一种别熊去氧胆酸的合成方法
阅读说明：本技术 一种别熊去氧胆酸的合成方法 (Synthetic method of alloursodeoxycholic acid ) 是由 秦和平 张和平 祝国祥 林志锋 凌芬娜 于 2021-01-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种别熊去氧胆酸的合成方法,该方法以别鹅去氧胆酸为起始原料,加入磷酸缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、乳酸脱氢酶、7-α类固醇脱氢酶、丙酮酸钠,进行反应,高温灭活酶后再降温；再加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶反应,高温灭活酶后再降至常温；再经过滤、洗涤、干燥等步骤得到别熊去氧胆酸。全过程包括别鹅去氧胆酸的氧化反应、还原反应步骤,合成别熊去氧胆酸。该方法整个反应过程在水溶液中进行,不使用有机溶剂,工艺简单、容易操作,得到的别熊去氧胆酸的纯度达到98.5％以上,可作药学研究机构进行毒理药理等药学性质样品使用,也可以作为熊去氧胆酸质量研究时的杂质对照品使用。(The invention discloses a synthetic method of alloursodeoxycholic acid, which takes allochenodeoxycholic acid as a starting material, adds phosphate buffer solution, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, lactate dehydrogenase, 7-alpha steroid dehydrogenase and sodium pyruvate for reaction, inactivates enzymes at high temperature and then cools; adding L-sodium malate, malate dehydrogenase and 7-beta steroid dehydrogenase for reaction, inactivating the enzymes at high temperature, and cooling to normal temperature; filtering, washing, drying, etc. to obtain the alloursodeoxycholic acid. The whole process comprises the steps of oxidation reaction and reduction reaction of allochenodeoxycholic acid to synthesize alloursodeoxycholic acid. The method has the advantages that the whole reaction process is carried out in aqueous solution, no organic solvent is used, the process is simple and easy to operate, the purity of the obtained alloursodeoxycholic acid reaches more than 98.5 percent, and the alloursodeoxycholic acid can be used as a sample of pharmacological properties such as toxicology and pharmacology of a pharmaceutical research institution and can also be used as an impurity reference substance in the quality research of the ursodeoxycholic acid.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种别熊去氧胆酸的合成方法。
背景技术
熊去氧胆酸UDCA是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白基酶来增加胆汁淤积的作用。熊去氧胆酸还能竞争性地取代细胞磨合细胞器上的毒性胆酸分子，防止肝细胞和胆管细胞受到更多毒性胆酸的损害。在临床上，熊去氧胆酸主要用于溶解胆固醇型胆结石，原发性胆汁肝硬化PBC，慢性丙型肝炎，同时还用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性复发性肝内胆汁淤积症、先天性内胆管囊性扩张症。
随着人类对熊去氧胆酸认识的不断深入，熊去氧胆酸的使用量大量增加，原来以胆酸和鸡胆汁提取的鹅去氧胆酸为原料合成的熊去氧胆酸产量已经无法满足人类的需要。现在市场上出现了一些从鸭胆汁中提取的鹅去氧胆酸为原料合成的熊去氧胆酸。以鸭胆汁为原料提取的鹅去氧胆酸中含有少量的别鹅去氧胆酸，别鹅去氧胆酸通过熊去氧胆酸合成过程中的氧化、还原反应将生成别熊去氧胆酸(3α，7β-二羟基-5α-胆甾烷酸)。别熊去氧胆酸可以用作药学研究机构对其性质进行研究，也可以作为研究熊去氧胆酸时的杂质对照品。因此制备高纯度的别熊去氧胆酸，并对其进行研究具有一定的意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种以别鹅去氧胆酸为原料合成别熊去氧胆酸的方法，本方法合成的别熊去氧胆酸纯度高，可以用作药学研究机构进行毒理药理等药学性质样品使用，也可以作为研究熊去氧胆酸时的杂质对照品使用。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种别熊去氧胆酸的合成方法，所用原料为别鹅去氧胆酸，包括具体步骤如下：
a.别鹅去氧胆酸的氧化反应
将别鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液调节溶液pH至7.5～8.5，溶解，再加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、乳酸脱氢酶、7-α类固醇脱氢酶、丙酮酸钠，控制溶液温度为25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应，直到别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量小于1％；
待反应完成后升温，搅拌，再降温；
b.别7-酮基石胆酸的还原反应
在步骤a得到的反应液中加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应，直到别7-酮基石胆酸在溶液中的残留浓度小于0.1％；
待反应完成后，加入氢氧化钠溶液调节溶液pH，升温、搅拌、再降至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸调节溶液pH，再过滤、洗涤、干燥得到别熊去氧胆酸。
所述a步骤中磷酸缓冲液的物质的量浓度为50～100mmol/L。
所述a步骤中别鹅去氧胆酸和磷酸缓冲液质量体积比为1g:10ml。
所述a步骤中：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的加入量是别鹅去氧胆酸质量的0.10～0.30％；
乳酸脱氢酶的加入量是别鹅去氧胆酸质量的0.10～0.30％；
7-α类固醇脱氢酶的加入量是别鹅去氧胆酸质量的0.30～0.50％；
丙酮酸钠的加入量是别鹅去氧胆酸质量的30～50％。
所述a步骤反应完成后，将溶液升温至40～80℃，搅拌20～60min，使所述乳酸脱氢酶和7-α类固醇脱氢酶失活，然后再降温至25～30℃，以便后续反应的进行。
所述b步骤中：
L-苹果酸钠的加入量是别鹅去氧胆酸质量的40～70％；
苹果酸脱氢酶的加入量是别鹅去氧胆酸质量的1.0～3.0％；
7-β类固醇脱氢酶的加入量是别鹅去氧胆酸质量的0.10～0.30％。
所述b步骤中滤液添加的酸优选无机酸。
所述b步骤反应完成后，加入10％氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0～8.5，升温至60～80℃，搅拌1～3h，使所述苹果酸脱氢酶和7-β类固醇脱氢酶彻底失活，再降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸调节溶液pH至2～3，再过滤、洗涤、干燥得到别熊去氧胆酸。
用高效液相色谱仪(HPLC)检测所述反应得到的别熊去氧胆酸的纯度。
本发明的优点和有益效果如下：
本发明提供一种以别鹅去氧胆酸为起始原料合成高纯度别熊去氧胆酸的方法。得到的别熊去氧胆酸纯度达到98.5％以上，完全能够满足研究机构对其性质进行研究的需求，也可以作为熊去氧胆酸质量研究时的杂质对照品使用。
附图说明
图1为别熊去氧胆酸合成流程图。
其中：ACDCA——别鹅去氧胆酸；A7-KLCA——别7-酮基石胆酸；AUDCA——别熊去氧胆酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
如图1所示，一种别熊去氧胆酸的合成方法，包括以下步骤：
a.别鹅去氧胆酸(ACDCA)的氧化反应
将别鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入与别鹅去氧胆酸质量体积比为1g:10ml，物质的量浓度为50～100mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至7.5～7.8，搅拌溶解，再加入所述别鹅去氧胆酸重量0.15％的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、0.15～0.18％的乳酸脱氢酶(LDH)、0.30～0.35％的7-α类固醇脱氢酶(7-αHSDH)、30～35％的丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃，pH至7.5～8.0进行反应，直到别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量小于1％；
待反应完成后将溶液升温至50～55℃，搅拌30min，然后再降温至25～30℃；
b.别7-酮基石胆酸(A7-KLCA)的还原反应
在上述步骤a得到的反应液中加入所述别鹅去氧胆酸重量45～50％的L-苹果酸钠、1.8％的苹果酸脱氢酶(MDH)、0.15～0.20％的7-β类固醇脱氢酶(7-βHSDH)，控制溶液温度在25～30℃，pH至6.8～7.2进行反应，直到别7-酮基石胆酸在溶液中的残留浓度小于0.1％；
待反应完成后，再加入10％氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0～8.5，升温至70～75℃，搅拌2h，再降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸调节溶液pH至2～3，再过滤、洗涤、干燥得到别熊去氧胆酸(AUDCA)。
实验完成后，用高效液相色谱仪(HPLC)检测得到的别熊去氧胆酸的纯度，读取并记录相应的数据。
实施例1
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至7.8，搅拌溶解，再加入15mg NADP、15mg LDH、30mg 7-αHSDH、3.3g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.73％。反应完成后升温至55℃并搅拌30min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入4.5g L-苹果酸钠、0.18g MDH、15mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.06％。
反应完成后，加入少浓度为量10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.2，升温至75℃，并搅拌2h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.59，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.6g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为98.761％。
实施例2
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为75mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.0，搅拌溶解，再加入15mg NADP、18mg LDH、35mg 7-αHSDH、3.5g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.66％。反应完成后升温至50℃并搅拌30min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入4.6g L-苹果酸钠、0.18g MDH、16mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.05％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.2，升温至74℃，并搅拌2h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.65，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.6g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为98.700％。
实施例3
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为100mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.2，搅拌溶解，再加入15mg NADP、18mg LDH、35mg 7-αHSDH、3.5g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.3％。反应完成后升温至55℃并搅拌30min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入4.8g L-苹果酸钠、0.18g MDH、18mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.5～7.5进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.04％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.3，升温至73℃，并搅拌2h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.74，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.7g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为98.650％。
实施例4
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至7.5，搅拌溶解，再加入10mg NADP、30mg LDH、30mg 7-αHSDH、3.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.84％。反应完成后升温至40℃并搅拌60min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入4.0g L-苹果酸钠、0.10g MDH、15mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.08％。
反应完成后，加入少浓度为量10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.0，升温至60℃，并搅拌3h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.68，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.1g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为99.188％。
实施例5
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为75mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.0，搅拌溶解，再加入20mg NADP、18mg LDH、40mg 7-αHSDH、4.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.78％。反应完成后升温至60℃并搅拌40min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入7.0g L-苹果酸钠、0.3g MDH、30mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.07％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.2，升温至80℃，并搅拌1h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.02，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.2g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为99.273％。
实施例6
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为100mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.4，搅拌溶解，再加入30mg NADP、10mg LDH、50mg 7-αHSDH、5.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.68％。
反应完成后升温至80℃并搅拌20min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入5.5g L-苹果酸钠、0.2g MDH、20mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.5～7.0进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.07％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.3，升温至76℃，并搅拌2h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.78，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.3g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为99.167％。
实施例7
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至7.6，搅拌溶解，再加入20mg NADP、10mg LDH、40mg 7-αHSDH、4.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.87％。反应完成后升温至80℃并搅拌25min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入7.0g L-苹果酸钠、0.2g MDH、20mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.08％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.2，升温至80℃，并搅拌1h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.95，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.1g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为99.295％。
实施例8
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为75mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.2，搅拌溶解，再加入30mg NADP、18mg LDH、30mg 7-αHSDH、5.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.74％。反应完成后升温至40℃并搅拌60min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入5.5g L-苹果酸钠、0.10g MDH、10mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.8～7.2进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.06％。
反应完成后，加入少浓度为量10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.2，升温至75℃，并搅拌2h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.16，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.3g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为99.202％。
实施例9
在500ml反应瓶中加入10g别鹅去氧胆酸，加入100ml物质的量浓度为100mmol/L的磷酸缓冲液调节溶液pH至8.5，搅拌溶解，再加入10mg NADP、30mg LDH、50mg 7-αHSDH、3.0g丙酮酸钠，控制溶液温度在25～30℃、pH至7.5～7.8进行反应5h，取样测别鹅去氧胆酸在溶液中的残留量为0.51％。反应完成后升温至60℃并搅拌40min，然后再降温至25～30℃。
在上述反应液中加入4.0g L-苹果酸钠、0.3g MDH、30mg 7-βHSDH，控制溶液温度在25～30℃、pH至6.5～7.5进行反应3h，取样测出别7-酮基石胆酸残留低于0.05％。
反应完成后，加入少量浓度为10％的氢氧化钠调节溶液pH为8.3，升温至60℃，并搅拌3h，然后降温至30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸，调节溶液pH为2.88，过滤、洗涤、干燥，得到别熊去氧胆酸9.4g。
经HPLC检测得到别熊去氧胆酸的纯度为98.906％。
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