标识(Pearson(2000)，见上文)。当将公开的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一个优选算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如，Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，通过引用并入本文中。
于本揭示的一优选具体实施例中，所述抗体或抗原结合片段包含：重链可变区的互补决定区和轻链可变区的互补决定区，其中，所述重链可变区的互补决定区域包括CDRH1、CDRH2和CDRH3区域，所述轻链可变区的互补决定区域包括CDRL1、CDRL2和CDRL3区域，其中：
CDRH1区域包括选自SEQ ID NOs:1至2组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列；
CDRH2区域包括选自SEQ ID NOs:3至6及31组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列；
CDRH3区域包括选自SEQ ID NOs:7至9组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列；
CDRL1区域包括选自SEQ ID NOs:10至13组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列；
CDRL2区域包括选自SEQ ID NOs:14至15组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列；
CDRL3区域包括选自SEQ ID NOs:16至18组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，其抗体或抗原结合片段包括重链可变区的互补决定区和轻链可变区的互补决定区，如表2所示。
表2：
在本揭示的一个优选实施例中，25A1抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其实质相似序列。优选的，所述25A1抗体包括一重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列。优选的，所述25A1抗体包括一轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25A10抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25E4抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25E12抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25H3抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25B7抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25G1抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，25G4抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，5H9抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其实质相似序列。
在本揭示的一个优选实施例中，N2F6抗体或抗原结合片段，包含CDRH1区域包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH2区域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRH3区域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其实质相似序列；以及CDRL1区域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL2区域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其实质相似序列；CDRL3区域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其实质相似序列。
在另一方面，根据本揭示的抗体优选为人源化抗体。“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR是从啮齿动物抗体的重链和轻链可变区转移到人的重链可变结构域和轻链可变结构域，包括人框架区(FR)序列。抗体分子的恒定结构域是从人的抗体中衍生出来的。
根据本揭示，为了提高人源化抗体的结合亲和力，人框架区域中的一些氨基酸残基被CDRs物种中，例如啮齿动物，的相应氨基酸残基所取代。
优选的，人源化抗体或抗原结合片段包括一重链可变区，所述重链可变区包括选自SEQ ID NOs:21至23组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列。人源化抗体或抗原结合片段包括一轻链可变区，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NOs:24至26组中的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的实质相似序列。
于本揭示的一优选具体实施例中，人源化抗体25A1-B2B4AQT或抗原结合片段包括一重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其实质相似序列；以及一轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其实质相似序列。
于本揭示的一优选具体实施例中，人源化抗体25A1-B5B6AQT或抗原结合片段包括一重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其实质相似序列；以及一轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其实质相似序列。
优选地，根据本揭示的抗体是单克隆抗体。
本揭示的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位特异，或可包含对一个以上靶多肽特异的抗原结合域。本揭示的抗α-毒素抗体可与另一功能分子(例如，另一肽或蛋白质)连接或共同表达。例如，抗体或其片段可在功能上连接(例如，藉由化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它方式)至一个或多个其它分子实体，例如另一抗体或抗体片段，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本揭示包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂对α-毒素或其片段特异，而免疫球蛋白的另一个臂对第二个治疗靶点特异或与治疗部分结合。
在本揭示的一个优选实施例中，其抗体或抗原结合片段与治疗剂偶联。
治疗剂的一个例子是抗生素。抗生素的实例包括但不限于达金霉素、博莱霉素、米特拉霉素、蒽霉素、链脲佐菌素、格拉米西丁D或丝裂霉素。
在本揭示的一个优选实施例中，其抗体或抗原结合片段可使用任意数量的表达系统产生，包括原核和真核表达系统。在一些实施例中，表达系统是哺乳动物细胞表达，例如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多这样的系统可从商业供应商处广泛获得。在包括VH和VL区域的抗体实施例中，VH和VL区域可使用单个载体表达，例如在双顺反式表达单元中，或在不同启动子的控制下表达。在其它实施例中，VH和VL区域可以使用单独的向量来表示。如本文所述的VH或VL区域可任选地包括N端的蛋氨酸。
可以从一细胞克隆编码所需抗体的重链和轻链的基因，例如，编码单克隆抗体的基因可以从杂交瘤克隆，并用于生产重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因库也可以从杂交瘤或浆细胞中获得。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大量抗体(参见Kuby,Immunology(3.sup.rd ed.1997))。
生产单链抗体或重组抗体的技术(美国专利。美国专利4946778号。编号4816567)可用于产生本发明的多肽抗体。此外，转基因小鼠或其他有机体(如其他哺乳动物)可用于表达人源化抗体或人类抗体(参见美国专利5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016号，Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild et al.,NatureBiotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；及Lonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
在本揭示的一个优选实施例中，其抗体或抗原结合片段在细胞表面表达。更优选地，所述细胞是T细胞。
本揭示提供包含本揭示抗体或抗原结合片段的医药组合物。本发明的医药组合物由合适的载体、赋形剂和其他提供改进的转移、传递、耐受性等的试剂配制而成。在所有药物化学家都知道的处方中可以找到许多合适的配方：Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.。这些配方包括，例如，粉末，糊状物，软膏，果冻，蜡，油，脂类，含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如脂质体.TM，LifeTechnologies，Carlsbad，California.)，DNA偶联物，无水吸收糊剂，水包油和油包水乳液，石蜡乳液(各种分子量的聚乙二醇)，半固态凝胶，以及含碳蜡的半固态混合物。另见Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J PharmSci Technol 52:238-311。
给予患者的抗体剂量可根据患者的年龄和大小、目标疾病、条件、给药途径等而变化。首选剂量通常根据体重或体表面积计算。当本揭示的抗体用于治疗与成人患者的金黄色葡萄球菌感染相关的条件或疾病时，静脉注射本揭示的抗体可能是有利的。根据病情的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调整。抗体的有效剂量和给药计划可根据经验确定；例如，可通过定期评估监测患者的病情进展，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域中的公知方法(例如，Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知各种递送系统可用于投于本揭示的医药组合物，例如，脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如，Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。导入方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该组合物可藉由任何方便之途径投与，例如藉由输注或团注、经由上皮或皮肤黏膜衬层(例如，口腔黏膜、直肠及肠黏膜等)吸收，且可与其它生物活性剂一起施用。投于可以是系统性的，也可以是局部性的。
本揭示的医药组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉注射。此外，关于皮下递送，笔递送装置容易地应用于递送本揭示的医药组合物。这样的笔递送装置可以重复使用，也可以一次性使用。可重复使用的笔递送装置通常使用包含医药组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有医药组合物均已施用且药筒为空，则空药筒可轻易丢弃并更换为含有该医药组合物的新药筒。然后可以重复使用该笔传送装置。在一次性送笔设备中，没有可更换的药筒。更确切地说，一次性笔递送装置预先填充了保存在装置内储液罐中的医药组合物。一旦容器中的医药组合物被清空，整个装置就被丢弃。
在某些情况下，医药组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(见上文Langer；Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一实施例中，可使用聚合材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Fla。在另一实施例中，可将控制释放系统置于组合物目标附近，因此只需系统剂量的一小部分(参见，例如，Goodson,1984,inMedical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。在Langer,1990,Science 249:1527-1533讨论了其他系统。
可注射制剂可包括静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射、滴注等剂型。这些可注射制剂可采用公开的方法制备。例如，可通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常用于注射的无菌水介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为注射用水介质，例如，生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，可与适当的增溶剂(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂等相结合使用[例如，聚山梨酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，有芝麻油、大豆油等，可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂优选填充在适当的安瓿。
有利的是，将上述用于口服或肠外使用的医药组合物制备成适合于活性成分剂量的单位剂量的剂型。这种单位剂量的剂型例如包括片剂、药丸、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。
本揭示提供一种用于治疗和/或预防一所需个体中由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向所述个体施用一医药物组合物，所述医药组合物包含上述的抗体或抗原结合片段。
本文中使用的术语“治疗”是指给患有不良状况、紊乱或疾病的临床症状个体施用药剂或制剂，以降低症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或其根本原因，和/或促进损坏的改善或补救。术语“预防”是指向易受特定不利条件、紊乱或疾病影响的临床无症状个体施用药剂或组合物，因此涉及预防症状和/或其潜在原因的发生。如本领域技术人员所理解的，预防或预防不需要实现绝对(完全)阻止或避免条件。相反，预防可以实现大量(例如，超过50％)减少或避免要预防的疾病或条件。除非本文另有明确或暗示的说明，否则如果使用术语“治疗”(或“治疗”)而不提及可能的预防，则也应包括预防。
本揭示提供一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法，包括将所述样品与上述的抗体或抗原结合片段接触。
本揭示提供一种检测一样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂盒，其包括上述的抗体或抗原结合片段。
本揭示的抗α-毒素抗体也可用于检测和/或测量样本中的α-毒素或α-毒素表达细胞，例如用于诊断目的。例如，抗α-毒素抗体或其片段可用于诊断以α-毒素异常表达(例如，过度表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的状况或疾病。α-毒素的示范性诊断分析可包括例如接触从患者获得的样本与本发明的抗α-毒素抗体，其中所述抗α-毒素抗体用可检测标签或报告分子标记。或者，未标记的抗α-毒素抗体可与自身可检测标记的二级抗体结合用于诊断应用。可检测标签或报告分子可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，例如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样本中α-毒素的具体示例性分析包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
提供以下实例以帮助本领域技艺人士实践本揭示。
实例
材料和方法
抗原制备
无毒α-毒素突变体ATH35L的序列被构建到带有C-末端6X-His标签的pET27b载体中(pET27b-TAC1pα-溶血素-6His)。从大肠杆菌BL21株中表达并纯化了α-毒素ATH35L。简而言之，在37℃和OD600为0.67的条件下培养750mL新鲜培养物。将IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)添加到0.25mM的最终浓度中，在30℃下诱导蛋白质表达5小时。然后收获细胞并重新悬浮在100ml的溶解缓冲液中，然后使用法国压力机均匀化7个周期。澄清细胞裂解液，然后与2ml的Ni-NTA混合。重组His-标签α-毒素ATH35L结合2h后，用20～150mM咪唑溶液洗脱，透析至磷酸盐缓冲盐水溶液中。
免疫和噬菌体库生成
用α-毒素ATH35L不完全弗洛伊德佐剂免疫8～10周龄BABL/c小鼠，每2周注射一次，共10周。在两周的最后注射后，在牺牲前的三天内，每天给予额外的促进。从小鼠脾细胞中制备抗AT-scFv(单链可变区)噬菌体库。简而言之，用试剂对小鼠脾脏进行匀浆和裂解，提取RNA，然后用SuperScipt IIITM合成cDNA。用scFv引物扩增DNA片段的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过PCR反应扩增VL、VH和柔性连接子的混合物，制备VL连接子VH。将VL-连接子-VH片段用Sfi消化，切下的片段与噬菌体载体连接。将连接混合物电穿孔到大肠杆菌TG1活性细胞中，生成噬菌体库。多样性估计为1.24×109个转化子。
噬菌体库亲和力筛选
然后使用溶液基础和平板基础的方法从噬菌体库中筛选抗AT抗体。为进行溶液基础的淘选，将生物素化-α-毒素与噬菌体库和链霉亲和素磁珠一起孵育。洗涤后，洗脱结合的噬菌体抗体。洗脱的噬菌体被扩增并用于下一轮淘选。共进行了三轮淘选。为进行平板淘选，将α-毒素包被到微板上并与噬菌体库一起孵育，共进行三轮平板淘选。用噬菌体ELISA分析噬菌体颗粒结合α-毒素的能力，并进行DNA测序。
噬菌体ELISA
将10微升的单个噬菌体培养在150μL 2YT-A培养基中培养过夜，在96孔微孔板中于37℃下培养2小时。然后用50μL辅助噬菌体(2x 1010PFU/ml)感染培养基，并在37℃下振荡培养2小时。50微升的补充有125μg/ml卡那霉素的2YT-A培养基添加到培养板中，在30℃下摇动过夜。通过在3300x g下离心30分钟获得含有感兴趣噬菌体的培养上清液，并用于噬菌体ELISA筛选。将100μl噬菌体上清液添加到涂有α-毒素的ELISA平板中。用小鼠抗M13-HRP和TMB底物检测阳性结合物。在450nm处用酶联免疫吸附法测定吸光度。
全长抗体的构建与表达
轻链和重链分别用DraIII/BsiWI和MluI/NheI处理。将插入物连接到含有轻链和重链恒定区的载体中，并将其转染到F293细胞中进行表达。纯化后的全长抗体在中和α-毒素诱导的A549细胞溶解中被检测并按IC50排序。
与重组α-毒素结合的SPR
采用表面等离子体共振(SPR)法测定25A1与重组AT的结合动力学。简单地说，大约200个反应单元(RU)的25A1被固定在CM5芯片上，使用标准的胺偶联程序。随后，以1.5625、3.125、6.25、12.5、25和50nM的浓度连续稀释，以30μL/min的速度注射180秒，然后分离480s。用Biacoret100软件2.0，采用1:1相互作用结合模型，计算了动力学参数(Kon和Koff)和亲和力(KD)。
亲代小鼠单克隆抗体25A1的人源化
通过互补决定区(CDR)嫁接进行人源化。将小鼠25A1蛋白序列与人种系序列进行比对，识别出具有高度同源性的人源序列，采用轻链家族IGVK3-11和重链家族IGHV1-2作为框架序列。除了CDRs接枝。进一步分析序列中潜在的游离半胱氨酸、脱氨、赖氨酸剪切和蛋白酶切割位点的形成。融合和人源化25A1抗体在F293细胞中瞬时表达并纯化。
中和α-毒素诱导的A549细胞溶解
建立抗α-毒素抗体的功能检测方法。A549细胞以2×104个细胞/孔接种在微孔板中，并在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天，取出培养基，用培养基洗涤细胞。将纯化的抗体以0.4、4和40μg/mL的浓度添加到细胞中，并与8μg/mL的AT共孵育。培养结束后，用比色法MTT检测试剂盒分析细胞活力。用OD690nm处的背景吸光度测定结果，并从OD570nm测量值中减去(图1)。
兔红血球细胞溶解试验
通过6000rpm离心10分钟，从3ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)过夜培养中收集金黄色葡萄球菌粗上清液。然后将各种菌株的上清液过滤消毒并在-80℃下储存，直到进一步使用。
用碘乙醇梯度溶液收集红血球细胞，并在平衡盐培养基(0.85％NaCl，10mMHEPES，pH7.4)中重新悬浮并保持在4℃。评估抗体中和诱导兔红血球细胞溶血的能力。具体而言，将浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78的25μl抗体与100μl 10％兔红血球细胞一起添加到孔中，然后添加25μl来自不同菌株的1:8～1:16稀释金黄色葡萄球菌培养上清液。在37℃孵育45～60分钟后，将平板离心5分钟，将50μl上清液轻轻移到新的微量滴定板中，在450nm处读取吸光度。抗体效价以抗体浓度定义，在该浓度下α-毒素诱导的溶血被抑制50％。2％TritonX-100作为100％溶血对照。溶血抑制率计算为((2％TritonX-100的OD450–试验抗体的OD450)/2％TritonX-100的OD450)x 100％。
鼠菌血症模型
6只雌性BALB/c小鼠经腹腔注射对照抗体或25A1抗体，24小时后静脉注射致死量90％的金黄色葡萄球菌BAA-1717。连续观察10天动物死亡率。用GraphPad棱镜记录存活率并分析结果。统计显著性分析采用Kaplan-Meir生存分析和Log-rank(Mantel-Cox)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。
小鼠肺炎模型
10只7至9周龄雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，MI)通过腹腔内注射SYN100(25A1-B5B6AQT)进行被动免疫接种，然后在24小时后通过鼻内(IN)注射致命剂量的金黄色葡萄球菌。在感染后的7天内，每天进行3次动物数普查，监测动物的存活情况。用GraphPad棱镜记录存活率并分析结果。统计显著性分析采用Kaplan-Meir生存分析和Log-rank(Mantel-Cox)和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。
结果
抗α-毒素抗体的分离
BABL/c小鼠通过引入H35L突变进行特异性灭活的重组α-毒素免疫小鼠。然后我们构建了一个单链可变片段(scFv)噬菌体库，并用从金黄色葡萄球菌中纯化的α-毒素进行淘选。经过三轮淘选，29种独特的粘合子被鉴定，生产，并进一步以α-毒素诱导的A549细胞溶解試驗测试29個粘合子的中和活性。结果表明，当抗体以40μg/mL使用时，只有10种(25A1、25A10、25E4、25E12、25H3、25B7、25G1、25G4、5H9和N2F6)可以抑制A549细胞溶解(图1)。表3总结了10种抗体的中和活性強度。然后将抗体转化为全长抗体，并进一步鉴定其结合性和中和活性。10个克隆的CDR序列如表2所示(如上所示)。CDR序列比较显示，10种抑制性抗体中有9种氨基酸序列几乎相同。其中5个(25A10、25A1、25E12、25H3和25E4)在中和AT诱导的A549细胞溶解中具有非常相似的功能活性。根据结合力和功能活性筛选克隆25A1。
表3：
克隆
序列分析
抑制细胞毒性
克隆
序列分析
抑制细胞毒性
aN2-25A10
√
++
aSTAPH N2F6
√
+
aN2-25D5
√
-
aSTAPH N2H1
√
-
aN3-12.5A7
√
-
aSTAPH N2A2
√
-
aN2-25D8
√
-
aSTAPH N2F11
√
-
aN3-12.5E6
√
-
aSTAPH N2E10
√
-
aN2-25G12
√
-
aSTAPH N2B6
√
-
aN3-25F2
√
-
aN2-25A1
√
++
aN3-25G1
√
+
aSTAPH N2D12
√
-
aN3-12.5D2
√
-
H9395 R4A8
√
-
aN2-25B8
√
-
aN2-25E12
√
++
H9395R4B11
√
-
aN2-25H3
√
++
aN2-25B7
√
+
aSTAPH N2D1
√
-
aN3-12.5H9
√
+
aN2-25E4
√
++
aSTAPH N2B11
√
-
aN2-25G4
√
+
aSTAPH N2B10
√
-
25A1与重组α-毒素的高亲和力结合
用表面等离子体共振法评价25A1对重组AT的亲和力。如图2所示，25A1与α-毒素结合，KD为8.346x 10-10M，缔合常数为7.608x 105M-1s-1，解离常数为6.349x 10-4s-1。此数据表明25A1对AT有很高的亲和力。
人源化25A1的工程与表征
为了降低小鼠抗体引入的免疫原性，我们选择将小鼠25A1抗体的CDR嫁接到人的框架IGVK3-11*01F(轻链)和IGHV1-2*02F(重链)上，因为它们与小鼠25A1具有高序列和构象。产生不同的反向突变组合并进行抗原结合试验。根据结合亲和力和反向突变的数量，选择重链25A1-VHB2和25A1-VHB5的两个变体和轻链25A1-VLB4和25A1-VLB6的2个变体构建变体25A1-HuB2B4、25A1-HuB5B4、25A1HuB2B6和25A1-HuB5B6。CDR嫁接和反突变后抗体的序列变化如图3(A)所示。ForteBio测定人源化抗体25A1-HuB2B4、25A1-HuB5B4、25A1HuB2B6和25A1-HuB5B6对重组α-毒素的结合动力学(KD)分别为1.1x 10-9M、1.5x 10-9M、1.1x 10-9M和1.1x 10-9M，与亲代小鼠抗体25A1的KD高度相似，为1.5x 10-9M(图3(B))。
然后我们选择25A1-B2B4和25A1-B5B6进行序列可靠性检查。在重链CDR2区的N61处发现了一个潜在的醣基化位点(图3(C))。因此，N61突变为丙氨酸以避免额外醣基化引起的不必要并发症；N61A突变克隆被命名为25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT。
中和α-毒素诱导的兔红血球细胞溶血作用
然后制备人源化25A1、25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT，并测试其对天然α毒素诱导的兔红血球细胞溶血的抑制作用。简而言之，从5株金黄色葡萄球菌临床菌株(BAA-1717、BAA-1756、ATCC33592、BAA-42和Wood46)中收集了固定相(隔夜培养)的细菌上清液，并与各种抗α-毒素抗体一起加入兔红血球细胞中，浓度范围为0.195～25μg/mL。5个受试菌株的重组和天然α-毒素诱导的红血球细胞溶血抑制率如图4所示。抗体25A1、25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT均能与受试菌株的天然α-毒素结合，并对各种天然α-毒素介导的红细胞裂解产生约50％-90％的抑制作用。25A1、25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT抑制重组α-毒素诱导溶血的IC50值分别为462.3、442.9和304.2pg/mL；ATCC33592的IC50值分别为1518、1801和1830ng/mL；BAA-1756的IC50值为6913、7956和7322ng/mL，Wood46为1299、1707和1537ng/mL，BAA-42为860.6、910.8和996.3ng/mL，显示25A1-B2B4AQT和25A1-B5B6AQT均保留了与25A1相当的抑制能力。
SYN100提高小鼠菌血症和肺炎模型的存活率
金黄色葡萄球菌是脓毒症的常见原因，脓毒症是一种全身性炎症，伴有多器官功能障碍。α-毒素在脓毒症模型中起重要作用，因为金黄色葡萄球菌hla突变体在脓毒症模型中表现出延迟死亡时间和增加存活率。因此，我们测试了25A1保护小鼠免受金黄色葡萄球菌感染的能力。如图5所示，在第2天和第5天之间观察到对照组死亡。相比之下，25A1治疗组的存活率提高；50、25、10和5mg/kg剂量组的总存活率分别为83％、67％、33％和50％(图5)，这一数据表明，用25A1预防菌血症感染具有保护作用。
由于金黄色葡萄球菌是患者呼吸道相关肺炎的常见病因，因此在金黄色葡萄球菌诱导的小鼠肺炎模型中评估了25A1-B5B6AQT的保护作用。在给药25A1-B5B6AQT 24小时后，用三种金黄色葡萄球菌临床分离株BAA1556(USA300)、SF8300(USA300)或NRS261(USA200)经鼻激发诱导感染。在急性肺炎模型中，溶媒对照组在激发后18-20小时内死亡。相比之下，预防性给药25A1-B5B6AQT可显著延长三种模型的存活率，表明25A1-B5B6AQT可对不同的金黄色葡萄球菌临床分离株提供保护(图6)。
虽然本揭示已经结合上述具体实施例进行了描述，但是对于本领域的技术人员来说，本揭示的许多备选方案及其修改和变化将是显而易见的。所有此类备选方案、修改和变更均被视为在本揭示的范围内。
序列表
<110> 兴盟生物医药(苏州)有限公司
<120> 金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用
<130> 无
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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