应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺
阅读说明：本技术 应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺 (Process for extracting chondroitin sulfate sodium and peptide in bovine trachea by air floatation method ) 是由 谭岸 邹高远 朱小丰 谭金茂 于 2021-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺,属于生化制药技术领域,包括以下步骤：(1)牛气管蒸煮脱脂；(2)三步酶解；(3)气浮分层；(4)精滤；(5)过滤液的处理；(6)硫酸软骨素钠的精制；(7)肽的精制。本发明提供的工艺实现了直接用新鲜或干牛气管提取硫酸软骨素钠和肽,通过自絮凝气浮法使牛气管水解液快速分层,且过程可控,安全可行,省去了以往工艺中难度大、费用高的牛气管中软骨去杂工序,不另外添加絮凝剂,原料利用率高,减少了残留乳化油脂对后续过滤和树脂吸附的影响,且硫酸软骨素钠和肽的产率较高。(The invention discloses a process for extracting chondroitin sulfate sodium and peptide in a cattle trachea by applying an air floatation method, which belongs to the technical field of biochemical pharmacy and comprises the following steps: (1) cooking cattle trachea for degreasing; (2) carrying out three-step enzymolysis; (3) air floatation layering; (4) fine filtering; (5) treating the filtrate; (6) refining chondroitin sulfate sodium; (7) and (4) refining the peptide. The process provided by the invention realizes the direct extraction of sodium chondroitin sulfate and peptide by using a fresh or dry bovine trachea, quickly stratifies the bovine trachea hydrolysate by a self-flocculation air floatation method, is controllable, safe and feasible, omits the impurity removal process of the cartilage in the bovine trachea with high difficulty and high cost in the prior process, does not add a flocculating agent, has high utilization rate of raw materials, reduces the influence of residual emulsified oil on subsequent filtration and resin adsorption, and has higher yield of sodium chondroitin sulfate and peptide.)
技术领域
本发明属于生化制药技术领域，具体地，涉及应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺。
背景技术
硫酸软骨素钠(简称CS)是一种酸性粘多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、鲨鱼骨、鱿鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子。硫酸软骨素钠由50-70个双糖单元组成，其双糖单元是由葡糖醛酸和氨基半乳糖通过β-1,3糖苷键形成，双糖再以β-1,4糖苷键连接聚合成大分子。
硫酸软骨素钠具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理功能。临床上主要作为骨关节炎、高血脂、心绞痛、动脉粥样硬化等疾病的治疗，其滴眼液具有治疗角膜损伤、角膜溃疡或角膜炎；在食品上硫酸软骨素钠被美国FDA归类为膳食补充剂，澳大利亚将其作为改善或预防关节病的营养保健品。
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多动物蛋白，主要存在于骨、腱、韧带、皮肤等组织中，是结缔组织中一种重要的结构蛋白。胶原蛋白由三条肽链组成，三条肽链以特有方式构成复合螺旋，变性后才能被蛋白酶水解。
肽是蛋白质水解产物，食品安全国家标准胶原蛋白肽(GB31645 2018)标明的胶原蛋白肽是富含胶原蛋白的动物组织骨、腱、筋、皮等的水解产物，富含羟脯氨酸，由2个以上氨基酸构成，分子量要求在10000以下的大于90％，吸收性能好，是一种食品原料。可用于食品、保健食品、化妆品、生物材料、微生物培养基、高端饲料等多个领域。
目前，硫酸软骨素钠工业生产均采用酶解法从动物软骨中提取，主要包括去杂、清洗、煮料、酶解、脱蛋白、过滤、离心、离子交换、超滤、醇沉、干燥等步骤。骨油的去除通过软骨蒸煮后浮在料液上捞除，油脂去除率一般小于85％。从蛋白多糖上分离出来溶于水中硫酸软骨素钠与蛋白质水解后溶在水中的肽通过阴离子树脂吸附或超滤膜过滤分离，再分别纯化干燥。大部分蛋白质通过蛋白质水解酶水解成肽及氨基酸，利用等电点沉淀去除未水解蛋白质时，部分较大乳化油脂颗粒吸附等电点沉淀的蛋白质及骨渣包裹部分水溶液成胶泥状物，形成油泥骨渣混合沉淀，沉淀含油量大，如骨渣量大，胶泥比重比水重，下沉，如骨渣量极少，胶泥含油多，比重比水轻，上浮，如油、渣比例适中，有可能形成悬浮状絮状物或分三到四层。胶泥层无法压滤，在分层完成后直接排放，水解液清液层中仍有大量微小乳化油脂及颗粒物，后续清液过滤需使用较多的助滤剂，如不等分层直接过滤，滤布及助滤剂用量更多。增加分层率及减少油泥层含水量及助滤剂用量的方法研究是增加收率的途径。减少油脂残留是可行途径，因此生产中在去杂工序要求尽可能多的去除含油脂多的脂肪、肌肉等杂质，并想办法增加软骨中油脂的去除率。软骨残留油脂也可被脂肪酶水解，但油脂水解只能在油水界面进行，由于蛋白质具有表面活性剂作用，软骨残留油脂在水中分散后很容易被蛋白质包裹乳化，水解效率并不高。
牛气管由软骨、肌肉、结缔组织和粘膜构成。软骨为“C”字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接。干气管中含蛋白质约40-50％,脂肪约30-40％，多糖约10-15％。牛气管中胶原蛋白含量高的软骨、筋、腱较多，去除杂质后的气管软骨更是优质的胶原蛋白肽生产原料，牛气管直接水解出的肽主要成份是胶原蛋白肽，其检测指标达到胶原蛋白肽国家标准。
牛气管软骨中硫酸软骨素钠含量高，约28-32％，含油量小于10％，是优质的硫酸软骨素生产原料。软骨约占气干管重约30％，但环形软骨很难剥出来。因此牛来源硫酸软骨素钠生产一般选择较易除杂的牛肋软骨、鼻骨软骨、肩胛骨软骨等。
气浮法也称浮选法，其原理是设法使水中产生大量的微气泡，以形成水、气及被去除物质的三相混合体，在界面张力、气泡上升浮力和静水压力差等多种力的共同作用下，促进微细气泡粘附在被去除的微小油滴上后，因粘合体密度小于水而上浮到水面，从而使水中油粒被分离去除。除了用于去除污水中处于乳化状态的油以外，气浮法还广泛应用于除去污水中密度接近于水的微细悬浮颗粒状态的杂质。比如，气浮法可以有效地用于活性污泥的浓缩；污水中悬浮杂质的去除。
因此，本发明采用了一种自絮凝气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，利用蛋白质高温变性沉淀及在等电点时溶解度最小、表面活性降低后乳化能力降低，二氧化碳在高温及压强减少时在水中溶解度不断降低等原理达到气浮条件。详细地为蛋白质水解酶高温变性及未完全水解的蛋白质在等电点溶解度最小，析出粘结成小颗粒；同时乳化油脂外包裹的蛋白质析出，乳化性能降低并互相粘结成小颗粒；升温降压减少二氧化碳溶解度产生微小气泡，气泡粘在上述两种小颗粒表面快速上浮，使得牛气管脱脂的水解液快速澄清和分层。且本发明提供的工艺可直接用于新鲜或干牛气管的提取，解决了提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺中牛气管软骨去杂工序工艺难控制的问题，降低了去杂工艺的损耗，提高了硫酸软骨素和牛气管肽的收率。
发明内容
本发明的目的在于提供应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，以气浮法提高牛气管水解液分层效率，从而解决乳化油脂对后续过滤和树脂吸附的影响，减少了助滤剂用量，并保证生产工艺稳定可控。
本发明要解决的技术问题：现有使用牛气管软骨提取硫酸软骨素钠和肽的工艺中软骨周围杂质分离工艺复杂，造成提取工艺不稳定，软骨易损耗的问题。
本发明可实现直接从牛气管中提取硫酸软骨素钠和肽的目的，可通过以下技术方案实现：
应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，包括以下步骤：
(1)牛气管蒸煮脱脂：将牛气管清洗、切成2-10厘米段，再加入水，转移至提取罐，并在105-110℃下蒸煮2-3h后，保温静置，缓慢加入95℃水，顶去上层油脂，以100-150rpm速度搅拌3h后，得牛气管浆；
(2)三步酶解：将牛气管浆进行三步酶解，得牛气管水解液；
(3)气浮分层：在搅拌、密封条件下，向牛气管水解液中泵入气浮剂溶液到等电点，加热到80-90℃，30min灭活水解酶，然后减压进行气浮分层，得分层牛气管水解液，放出下层清液；
(4)精滤：下层清液使用300目硅藻土做助滤剂、400目滤布过滤，得过滤液；
(5)过滤液的处理：将过滤液依次经过阴离子交换树脂和脱色树脂，得透过液；
(6)硫酸软骨素钠的精制：吸附后的阴离子交换树脂用质量分数10-15％的食盐水洗脱，得洗脱液；将洗脱液经过再次水解、压滤、超滤、醇沉、离心、干燥即得医药级硫酸软骨素钠；
(7)牛气管肽的精制：将透过液纳滤浓缩脱盐、真空浓缩、喷雾干燥即得牛气管肽。
进一步，步骤(1)中牛气管为新鲜牛气管或干牛气管，其中，新鲜牛气管加2-3倍量水，干牛气管加6-7倍量水。
进一步，步骤(2)中三步酶解使用的酶依次为2709碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，且2709碱性蛋白酶的加入质量为鲜牛气管质量的0.2-0.3％，木瓜蛋白酶的加入质量为牛气管质量的0.2-0.3％，胃蛋白酶的加入质量为牛气管质量的0.1-0.2％，干牛气管加酶量为鲜气管的3倍。
进一步地，所述2709碱性蛋白酶的酶解条件：酶解温度为45-55℃，pH值为8-9，酶解时间2-4h。
进一步地，所述木瓜蛋白酶的酶解条件：酶解温度为60-65℃，调节pH值为5-7，酶解时间2-4h。
进一步地，所述胃蛋白酶的酶解条件：酶解温度为35-40℃，调节pH值为2-3，酶解时间2-4h。
进一步地，步骤(3)中气浮剂为碳酸氢钠、碳酸钠中的一种，优选地为碳酸氢钠。
进一步地，步骤(3)中气浮分层具体操作为，加入气浮剂溶液调节牛气管水解液pH至等电点，搅拌30min后，停止搅拌，并升温至80-90℃，静置1h。
进一步地，所述等电点的pH为4.0-5.0。
进一步地，步骤(5)中所用阴离子交换树脂为强碱性聚丙烯酸大孔树脂，所用脱色树脂为弱极性聚丙烯酸大孔树脂。
进一步地，步骤(6)再次水解使用复合酶，优选胰酶；超滤中重复加水，重复次数不小于3次，重复加水稀释的水是反渗透水。
进一步地，步骤(7)中纳滤浓缩过程中使用的纳滤膜为分子量150道尔顿的膜。
本发明的有益效果：
本发明可直接使用牛气管提取硫酸软骨素钠及肽，并在现有技术酶法提取牛软骨硫酸软骨素钠和肽的技术基础上，通过对工艺路线以及工艺参数的改进，采用三种酶分步控制水解方法，充分水解牛气管中的蛋白质，然后采用气浮分层法，利用酸性条件下，气浮剂碳酸氢钠的加入产生的二氧化碳溶解到水中，在升温灭活蛋白酶静置时，缓慢减压均匀产生微小气泡，且该气泡吸附在悬浮颗粒的表面，并带动颗粒上浮，进而实现分层，上述分层过程快且彻底，上浮的油泥层界面清晰，下层清液澄清度好，过滤快；
此外，通过利用碳酸氢钠调节等电点时产生的二氧化碳气体的气浮方法还具有以下优点：因二氧化碳在水中的溶解度随温度和压力减少，可通过温度和压力，调节气泡产生速度和产生气泡体积小，进而控制气泡均匀产生，促进气泡与等电点絮凝蛋白质和油脂乳化颗粒充分接触，粘附在颗粒表面，从而减少颗粒表面吸水量，促进颗粒物较快地上浮，促进分层进程，且油泥层界面清晰，降低油泥层含水量，减少清液层中的颗粒物，减少了残留乳化油脂对后续过滤和树脂吸附的影响，减少了助滤剂用量；
综上所述，本发明采用的自絮凝气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，实现了直接用新鲜或干牛气管提取硫酸软骨素钠和肽，省掉了软骨去杂工序，缩短了生产时间，提高了硫酸软骨素钠和肽的收率，提高了牛气管的综合效益。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：原料：东北新鲜牛气管，牛年龄少于2年
应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，包括以下步骤：
(1)牛气管蒸煮脱脂：将新鲜牛气管6吨切碎(5厘米段)，加2倍质量水，105℃蒸煮2小时，保温静置6小时，用95℃水顶出上层油脂，以120rpm速度搅拌3h，将牛气管溶液搅拌成浆状，得牛气管浆；
(2)三步酶解：牛气管浆冷却到55℃，调pH值为8.5，加入牛气管质量0.3％的2709碱性蛋白酶，酶解2h；升温到65℃，调pH值为6，加入牛气管质量0.2％的木瓜蛋白酶，酶解2h；调pH值为2，再冷却到37℃，加入牛气管质量0.1％的胃蛋白酶，酶解2h；
(3)气浮分层：取水解液500毫升加碳酸氢钠饱和溶液到等电点(pH值4-5)，得到小试用量比例；密封提取罐，60rpm搅拌下，泵入小试比例碳酸氢钠饱和溶液，调节pH值至等电点，将温度升温至80℃，搅拌30min，静置1h，缓慢减压，全排空后降温静置到分层基本稳定，得分层牛气管水解液，放出下层清液过滤；
(4)精滤：向下层清液中加助滤剂，精密过滤，得过滤液；使用硅藻土或活性炭做助滤剂滤饼，滤饼厚5mm，助滤剂300目，滤布400目；
(5)过滤液的处理：将过滤液依次经过阴离子交换树脂(强碱性聚丙烯酸大孔树脂)和脱色树脂(弱极性聚丙烯酸大孔树脂)，得透过液，控制过滤液的流速为树脂2倍体积/小时，本实例树脂用量各为3立方米，美国陶氏化学公司生产；
(6)硫酸软骨素钠的精制：吸附后的阴离子交换树脂用质量分数10％的食盐水洗脱(食盐水用量为树脂体积的1倍)，得洗脱液；将洗脱液经过再次水解(胰酶0.5％)、压滤、超滤(3000道尔顿膜)、醇沉脱水、离心、干燥即得医药级硫酸软骨素钠；使用硅藻土做助滤剂，再次水解液压滤过滤液加反渗透水1倍超滤浓缩脱盐到2立方米，重复4次，截流液经醇沉(加食用酒精到乙醇浓度70％搅拌30分钟静置30分钟取沉淀)和二次脱水(沉淀搅拌加食用酒精到浓度85％一次和90％一次)后离心脱酒精；60度真空干燥到水分10％以下，得成品；
(7)牛气管肽的精制：脱色树脂吸附透过液通过纳滤脱盐浓缩，膜截留分子量150道尔顿，浓缩的截留液双效真空浓缩(60度以下)，浓缩液喷雾干燥(浓缩液比重1.15，进风温度175℃，出风温度85℃)，即得牛气管肽。
实施例2：干牛气管，产地新疆，牛年龄少于3年。
应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，包括以下步骤：
(1)牛气管蒸煮脱脂：将牛气管2吨切碎(2厘米段)，加6倍质量水，108℃煮3小时，保温静置6小时，用95℃水顶出上层油脂，以120rpm速度搅拌3h，将牛气管溶液搅拌成浆状，得牛气管浆；
(2)三步酶解：牛气管浆冷却到55℃，调pH值为8.5，加入牛气管质量0.9％的2709碱性蛋白酶，酶解2h；升温到65℃，调pH值6，加入牛气管质量0.6％的木瓜蛋白酶，酶解2h；调pH值2.0，再冷却到37℃，加入牛气管质量0.3％的胃蛋白酶，酶解2h；
(3)气浮分层：取水解液500毫升加碳酸氢钠饱和溶液到等电点(pH值4-5)，得到小试用量比例；密封提取罐，60rpm搅拌下，泵入小试比例碳酸氢钠饱和溶液，调节pH值至等电点，将温度升温至85℃，搅拌30min，静置1h，缓慢减压，全排空后降温静置到分层基本稳定，得分层牛气管水解液，放出下层清液；
(4)精滤：向下层清液中加助滤剂，精密过滤，得过滤液；使用硅藻土或活性炭做助滤剂滤饼，滤饼厚5mm，助滤剂300目，滤布400目；
(5)过滤液的处理：将过滤液依次经过阴离子交换树脂(强碱性聚丙烯酸大孔树脂)和脱色树脂(弱极性聚丙烯酸大孔树脂)，得透过液，控制过滤液的流速为树脂2倍体积/小时，本实例树脂用量各为3立方米，美国陶氏化学公司生产；
(6)硫酸软骨素钠的精制：吸附后的阴离子交换树脂用质量分数15％的食盐水洗脱(食盐水用量为树脂体积的1倍)，得洗脱液；将洗脱液经过再次水解(胰酶0.5％)、压滤、超滤(3000道尔顿膜)、醇沉脱水、离心、干燥即得医药级硫酸软骨素钠；使用硅藻土做助滤剂，再次水解液压滤过滤液加反渗透水1倍超滤浓缩脱盐到2立方米，重复3次，截流液经醇沉(加食用酒精到乙醇浓度70％搅拌30分钟静置30分钟取沉淀)和二次脱水(沉淀搅拌加食用酒精到浓度85％一次和90％一次)后离心脱酒精；60度真空干燥到水分10％以下，得成品；
(7)牛气管肽的精制：脱色树脂吸附透过液通过纳滤脱盐浓缩，膜截留分子量150道尔顿，浓缩的截留液双效真空浓缩(60度以下)，浓缩液喷雾干燥(浓缩液比重1.20，进风温度175℃，出风温度85℃)，即得牛气管肽。
实施例3：新鲜牛气管，产地山东，牛年龄1-2年，其他同实例一。
实施例4：干牛气管，产地内蒙，牛年龄1-2年，其他同实例二。
实施例5：干牛气管，产地新疆，牛年龄少于3年。
应用气浮法提取牛气管中硫酸软骨素钠和肽的工艺，包括以下步骤：
(1)牛气管蒸煮脱脂：将牛气管6kg切碎(2厘米段)，加6倍质量水，108℃煮3小时，保温静置6小时，用95℃水顶出上层油脂，以120rpm速度搅拌3h，将牛气管溶液搅拌成浆状，得牛气管浆；
其他同实施例2相同。
对比例1：干牛气管，产地新疆，牛年龄少于3年。
与实施例5相比，除(3)中用氢氧化钠调pH值外，其余步骤一样。
收率及性能测试
实施例1-5和对比例1获得的硫酸软骨素钠和牛气管肽的收率见表1所述。
将实施例1-5和对比例1获得的硫酸软骨素钠的各项性能进行检测，数据见表2。
将实施例1-5和对比例1获得的牛气管肽按照GB31645-2018标准检测，数据见表3。
表1硫酸软骨素钠和牛气管肽收率表
表2硫酸软骨素钠检测数据汇总表
表3牛气管肽检测数据汇总表
从表1中的数据可以看出，实施例1-5中硫酸软骨素钠的收率和牛气管肽的收率均高于对比例1，从表2和表3中的数据可以看出，实施例1-5获得的硫酸软骨素钠和牛气管肽的质量均优于对比例1获得的硫酸软骨素钠和牛气管肽的质量，且对比例1中絮凝物体积为14.5cm3，实施例5中絮凝物体积为1.8cm3，分层静置时间由120min缩短到30min，以上数据说明本发明提供的工艺实现了直接用新鲜或干牛气管提取硫酸软骨素钠和肽，缩短了生产时间，提高了硫酸软骨素钠和肽的收率，提高了牛气管的综合效益。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
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