一种抑制赭曲霉生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液及其制备方法
阅读说明：本技术 一种抑制赭曲霉生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液及其制备方法 (Cinnamaldehyde pickering emulsion for inhibiting aspergillus ochraceus growth and producing toxin and preparation method thereof ) 是由 王龑 林威 孙培龙 管乐 蔡铭 杨开 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制赭曲霉抑生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液及其制备方法。所述乳液中肉桂醛含量为5～30g/L,壳聚糖含量为0.125～0.625g/L,玉米蛋白含量为2.5～12.5g/L,乙醇含量为125～250mL/L,乙酸含量为0.5～1.25mL/L。本发明肉桂醛生物资源在我国来源广、生产工艺简易、成本低、具有挥发性；对人畜安全性好,已被列入食品添加剂目录(GB 2760-2014食品安全国家标准-食品添加剂使用标准)；本发明思路新颖,乳液制备方法简单、快捷、高效,制备的肉桂醛皮克林乳液在较长时间内能保持良好的稳定性,实用性强；本发明作为乳化剂的固体颗粒(壳聚糖、玉米蛋白)来源广泛,安全无毒,可降解。本发明制备的肉桂醛皮克林乳液应用于抑制赭曲霉生长和产毒的效果好,可直接应用于粮食谷物的防霉保藏。(The invention discloses a cinnamaldehyde pickering emulsion for inhibiting aspergillus ochraceus from inhibiting growth and producing toxin and a preparation method thereof. The emulsion contains 5-30 g/L of cinnamaldehyde, 0.125-0.625 g/L of chitosan, 2.5-12.5 g/L of zein, 125-250 mL/L of ethanol and 0.5-1.25 mL/L of acetic acid. The cinnamaldehyde biological resource has wide source, simple production process, low cost and volatility in China; the food additive has good safety to human and livestock and is listed in the food additive catalogue (GB 2760-; the invention has novel thought, the emulsion preparation method is simple, quick and efficient, and the prepared cinnamaldehyde pickering emulsion can keep good stability for a long time and has strong practicability; the solid particles (chitosan and zein) used as the emulsifier have wide sources, are safe, nontoxic and degradable. The cinnamaldehyde pickering emulsion prepared by the invention has good effects of inhibiting aspergillus ochraceus growth and producing toxin, and can be directly applied to mildew-proof preservation of grain grains.)
(一)技术领域
本发明涉及一种抑制赭曲霉生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液及其制备方法，属于乳液包埋及抗菌技术领域。
(二)背景技术
肉桂醛(英文：Cinnamaldehyde)是一种醛类有机化合物，为黄色黏稠状液体，大量存在于肉桂等植物体内。自然界中天然存在的肉桂醛均为反式结构，该分子为一个丙烯醛上连接上一个苯基，因此可被认为是一种丙烯醛衍生物。肉桂醛为GB2076-2014规定的允许使用的食品用合成香料，可用于制备肉类、调味品、口腔护理用品、口香糖、糖果用香精，也可以作为防腐剂，用于经表面处理的鲜水果的防腐保藏。分子式为：C9H8O，分子量：132.16。
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)是属于散囊菌目发菌科曲霉属的一种丝状真菌，在玉米、花生、咖啡、棉籽、坚果、水果等农产品中广泛分布。赭曲霉导致上述食品霉变变质，食品营养品质和加工品质大幅度下降，造成巨大的经济损失。赭曲霉产孢能力很强，其孢子散落在空气中能够诱导儿童哮喘和人类肺病。其次级代谢产物，赭曲霉毒素A(OTA)广泛分布在农产品中，污染谷物、葡萄、咖啡豆、饲料和香辛料等，OTA还会随食物链最终进入人体，严重危害人体健康。毒理学研究表明，OTA主要损害肝脏和肾脏，具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，大量的毒素也可能引起肠粘膜炎症甚至坏死；OTA被认为是目前致癌力最强的天然物质之一，被IARC定为二级致癌物。
由于赭曲霉毒素A(OTA)的毒性，国内外都公布了食品和饲料中OTA的限 量标准，以规范生产，控制OTA的污染，最大限度地保障人和动物的食用安全， 表1列举了欧盟、中国赭曲霉毒素的限量标准。
表1：欧盟、中国对食品中OTA先行的限量标准
肉桂醛是能够高效抑制赭曲霉生长的安全、无毒的天然活性物质。然而由于肉桂醛易挥发、和氧化等原因，在环境中存留时间过短而无法发挥其生物活性，在很大程度上会降低肉桂醛的防治效果和持效期。
因此，开发一种具有聚结稳定性高、承载能力强、包封物保护能力强、释放速率低、安全性好、生物降解性好、生物相容性好等优点的乳液来包封肉桂醛，具有十分重要的经济价值和社会意义。
(三)
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制赭曲霉生长和产毒的聚结稳定性高、承载能力强、包封物保护能力强、释放速率低、安全性好、生物降解性好、生物相容性好的肉桂醛皮克林乳液，使其作为一种天然的赭曲霉生长抑制剂。
本发明采用的技术方案是：
一种抑制赭曲霉生长的肉桂醛皮克林乳液，由肉桂醛、乳化剂和水组成，所述乳化剂为壳聚糖、玉米蛋白采用超声法制备的胶体颗粒，制备所述乳液的主要原料组成如下：
余量为水。
优选的，制备所述乳液的主要原料组成如下：肉桂醛29.3g/L，壳聚糖0.125 g/L，玉米蛋白2.5g/L，乙醇175mL/L，乙酸0.75mL/L，余量为水。
所述胶体颗粒的平均粒径为77nm左右，所述乳液的平均粒径为573nm左右。
本发明还涉及制备所述抑制赭曲霉生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液的方法，所述方法包括：
(1)称取配方量壳聚糖，置于容器中，加入1％乙酸水溶液(每0.1g壳聚糖加入约50～100mL 1％乙酸水溶液)，用搅拌器搅拌至透明，得壳聚糖溶液；
(2)称取配方量玉米蛋白，加入步骤(1)所得壳聚糖溶液中，并加入乙醇(每1g玉米蛋白加入约50～100mL乙醇)，用搅拌器搅拌至均匀，得玉米蛋白-壳聚糖复合液体；
(3)将步骤(2)所得玉米蛋白-壳聚糖复合液体用探头式超声波萃取仪超声5～10min，得到清澈透明的玉米蛋白-壳聚糖溶液(后续操作加水稀释后可形成胶体，以粒度分析仪分析得到胶体颗粒平均粒径为77nm左右)；
(4)取肉桂醛，加入步骤(3)所得溶液中，立即振荡混匀，立即将适量水迅速倾倒至添加了肉桂醛的溶液中，用搅拌器搅拌至均匀，即得所述的抑制赭曲霉生长和产毒的肉桂醛皮克林乳液。
优选的，步骤(1)中，用磁力搅拌器以800～1000r/min转速搅拌1～2h。
步骤(2)中，用磁力搅拌器以800～1000r/min转速搅拌1～2h。
步骤(3)中，探头式超声波萃取仪选用20mm钛合金探头，600～1200w 功率，超声3～5min。
步骤(4)中，用磁力搅拌器以200～600r/min转速搅拌5～10min。
在我国，肉桂醛来源广、生产工艺简易、成本低、具有挥发性，对人畜安全性好，已被列入食品添加剂目录(GB 2760-2014食品安全国家标准-食品添加剂使用标准)，且对环境无污染，并且有清香，有效期可达一年以上。皮克林乳液是一种由胶体代替表面活性剂稳定的乳液。表面活性剂通常形成具有较大表面侧向扩散系数的流体界面，其吸附/解吸过程在很短的时间内是动态的。与表面活性剂不同的是，一旦胶体被吸附在油水界面上，它们就会被有效地、不可逆地固定在那里，因此皮克林乳剂与常规乳剂相比的一个主要优点是其抗聚结性高。本发明将肉桂醛制成皮克林乳液，安全性好，具有缓释效果，对长效抑菌具有重要意义。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种抑制赭曲霉生长和产毒的聚结稳定性高、承载能力强、包封物保护能力强、释放速率低、安全性好、生物降解性好、生物相容性好的肉桂醛皮克林乳液，作为一种天然的赭曲霉生长抑制剂、效果好且安全无毒副作用。
(四)附图说明
图1为实施例中制备的肉桂醛皮克林乳液在长期保藏中的外观图；
图2为实施例中制备的肉桂醛皮克林乳液的扫描电镜图；
图3为实施例中制备的不同浓度的肉桂醛皮克林乳液对赭曲霉生长的影响。
图4为实施例中制备的肉桂醛皮克林乳液对玉米中赭曲霉的生长、产毒量和产毒能力的影响。
(五)
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
实施例中，使用的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)购于CGMCC，该菌株在 CGMCC的编号为3.4412；在本文的说明书中表示成CGMCC No.3.4412。
实施例1：肉桂醛皮克林乳液的制备
(1)称取0.025g壳聚糖，置于容器中，加入15ml 1％(v/v)乙酸水溶液，磁力搅拌器以1000r/min搅拌2h至透明，得壳聚糖溶液；
(2)称取0.5g的玉米蛋白(麦克林，Z822847)，加入步骤(1)所得壳聚糖溶液中，加入35ml无水乙醇，磁力搅拌器以1000r/min搅拌 2h，得玉米蛋白-壳聚糖复合液体；
(3)将步骤(2)所得玉米蛋白-壳聚糖复合液体用探头式超声波萃取仪 (20mm钛合金探头，1200w功率)超声5min，得到清澈透明的含玉米蛋白-壳聚糖溶液；
(4)取5.86g肉桂醛，加入步骤(3)所得溶液中，立即振荡混匀，立即将150ml水迅速倾倒至溶液中，用搅拌器搅拌至均匀，即得所述的抑制赭曲霉生长及产毒的肉桂醛皮克林乳液。
图1为制备的含肉桂醛的乳液在长期保藏中的外观图；图2为制备的含肉桂醛的乳液的扫描电镜图。图1说明肉桂醛皮克林乳液在较长时间的放置后仍能有较好的稳定性，从15天后开始，肉桂醛皮克林乳液颜色开始变暗，乳液稳定性逐渐变差；图2说明肉桂醛皮克林乳液中含被壳聚糖和玉米蛋白包封的肉桂醛，它们能形成球状的乳滴。
实施例2：肉桂醛熏蒸抑菌效果测定
PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15分钟，降温到55℃左右倒平板，每平板20mL。
菌种活化：将赭曲霉(CGMCC No.3.4412)接种于PDA培养基上，28℃下生长7天，4℃储藏。
赭曲霉孢子液制备：用无菌水洗下平板培养基上的赭曲霉孢子溶于0.01％吐温80中，用无菌水稀释初始孢子液至孢子浓度为1×106cfu/mL。
将赭曲霉菌悬液10μL(1×106cfu/mL)接种于PDA培养基中央至完全吸收。将3片直径为8mm的灭菌滤纸片对称放置于培养皿盖的边缘，肉桂醛皮克林乳液分别20、40、60μL于不同培养皿中，使之均匀吸附于滤纸片上，空白不添加肉桂醛，使肉桂醛的浓度范围8～32μL/L，每个做3个平行，培养皿用封口膜密封后放入自封袋中，置于培养箱中28℃培养，培养6天。从第二天开始，每天测量一次菌落直径，采用十字交叉法测定两次，结果取平均值，结果见图3。
结果表明，所有含肉桂醛的乳液均能显著抑制赭曲霉的生长，抑制效果随着肉桂醛浓度的升高而增强。16μL/L的肉桂醛乳液抑制率达到33.9％，32μL/L 的肉桂醛乳液能完全抑制赭曲霉生长(抑制率达100％)。
实施例3：肉桂醛熏蒸对玉米中的赭曲霉生长和产毒效果测定
玉米：取50g玉米渣，装入250mL锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。
菌种活化：将赭曲霉(CGMCC No.3.4412)接种于PDA培养基上，28℃下生长7天，4℃储藏。
赭曲霉孢子液制备：用无菌水洗下平板培养基上的赭曲霉孢子溶于0.01％吐温80中，用无菌水稀释初始孢子液至孢子浓度为1×106cfu/mL。
取赭曲霉菌悬液10μL溶于10mL无菌水，接种于玉米渣中，混匀。
将1片直径为16mm的灭菌滤纸片悬空固定于锥形瓶中央，肉桂醛皮克林乳液300μL于不同锥形瓶中，使之均匀吸附于滤纸片上，空白不添加肉桂醛，每组3个平行，锥形瓶用封口膜密封后放入自封袋中，置于培养箱中28℃培养，培养14天。
OTA：培养结束后，取15g玉米溶于100mL 80％(v/v)甲醇，高速振荡提取，离心取上清，氮吹浓缩，高效液相色谱(HPLC)测定OTA含量，结果见图4。
麦角甾醇：培养14天后，取15g玉米溶于100mL 0.03mol/L KOH乙醇溶液中，高速振荡，超声波辅助皂化提取，离心取上清，氮吹浓缩，HPLC测试麦角甾醇含量，作为赭曲霉生物量的指标，结果见图4。计算单位玉米中OTA与麦角甾醇的含量比例，作为其产毒能力，结果见图4。
结果表明，肉桂醛皮克林乳液熏蒸处理后，玉米中赭曲霉麦角甾醇的含量降低了44.9％，OTA含量降低了84.3％，单位麦角甾醇中OTA的含量降低了 71.6％，表明肉桂醛皮克林乳液可以显著抑制玉米中赭曲霉的生长、产毒量和产毒能力。
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