具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的重组猪伪狂犬病毒，所述重组猪伪狂犬病毒为缺失了基因组的第123210～124654位核苷酸，并在缺失的位置插入了猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的猪伪狂犬病毒变异株GDR。该猪伪狂犬病毒变异株GDR即HN1201，其全基因序列见ACCESSIONNO.KP722022。

本发明提供了一种重组猪伪狂犬病毒，通过将猪非典型性瘟病毒(APPV)E2基因与猪伪狂犬病毒变异株结合在一起，获得了一种全新的重组猪伪狂犬病毒rPRV-E2。将猪非典型性瘟病毒(APPV)E2基因的表达盒插入到猪伪狂犬病毒变异株基因组中，导致缺失了部分US7和US8基因，得到的重组猪伪狂犬病毒(rPRV-E2)不仅安全性好，而且免疫后既能产生针对伪狂犬病毒变异株的抗体，又能产生针对猪非典型性瘟病毒E2蛋白的抗体，为猪伪狂犬病毒-猪非典型性瘟病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

在一个具体示例中，上述猪非典型性瘟病毒E2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体示例中，表达盒所用启动子为CMV启动子。在一个具体示例中，表达盒所用终止子为SV40。可以理解，启动子和终止子的具体种类不限于此，可根据需要选择，而且表达盒中还可以含有其他非必须的调控元件。

本发明一实施例的用于预防非典型性猪瘟和伪狂犬病的疫苗，其包括如上所述的重组猪伪狂犬病毒以及佐剂。

在一个具体示例中，上述佐剂包括稳定剂、络合剂、免疫增强剂和水中的一种或多种。

可选地，免疫增强剂选自白蛋白多肽、扇贝多肽、赛弗诺多肽、淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮、沙棘黄酮、黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和壳聚糖中的一种或多种，能使低下的免疫功能提高，加速诱导免疫应答反应。可选地，稳定剂选自可溶性的二价锰盐、二价钙盐、二价锌盐和二价铁盐中的一种或多种，用来保护活性成分。可选地，络合剂选自乙二胺四乙酸和聚丙烯酸钠中的一种或多种。

本发明一实施例的如上所述的重组猪伪狂犬病毒的制备方法，其包括以下步骤：构建含有上述猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的转移载体，将转移载体与猪伪狂犬病毒变异株GDR进行同源重组，得到上述重组猪伪狂犬病毒。

同源重组(Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体(non-sisterchromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。病毒同源重组是以同源臂为基础的将目的基因整合到病毒基因组中的技术。将表达盒串联到转移载体，通过同源重组构建重组病毒从而实现病毒基因改造、外源基因表达以及重组活载体疫苗制备等。重组病毒的构建建立在体外同源重组的基础上，筛选一个含亲本毒株的复制非必需片段，通过质粒转移载体与病毒基因组DNA之间的同源重组将外源基因导入病毒基因组中，既保留了亲本毒株的生物学特性，又可使重组病毒得到复制增殖。

通过体外连接构建重组病毒的方法，其基本过程是将含外源基因的转移载体与经过酶切处理的亲本毒株基因组DNA臂在体外同源重组，然后将连接产物转染已预先感染亲本病毒的哺乳动物细胞，这种嵌合的基因组在亲本病毒的作用下组装成为重组病毒粒子。

在一个具体示例中，构建含有猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的转移载体的方法包括以下步骤：以猪伪狂犬病毒变异株GDR的基因组DNA为扩增模板，分别扩增US7基因区域的左同源臂和US8基因区域的右同源臂，将左同源臂、猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒和右同源臂插入质粒中并使猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒位于左同源臂和右同源臂之间，得到转移载体。

在一个具体示例中，扩增左同源臂的引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，扩增右同源臂的引物对如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

在一个具体示例中，同源重组的方法包括以下步骤：将转移载体与猪伪狂犬病毒变异株GDR转染受体细胞，并培养受体细胞直至出现病毒蚀斑，然后进行蚀斑纯化。

在一个具体示例中，转染受体细胞的方法包括以下步骤：培养受体细胞长成70％～90％细胞单层时，接种适量的猪伪狂犬病毒变异株GDR，吸附3～5小时；将转移载体稀释于opti-DMEM中，取Lipofectamine 2000稀释于opti-DMEM中；将Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到载体稀释液中，边加边混匀，室温孵育15min～25min；将受体细胞用无血清opti-DMEM清洗后，逐滴加入Lipofectamine 2000/DNA复合物，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养3～5小时。

在一个具体示例中，蚀斑纯化的方法包括以下步骤：采用抗APPV-E2的单克隆抗体检测E2基因的表达，通过有限稀释法重复操作直到每个获得的蚀斑均由抗APPV-E2抗体染色呈现阳性。

以下为具体实施例。

实施例1

一、含猪非典型性瘟病毒E2(APPV-E2)基因的表达盒的制备

APPV-E2基因表达盒序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。APPV-E2表达盒包括CMV启动子序列、猪非典型性瘟病毒E2基因及SV40终止序列，APPV-E2序列参考GD-DH01-2018株设计(ACCESSION NO.MH493895)。将上述制备的表达盒克隆入pMD-18T载体中，该质粒命名为pMD-E2，其示意图如图1所示。

二、重组病毒rPRV-E2的构建

(1)转移载体PMD-US78-E2的构建

参考Genebank中发表的猪伪狂犬病毒变异株HN1201的全基因序列(ACCESSIONNO.KP722022)，设计扩增US7和US8区域的左右同源臂，用来扩增同源臂的引物如下表所示。以猪伪狂犬病毒变异株GDR(由发明人所在实验室保存)基因组DNA为PCR扩增模板，以引物US7u-F、US7u-R扩增左同源臂，预期扩增大小为1241bp，其基因序列如Seq ID No:6所示。以引物US8d-F、US8d-R扩增右同源臂，预期扩增大小为1280bp，其基因序列如Seq ID No:7所示。扩增的目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒PMD-US7u和PMD-US8d。用Sal I和Hind III分别酶切上述重组质粒，将它们先后插入pMD-E2质粒中，获得转移载体PMD-US78-E2。具体的构建流程如附图2所示。

(2)同源重组

按照Lipofectamine^TM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体PMD-US78-E2与猪伪狂犬病毒变异株GDR进行转染Vero细胞。具体步骤如下：六孔板中的Vero培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的猪伪狂犬病毒变异株GDR，吸附4小时；将2μg转移载体稀释于opti-DMEM中，使混合液的终体积均为100μL；取5μL Lipofectamine 2000与100μL的opti-DMEM轻轻混匀；将100μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到100μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清opti-DMEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清opti-DMEM，将200μL Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的DMEM培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直到病毒噬斑变得可见。

(3)重组病毒的蚀斑纯化

可见的噬斑包括重组病毒以及亲本野生型病毒，因此重组病毒要从野生型病毒中通过一系列的有限稀释法得以纯化。每次纯化时，采用抗APPV-E2的单克隆抗体(由发明人所在实验室制备、保存)证实E2基因的表达，重复纯化操作直到每个获得的噬斑均由抗APPV-E2抗体染色呈现阳性，纯化的重组病毒为rPRV-E2。

(4)重组病毒rPRV-E2的鉴定

在APPV-E2表达盒的两侧设计引物，引物序列见下表rPRV-E2-JD-F和rPRV-E2-JD-R。以上述获得的rPRV-E2为模板利用此引物进行扩增，可以扩增出1763bp的特异性片段，如图3所示，经测序验证，此1763bp的片段除含有两对引物序列外，还含有1568bp的APPV-E2表达盒序列，不包含US7和US8基因序列。由此可知获得的重组病毒rPRV-E2中成功插入了含猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒，且缺失了部分US7和US8基因。

(5)重组病毒rPRV-E2间接免疫荧光鉴定

将重组病毒rPRV-E2及其亲本猪伪狂犬病毒变异株GDR分别接种Vero细胞，当细胞病变达60％时，用间接免疫荧光法检测E2基因的表达情况。步骤如下：弃去细胞培养液，用PBS轻洗细胞表面1次，然后每孔加入冷甲醇，置室温固定10～15分钟；用PBS洗1次，然后分别加入适当稀释的APPV-E2单抗(由发明人所在实验室制备、保存)，置37℃作用1小时；用含PBS洗3次；每孔加入适当稀释的FITC标记的抗鼠IgG荧光抗体(购自SIGMA公司)，置37℃作用1小时；用PBS洗3次；在倒置荧光显微镜下观察，细胞噬斑出现了特异性绿色荧光，而对照组亲本猪伪狂犬病毒变异株GDR感染细胞后无荧光，如图4所述，表明插入的APPV-E2基因能够良好正确地表达。

三、重组病毒rPRV-E2的体外体内的稳定性实验

将rPRV-E2在CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)中传代20次，每隔5代利用上述引物rPRV-E2-JD-F和rPRV-E2-JD-R进行扩增，结果仍能扩增出1763bp的条带，如附图5所示，表明所获得的重组病毒rPRV-E2在细胞中传20代后仍保持稳定。

四、动物试验

将6周龄的BALB/C小鼠随机分成2组，每组5只并称重，分别注射重组病毒rPRV-E2和DMEM。对照组每只注射100μL DMEM，另一组后肢肌肉注射10⁴TCID₅₀剂量(半数组织培养感染剂量)的重组病毒rPRV-E2。免疫后每日观察小鼠的临床症状，有无精神萎靡、厌食、瘙痒、震颤等，21d再次称重，并于14d、21d尾静脉采血，分离血清，用PRV GDR株全病毒包被的ELISA板检测血清中PRV抗体水平，用APPV-E2蛋白(由发明人所在实验室制备、保存)包被的ELISA板检测血清中APPV-E2抗体水平。

结果发现免疫后21d，rPRV-E2组及DMEM对照组小鼠平均增重分别为4.6g、4.8g，增重差异不大，说明重组病毒rPRV-E2对小鼠的增重无抑制作用。如图6和图7所示，rPRV-E2组免疫后14d检到PRV和APPV-E2抗体，免疫后21d重组病毒rPRV-E2组抗体水平明显升高，对照组没有明显变化。这表明重组病毒rPRV-E2可诱导小鼠产生明显的免疫反应，不仅能产生针对伪狂犬病毒变异株的抗体，又能产生针对猪非典型性瘟病毒E2蛋白的抗体。

相关序列信息如下：

Seq ID No:1

ATGTCATGCCATGAGCGACAGGACTATTATAATGTCCAATTAGTCGTTGACGAAAAAACGGGCATAGAAAAACGGTCAATAATGGGCAAATGGACCGTAGTGACCAAAGAGGGTCGGGAGCCAAGATTAATGGAACAGATAAAAATGGTATCAAATAGCAGACTGACAGAAACTTACTGCTACAATAAACTAAACACCAGCAGCTGGGGGCGACACCCAATGAAACAGAGGGGGTGTGGGCAAACTGTACCCTATTGGCCTGGTGACAATGTTCTCGAAGAACAATACTTCAGCACGGGTTACTGGGTGAATGCCACAGGAGGTTGCCAGTTGAGGGAAGGTGTGTGGCTATCAAGAAAGGGCGGTGTCCAGTGCCAACGTAACGGCTCATCTTTGATCCTGCAGTTGGCAATCAAGGAGGAAAATGATACCATGGAGATACCGTGTGACCCGGTAGAAACCGAAAGCATGGGCCCGGTGGCACAGGGCACTTGCGTGTATAGTTGGGCAGTAGCTCCAAGAGGATGGTACTACAACAGGAAGGATGGCTATTGGCTCCAATATATAAAGAAAAATGACTATCAGTACTGGACAAAAATGCCCGCGGCTTCGTCCGCTGCAACAATGTACCGGCATTTACTACCTTTGTTAGTGGCTTGCCTTATGGGCGGTAGGATTTCAGTATGGATTGTAGCAATGCTTCTATCCCTACAGGTGGAGGCCAGCTAA

Seq ID No:2

GTCGACcgtgcggggtggtggcgctg

Seq ID No:3

GTCGACgcccctccagaaacagcagc

Seq ID No:4

AAGCTTgggcatcggcgactacctgc

Seq ID No:5

AAGCTTacatcaacaggcggttggcg

Seq ID No:6

CGTGCGGGGTGGTGGCGCTGATCTCCGACCCGCAGGTGGACCGGCTGCTGAACGAGGCGGTGGCCCACCGGCGGCCCACGTACCGCGCCCACGTGGCCTGGTACCGCATCGCGGACGGGTGCGCGCACCTGCTGTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGATCTTTGGGCGCTGCCGGCGCCGCACCACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCACCGGGAGGTGGTGAACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGCGGGCCTACGCCGCCGCCACGCCGTACGCCATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGGCTCGCCGAGGCCCAGGCCCCGGCCCCGGCCCAGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGCGACGCCCGCGCCCCCCGGCCGCCTGCCCGAGCCGGCGACGCGGGACCACGCCGCCGGGGGGCGCCCCACGCCGCGACCCCCGAGGCCCGAGACGCCGCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGCCGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCCCGCGGAGCCGTTCCCGCCCCGGACCACCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCACCGCTCGGTGATCGTCGGCACGGGCACCGCGATGGGCGCGCTCCTGGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCCGCCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGCCTCCTGGGCGGTCCCGCGGACGCCGACGAGCTAAAAGCGCAGCCCGGTCCGTAGCCTCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGACGTGACCCGGCTCCCCGCGGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGTTTCTGGAGGGGC

Seq ID No:7

GGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGGTGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGTGGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCGCTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGACACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATGGGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGACTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGCTGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGCGCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGCGTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGGTGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTGCTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAGGAGGTGCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATCTACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCATCTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGGCGACGACGACGACGACGAGGAGGCGGGCGTCATCCGCCGGCGGCCCGCCTCCCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAGGGGCCGTACGCGAGCCTGGACCCCGAGGACGAGTTCAGCAGCGACGAGGACGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGAGGCGCCCCGCTCCGGCTTCGACGTCTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGT

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcatgcc atgagcgaca ggactattat aatgtccaat tagtcgttga cgaaaaaacg 60

ggcatagaaa aacggtcaat aatgggcaaa tggaccgtag tgaccaaaga gggtcgggag 120

ccaagattaa tggaacagat aaaaatggta tcaaatagca gactgacaga aacttactgc 180

tacaataaac taaacaccag cagctggggg cgacacccaa tgaaacagag ggggtgtggg 240

caaactgtac cctattggcc tggtgacaat gttctcgaag aacaatactt cagcacgggt 300

tactgggtga atgccacagg aggttgccag ttgagggaag gtgtgtggct atcaagaaag 360

ggcggtgtcc agtgccaacg taacggctca tctttgatcc tgcagttggc aatcaaggag 420

gaaaatgata ccatggagat accgtgtgac ccggtagaaa ccgaaagcat gggcccggtg 480

gcacagggca cttgcgtgta tagttgggca gtagctccaa gaggatggta ctacaacagg 540

aaggatggct attggctcca atatataaag aaaaatgact atcagtactg gacaaaaatg 600

cccgcggctt cgtccgctgc aacaatgtac cggcatttac tacctttgtt agtggcttgc 660

cttatgggcg gtaggatttc agtatggatt gtagcaatgc ttctatccct acaggtggag 720

gccagctaa 729

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgaccgtg cggggtggtg gcgctg 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgacgccc ctccagaaac agcagc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttgggc atcggcgact acctgc 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcttacat caacaggcgg ttggcg 26

<210> 6

<211> 1241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtgcggggt ggtggcgctg atctccgacc cgcaggtgga ccggctgctg aacgaggcgg 60

tggcccaccg gcggcccacg taccgcgccc acgtggcctg gtaccgcatc gcggacgggt 120

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gctgccggcg ccgcaccacg ccgatgtggt ggaccccgtc cgcggactac atgttcccca 240

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ggcgcctggt gtccgtcgac ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg 360

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gctggagcga cgacagcttc aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct 480

accagcagcc cccgcaccgg gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc 540

tcccgcgggc ctacgccgcc gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg 600

gctcgccgag gcccaggccc cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc 660

cggcgacgcc cgcgcccccc ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacgccgccg 720

gggggcgccc cacgccgcga cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc 780

cggccgtcgt gcccagcggg tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg 840

ccgcgccggg cgtctcgcgc caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg 900

cgctcctggt gggcgtgtgc gtctacatct tcttccgcct gaggggggcg aaggggtatc 960

gcctcctggg cggtcccgcg gacgccgacg agctaaaagc gcagcccggt ccgtagcctc 1020

cgcagtaccg gcgtcgatga tgatggtggc gcgcgacgtg acccggctcc ccgcggggct 1080

cctcctcgcc gccctgaccc tggccgccct gaccccgcgc gtcgggggcg tcctcttcag 1140

gggcgccggc gtcagcgtgc acgtcgccgg cagcgccgtc ctcgtgcccg gcgacgcgcc 1200

caacctgacg atagacggga cgctgctgtt tctggagggg c 1241

<210> 7

<211> 1280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggcatcggc gactacctgc cgcccgaggt gccgcggctc cggcgcgagc cgcccatcgt 60

caccccggag cggtggtcgc cgcacctgag cgtcctgcgg gccacgccca acgacacggg 120

cctctacacg ctgcacgacg cctcggggcc gcgggccgtg ttctttgtgg cggtgggcga 180

ccggccgccc gcgccggcgg acccggtggg ccccgcgcgc cacgagcccc gcttccacgc 240

gctcggcttc cactcgcagc tcttctcgcc cggggacacg ttcgacctga tgccgcgcgt 300

ggtctcggac atgggcgact cgcgcgagaa ctttaccgcc acgctggact ggtactacgc 360

gcgcgcgccc ccgcggtgcc tgctgtacta cgtgtacgag ccctgcatct accacccgcg 420

cgcgcccgag tgcctgcgcc cggtggaccc ggcgtgcagc ttcacctcgc cggcgcgcgc 480

gcggctggtg gcgcgccgcg cgtacgcctc gtgcagcccg ctgctcgggg accggtggct 540

gaccgcctgc cccttcgacg ccttcggcga ggaggtgcac acgaacgcca ccgcggacga 600

gtcggggctg tacgtgctcg tgatgaccca caacggccac gtcgccacct gggactacac 660

gctcgtcgcc accgcggccg agtacgtcac ggtcatcaag gagctgacgg ccccggcccg 720

ggccccgggc accccgtggg gccccggcgg cggcgacgac gcgatctacg tggacggcgt 780

cacgacgccg gcgccgcccg cgcgcccgtg gaacccgtac ggccggacga cgcccgggcg 840

gctgtttgtg ctggcgctgg gctccttcgt gatgacgtgc gtcgtcgggg gggccatctg 900

gctctgcgtg ctgtgctccc ggcgccgggc ggcctcgcgg ccgttccggg tgccgacgcg 960

ggcgcggacg cacatgctct ctccggtgta caccagcctg cccacgcacg aggactacta 1020

cgacggcgac gacgacgacg acgaggaggc gggcgtcatc cgccggcggc ccgcctcccc 1080

cagcggagac agcggctacg aggggccgta cgcgagcctg gaccccgagg acgagttcag 1140

cagcgacgag gacgacgggc tgtacgtgcg ccccgaggag gcgccccgct ccggcttcga 1200

cgtctggttc cgcgatccgg agaaaccgga agtgacgaat ggacccaact atggcgtgac 1260

cgccaaccgc ctgttgatgt 1280