棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用
阅读说明：本技术 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 (Application of cotton GhGOLS2 gene in controlling cotton seed germination ) 是由 师恭曜 田保明 位芳 郝梦媛 谢正清 田昭然 曹刚强 陈薇薇 高天奇 于 2021-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用,棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用,棉花GhGOLS2基因作为Si-VIGS沉默系统阳性对照的应用。本发明通过使用携带TRV-GhGOLS2载体的两种侵染液分别浸染棉花种子,结果证明两种浸染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因,并降低棉花种子的萌动率,病毒匀浆侵染液的沉默效果好于农杆菌侵染液的沉默效果,证明棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。本发明证明GhGOLS2基因可以作为Si-VIGS种子萌发早期基因沉默研究,方便研究人员应用Si-VIGS方法研究基因功能。(The invention discloses application of a cotton GhGOLS2 gene in controlling cotton seed germination, application of a cotton GhGOLS2 gene in controlling cotton seed germination, and application of a cotton GhGOLS2 gene as a Si-VIGS silencing system positive control. According to the invention, the cotton seeds are respectively impregnated by two impregnation liquids carrying TRV-GhGOLS2 vectors, and the results prove that the two impregnation liquids can effectively silence the GhGOLS2 gene of the cotton and reduce the germination rate of the cotton seeds, the silencing effect of the virus homogenate impregnation liquid is better than that of the agrobacterium infection liquid, and the application of the GhGOLS2 gene of the cotton in controlling the germination of the cotton seeds is proved. The invention proves that the GhGOLS2 gene can be used for early gene silencing research of Si-VIGS seed germination, and is convenient for researchers to research gene functions by using an Si-VIGS method.)
技术领域
本发明属于棉花育种
技术领域
，具体涉及到一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。背景技术
种子中的糖被认为是参与调节并影响种子发育过程的信号，其中，棉子糖家族低聚糖(Raffinose family oligosaccharides，RFOs)在大多数植物的种子成熟过程中积累，半乳糖醇合成酶(GALACTINOL SYNTHASE,GOLS)、棉子糖合成酶(棉子糖合成酶，RS)和水苏糖合成酶(STACHYOSE SYNTHASE,STS)是植物RFO生物合成的主要酶。研究人员通过在转基因拟南芥或烟草植物中表达多种GOLS基因，发现普遍增加了半乳糖醇和棉子糖的含量，同时增强了植物非生物胁迫的耐受性，这使得GOLS基因得到了广泛的研究。2016年，Vidigal等人在黄瓜中突变了GOLS2基因后发现，半乳糖醇含量的减少与种子寿命的降低相符，因此他们认为GOLS2是种子寿命的合适生物标记。
专利公开了一种名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489，本专利通过ESTs库构建了大量pTRV2瞬时沉默载体，使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理，通过观察棉花种子以及幼苗表型，发现其中一套瞬时沉默载体出现抑制棉花种子发芽的表型，随后对此套pTRV2瞬时沉默载体进行了基因测序，将测序结果在陆地棉全基因组序列中进行BLAST搜索，发现瞬时沉默载体中的基因片段与GhGOLS2基因CDS序列信息吻合，初步判断GhGOLS2基因被沉默后会抑制棉花种子的萌发。Si-VIGS是一种简单、快速以及高通量地病毒介导的基因沉默方法，能够在当代获得沉默植株。Si-VIGS提前了VIGS的侵染时期，可以研究种子以及幼苗早期生长发育以及地下部相关的基因。Si-VIGS方法缩短了基因沉默机制诱发的时间，进而缩短了实验周期。在常用的VIGS方法方法中，研究人员选择GhCLA基因作为阳性对照，因为GhCLA基因一旦被沉默，将在7d后在棉花叶片上出现光漂白表型，这一白化表型非常稳定，因此GhCLA基因常被用作传统VIGS方法的阳性对照，而Si-VIGS方法将VIGS的作用时间提前，此时棉花子叶还未打开，沉默后能够使叶片白化的GhCLA基因无法在Si-VIGS方法中作为阳性对照。因此Si-VIGS方法急需寻找适合的阳性对照。GhGOLS2基因被沉默后，表现为种子萌动率下降，这个表型相对比较直观，便于研究人员辨认，并且使用Si-VIGS的方法沉默GhGOLS2基因的结果比较统一且稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
本发明的棉花GhGOLS2基因作为Si-VIGS沉默系统阳性对照的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过使用携带TRV-GhGOLS2载体的两种侵染液分别浸染棉花种子，结果证明两种浸染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因，并降低棉花种子的萌动率，病毒匀浆侵染液的沉默效果好于农杆菌侵染液的沉默效果，证明棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
(2)本发明证明GhGOLS2基因可以作为Si-VIGS种子萌发早期基因沉默研究，方便研究人员应用Si-VIGS方法研究基因功能。
附图说明
图1是对棉花GhGOLS2PCR扩增结果。
图2是pTRV2-GhGOLS2质粒酶切验证结果。
图3是在农杆菌侵染液处理下TRV-GFP载对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图4是在病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图5是在农杆菌侵染液与病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花种子萌动率。
图6是在农杆菌侵染液与病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花中GhGOLS2基因的表达水平。
图7是Si-VIGS处理棉花种子后GhGOLS2基因表达分析。
图8是Si-VIGS处理Z79、ZG5、Z9807三种不同品种棉花种子后TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图9是Si-VIGS处理Z79、ZG5、Z9807三种不同品种棉花种子后TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花中GhGOLS2基因的表达水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例的棉花GhGOLS2基因的制备方法如下：
棉花GhGOLS2基因的CDS序列设计全长引物：
GhGOLS2FL-F:5'-ATGGAAGGTGTTGCCATCGCCAAG-3'
GhGOLS2FL-R:5'-AGCAGCAGAGGGGGCGTTAATATA-3'
使用TAKARA公司的dNTP、DNA Polymerase和DNA Polymerase Buffer进行基因扩增，扩增全长993bp；使用AXYGEN公司DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后将全长基因连入Ti载体中进行测序。
本实施例pTRV2-GhGOLS2瞬时沉默载体构建方法如下：
根据棉花GhGOLS2基因的CDS序列信息，设计基因沉默片段的特异性引物，设计的引物序列为：
GhGOLS2-F：5＇-GGAATTCGACCCAGTTTGCC-3＇
GhGOLS2-R：5＇-GGGTACCACCAAGTTGTAAATTG-3＇，
并在引物的两端分别加入限制性核酸内切酶KpnI和EcoRI。沉默片段位于GhGOLS2开放阅读框的中间区域，扩增片段长度为441bp。以陆地棉Z79的根部cDNA为模板进行PCR扩增，如图1所示，得到一条441bp的目的条带，连接到pTRV2载体，酶切验证重组质粒pTRV2-GhGOLS2的正确性，如图2所示，其中载体片段为9663bp，目的片段为441bp。将经过酶切验证正确的重组质粒进行测序，将序列比对正确的pTRV2-GhGOLS2瞬时沉默载体转化到GV3101农杆菌细胞中。
实施例1
实验一、发明人通过以下实验验证GOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
本实验分别使用两种侵染液：农杆菌侵染液(Aagrobacterium)、病毒匀浆侵染液(Virus sap)；
实验对象：以TRV-GFP对照棉花植株为对照组、以沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株为实验组；
使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理的具体步骤在专利名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489中已经公开。
如图3-4所示，通过Si-VIGS法侵染露白的陆地棉种子，侵染液侵染1d后转入潮湿的蛭石培养5d，待培养5d后，对幼苗进行了表型观察，实验结果表明，两种侵染液使用Si-VIGS方法处理棉花种子后，沉默了GhGOLS2基因的棉花种子的萌动均受到显著抑制。
如图5所示，对照组以及实验组棉花种子的萌动率进行了统计，统计结果显示：以农杆菌作为侵染液时，对照组棉花种子的萌动率为77％，实验组棉花种子的萌动率下降至18％；以病毒匀浆作为侵染液时，对照组棉花种子的萌动率为79％，实验组棉花种子的萌动率则为13％。
如图6所示，为了证明GhGOLS2基因确实被沉默，又进一步检测了对照组和实验组的棉花种子中的GhGOLS2基因的表达水平。荧光定量PCR的结果显示，两种侵染液通过Si-VIGS法均能够造成棉花种子中GhGOLS2基因的沉默，从而造成棉花种子萌动率降低的表型。其中病毒匀浆作为侵染液时，棉花幼苗(种子)中的GhGOLS2基因表达水平下降最为显著。
综上所述，两种侵染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因，并降低棉花种子的萌动率，并且病毒匀浆作为侵染液的沉默效果要好于农杆菌作为侵染液的沉默效果。
为了进一步研究棉花种子中GhGOLS2基因的表达水平，确定Si-VIGS方法能够在早期实现基因沉默，本实验对不同生长时期的棉花种子进行了实时荧光定量PCR。
实验对象：选择了状态基本相同的陆地棉种子分为三组：分别为野生型组WT、携带TRV-GFP对照的侵染液为对照组、携带TRV-GhGOLS2载体的侵染液为实验组；
使用实验一中农杆菌侵染液和病毒匀浆侵染液通过Si-VIGS的方法侵染棉花种子，分别侵染0h、1h、3h、6h、9h、12h和24h，以及放入潮湿蛭石培养2d、3d、4d和5d的棉花种子为模板，提取了RNA，将提取的RNA反转录成cDNA，以这些cDNA为模板进行qPCR。
如图7所示，未经过任何处理的野生型棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平随着时间的推移而显著升高，在培养3d时野生型棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平约为培养0h时的40倍，对照组棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平与野生型的变化基本一致；使用Si-VIGS方法沉默了GhGOLS2基因的棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平在侵染6h后开始降低，在培养5d时，GhGOLS2基因表达水平已经降低了80％以上，其中病毒匀浆作为侵染液时，GhGOLS2基因表达水平降低了99％。
综上所述，Si-VIGS方法在处理6h后实现基因沉默，提前了Si-VIGS方法作用的时间。
实施例2
实验二、发明人通过以下实验验证棉花GhGOLS2基因作为Si-VIGS沉默系统阳性对照的应用
本实验分别使用病毒匀浆侵染液(Virus sap)；
实验对象：选择Z79、ZG5、Z9807三种不同遗传背景的棉花品种，以TRV-GFP载体棉花植株为对照组、以沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株为实验组、；
使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理的具体步骤在专利名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489中已经公开。
如图8所示，通过Si-VIGS法分别侵染Z79、ZG5、Z9807三种品种的露白的陆地棉种子，侵染液侵染1d后转入潮湿的蛭石培养5d，待培养5d后，对幼苗进行了表型观察，实验结果表明，使用Si-VIGS方法处理棉花种子后，沉默了GhGOLS2基因的不同品种的棉花种子的萌动均受到显著抑制。
如图9所示，为了证明不同品种的棉花种子中GhGOLS2基因确实被沉默，又进一步检测了对照组和实验组的棉花种子中的GhGOLS2基因的表达水平。荧光定量PCR的结果显示，通过Si-VIGS法均能够造成棉花种子中GhGOLS2基因的沉默，从而造成棉花种子萌动率降低的表型。
综上所述，沉默棉花GhGOLS2基因，能够在多种棉花品种中稳定降低棉花种子的萌动率，这种稳定且便于观察的表型使GhGOLS2基因成为Si-VIGS法的合适的阳性对照。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。