一种单萜骈香豆素类化合物、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种单萜骈香豆素类化合物、制备方法及其应用 (Monoterpenocoumarin compound, preparation method and application thereof ) 是由 邹忠梅 张涛 赵晨旭 于 2021-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种的单萜骈香豆素类化合物,其结构式为：I,该类化合物具有显著的降糖活性,且低于现行药物的毒性；本发明还提供了该种化合物的制备方法,所述化合物从大丁草属植物中,采用低级醇-水粗提取,粗提取物使用石油醚进行萃取,而后萃取物使用硅胶柱层析,使用以石油醚-二氯甲烷洗脱,而后再次采用硅胶柱层析,使用石油醚-二氯甲烷梯度洗脱,得到所述化合物。(The invention provides a monoterpenocoumarin compound, the structural formula of which is as follows:)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种单萜骈香豆素类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病是一种代谢性、终身性疾病，其并发症严重威胁着人类的健康。其中α-葡萄糖苷酶抑制剂已被作为单纯饮食控制不佳II型糖尿病患者的首选降糖药物，以及I型糖尿病患者在使用胰岛素治疗时的首选辅助药物，临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖，米格列醇和伏格列波糖等。目前，临床上可选择的α-葡萄糖苷酶抑制剂均为化学合成，虽然有一定的降血糖效果，但其种类少、作用效果有限，因此，寻找活性更好、使用更安全的α-葡萄糖抑制剂是极其必要的。
大丁草属(Gerbera)为菊科(Asteraceae)多年生草本植物，全球有近80种，我国拥有20种，主要产于云南、西藏、贵州等省区，该属多个植物是我国少数民族沿用已久的重要药材，多用以治疗咳嗽、肠炎、尿路感染、虫蛇咬伤等症。该属植物资源丰富，具有重要的开发利用价值，该类植物未见其具有降糖活性成分或与本发明所述化合物的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种单萜骈香豆素类化合物，其结构新颖，具有笼状[4.2.2.03,8]癸烯骨架，且降糖活性更强，是对现有降糖药物备选分子不足的很好补充。
本发明提供了一种单萜骈香豆素类化合物，包括结构式I所示化合物，或结构式I所述化合物的异构体、晶型化合物、水合物、溶剂化物、或其生理上可接受的盐，
本发明的单萜骈香豆素类化合物是一种结构新颖的骈合化合物，具有独特的笼状[4.2.2.03,8]癸烯结构，分子式：C20H22O3，具有16种手性基团(具有4个手性中心，理论上具有16个手性化合物)，化学名：(3S,4R,11R,14S)-gerbeloid A和(3R,4S,11S,14R)-gerbeloidA，对应结构式II和结构式III。
目前具有癸烯结构的化合物没有文献报道，癸烯结构化合物很少，基本上都是合成的化合物，但未见其活性报道。
发明人在对大丁草属植物成分的研究过程中，惊喜地发现了结构式为I的化合物，该化合物在降糖方面表现出了良好的活性，实验表明，该化合物降糖效果比公认效果的米格列醇(75mg-150mg/天，成人用量)更优。该化合物的结构及其在降糖方面的活性未见任何报道。
进一步保护该类化合物的生理上可接受的盐，主要是指单萜骈香豆素类衍生物的无机酸盐或有机酸盐，其中的无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸或氢碘酸；有机酸为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、草酸、马来酸、琥珀酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、天冬氨酸、苯苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫代氰酸、对-甲苯磺酸盐和十一烷酸盐等，优选酒石酸、柠檬酸、乙二酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、苯磺酸。成盐后既不影响药效，又可进一步提高其溶解性；进一步优选为盐酸盐或马来酸盐。
本发明所述的化合物结构式如(II)或(III)分别为：
上述II和III的两个化合物为镜面手性对称结构。
申请人通过柱层析得到通式I所述结构后，发现无旋光现象，这也是提取实验中极少碰到的，根据自己的经验判断，应当是该类化合物具有手性异构的可能。因此通过手性柱的提取，意外发现了两种手性对称的结构，而且意外发现单独化合物比化合物的混合物的效果更强。
实验证实了本发明化合物中的2个化合物及其二者混合物均具有降糖活性，而它们在结构上的区别在于立体构型不同，由此，可以推断降糖活性主要与母核结构有关，故推断所述式(I)化合物均具有降糖活性。
本发明的目的还在于提供通式I化合物的制备方法，该方法为：用有机溶剂提取大丁草属植物的花、根、茎叶或全株，提取物用石油醚萃取，取石油醚萃取物经过柱层析采用石油醚-二氯甲烷梯度洗脱，得到所述结构式I所述的化合物。
所述的大丁草属植物包括大丁草、毛大丁草、石上大丁草、弯苞大丁草、非洲菊、早花大丁草、合缨大丁草、长喙大丁草、丽江大丁草、箭叶大丁草、翼齿大丁草、红缨大丁草、晚花大丁草、蒙自大丁草、钩苞大丁草、阔舌大丁草、巨头大丁草、白背大丁草、光叶大丁草、钝苞大丁草等。本发明优选以毛大丁草为提取原料。药用部位优选为全草。
上述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙醚及乙酸乙酯中的一种，优选甲醇、乙醇或丙酮。所述有机溶剂可以为纯品或与各类浓度的其溶液。考虑到安全性和成本问题等因素，进一步优选为浓度50-95％乙醇，最优选为浓度90-95％乙醇。提取方法为冷浸或热回流提取法。
上述制备方法进一步为：用浓度为50-95％的低级醇提取大丁草属植物的花、根、茎叶或全草，提取物用水分散后依次用石油醚萃取，取石油醚部分，回收石油醚，得到的萃取物过层析柱分离得到结构式I所示化合物，该结构式I所示化合物再经过制备液相色谱及手性制备液相色谱可得到高纯度单体化合物，所述的高纯度是指纯度不低于98％。
所述的低级醇包括甲醇和乙醇。所述萃取的步骤中，提取物加4-6倍量的水进行分散，水相与有机相的体积比为(1:3)～(3:1)，优选为1:1；萃取以两层均澄清为终点，萃取次数为1～5次。溶剂回收方法为本领域常规方法。
所述得到的通式(I)化合物为石油醚部分有效部位。石油醚部分有效成分为固体装填，参加硅胶柱层析，可以固体和填料混合的方式进行装柱，或者固体以(石油醚-二氯甲烷50％:50％)等溶剂溶解后，加入预装好的柱子上，而后进行洗脱程序，所述操作为本领域人员能够理解和完成的。
上述的柱层析包括：所述萃取物首先采用硅胶柱层析分离，用石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％，0:100％)进行梯度洗脱，收集0:100％(纯二氯甲烷)部分，回收溶剂至干，再采用硅胶柱层析进行纯化，以石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％)为洗脱剂洗脱，收集50％:50％洗脱液，回收溶剂至干，得到通式(I)化合物。优选以石油醚-二氯甲烷＝1:1为洗脱剂。
上述化合物的柱层析过后，需要通过薄层层析(TLC)分析，获得化合物主要集中在这个部分。
发明人采用石油醚-二氯甲烷进行梯度洗脱，目的是：富集有效成分，除去杂质。
而后收集纯二氯甲烷中的部分，判定方法是：通过薄层层析(TLC)，10％硫酸-乙醇进行显色，紫红色点为准。
而后再次采用石油醚-二氯乙烷进行梯度洗脱，目的是：进一步富集有效成分，除去杂质，
而后收集50％:50％洗脱液，判定方法是：通过薄层层析(TLC)，10％硫酸-乙醇进行显色，紫红色点为准。
收集的成分在HPLC上显示为一个峰，成分高于98％。
所述的硅胶柱层析，选用为粒径200～300目的柱层析硅胶，上样量为6.7％～10％，即上样量与硅胶重量比为(1:10)～(1:15)，梯度洗脱时，每个浓度洗脱液优选洗脱3～5柱体积。
因柱层析过程中影响流份的因素较多，所以，该过程中优选通过薄层检测法(TLC)来确定所需流份。即，通过薄层检测单萜骈香豆素类，254nm下有暗斑，5％浓硫酸显色(95℃烘5分钟)后显紫红色点。
所述化合物提取时，多次提取后证明，通过所述提取方法，得到的是一种化合物的镜面手性化合物的混合物，而且混合物均为式I所述化合物，所得到的的化合物具有与米格列醇同等的降糖活性。申请人进一步进行手性柱的提取，意外发现两种手型化合物是能够分开的，而且每一种化合物均具有比他们混合后更好的降糖活性，因为混合物无法确定质量占比，但按纯品粗略估算重量比接近1：1，但在降糖效果上，反而不如后面进一步分离的手性化合物，但依然与米格列醇的活性相当，因此该手性化合物的混合物具有了单独的药物活性成分的效果，但现有成果已经足以为后续的降糖药物开发提供了很多的候选化合物和组合，其中单独手性化合物的效果更强。
本发明尤其提供了所述通式Ⅰ化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用，特别是在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。
本发明的另一个目的在于，提供一种降糖的药物组合物，该组合物由有效剂量的本发明所述化合物及药学上可接受的辅料制成。所述的有效量是指5～50mg/天，所述的药学上可接受的辅料，是指为制成适用于人类或动物使用的任何药物剂型所需的辅料，如制成口服固体制剂时，药学上可接受的辅料指稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂；制成注射液时，药学上可接受的辅料指pH调节剂、助溶剂、抗氧剂、等渗剂等。
发明人通过以下实验来验证本发明化合物的有益效果。
总述，本发明采用了独特的提取方法，首次从大丁草属中提取获得了一类具有癸烯结构的化合物，鲜见于报道，且该类化合物的药学活性未见报道，因此，属于结构和活性均新颖的的结构，具有显著的降糖效果，优于现有的米格列醇，尤其是其手性化合物，比等比例手性化合物的混合降糖效果还要明显，这又是本发明第一次发现，毒性试验验证，本物质几乎无毒，为一种理想型的降糖候选分子，可以与药学上可接受的辅料构成药物组合物，制备为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、滴丸、注射剂、粉针剂，或气雾剂等剂型，应用于降糖药物的制备当中，特别是II型糖尿病的药物的制备当中，结论清晰，适合工业生产。
再次重申：以下实验只是本发明研发过程中众多实验中的举例性实验，并未涵盖和穷尽了发明人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明化合物的降糖活性。
药效部分：
对α-葡萄糖苷酶抑制作用
1.反应溶液的制备
(1)配制底物PNPG溶液：精确称取0.1506gPNPG(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成10mmol/L的的标准品溶液，备用。
(2)配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉(酶活力为100u/mg)用0.01mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。
(3)配制米格列醇标准溶液(抑制剂)：精确称取4.1mg米格列醇标准品，用移液枪准加0.01mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)溶解，配制成8mmol/L米格列醇标准母液。将母液分别稀释成4、2、1、750、500mmol/L五个不同梯度的标准品溶液，备用。
(4)0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。
2.α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应30min，结束后加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。
3.实验结果
表1实验结果
由表1可知，本发明所述通式Ⅰ中的化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显，已达到公认米格列醇的效果，而从通式I中获得的单体化合物II和III，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显强于米格列醇。
细胞毒作用
1.实验仪器和材料
HeLa(人宫颈癌癌细胞株)、LoVo(人结肠癌细胞株)、BGC-823(人胃癌细胞株)、MCF-7(人宫颈癌癌细胞株)；6孔细胞培养板(Costar公司)，酶标仪(雷勃MK-3)，二氧化碳孵箱(美国Forma公司)，XDS-1B倒置显微镜(日本Nicon公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma公司)，胎牛血清，DMEM培养基(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，二甲亚砜(DMSO)(Acros公司)。
2.实验方法
受试样品以适量DMSO溶解，配成的母液避光储存备用，临用时用不含血清的细胞培养液稀释至不同浓度，0.22μm滤膜除菌。(DMSO终浓度<1％)。阳性对照组：顺铂(Cisplatin)配置方法同上所述。
取对数生长期的细胞，通过细胞计数的方法调整细胞密度为2×104个/mL，接种于96孔培养板上，每孔加入100μL，置于5％CO2饱和湿度条件下的温箱中，37℃恒温培养8～12h，待其贴壁后，加入不同浓度待测药物，作用4d。同时分设空白对照组、阴性对照组、给药组，每组设4个复孔。样品或药物作用4d后，吸尽液体，每孔加入100μL培养液和10μL MTT(5mg/mL)，于37℃下继续孵育4h，吸除培养液后每孔加入150μL DMSO，微量振荡器振荡使彻底混匀，待甲臜颗粒完全溶解后，使用酶标仪于540nm处用空白对照组凋零，测定各孔光密度OD值，并计算抑制率。
抑制率IR％＝[(OD阴性对照-OD给药组)/OD阴性对照]x 100％
采用Origin统计软件进行实验数据的统计分析，以抑制率和药物浓度对数采用两参数logistic函数拟合作图。纵坐标代表logit单位，曲线转换成直线，它与抑制率y＝50相交处横坐标的数值即为待测样品的IC50值。各组数据用平均值士标准差(Mean士SD)表示，采用双侧t检验进行组间统计学比较，p<0.05代表有统计学意义。
表2实验结果
结论：根据常规毒性试验的常识，当IC50大于200μM，即说明在现有的溶解条件下，所述化合物几乎不产生任何毒性，这也是本发明发现此类化合物的另一个亮点。
具体实施方式
下述实施例未特定指出，均为室温进行，相关浓度的溶液，如果未特定指出，均为水溶液。
实施例中所述约字，指的接近，不需要描述浮动范围，属于本领域人员能够清晰操作的技术描述。
实施例1：
通式(I)化合物的制备：
取干燥的毛大丁草(Gerbera piloselloides)全草30kg用10倍量的95％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，回收乙醇，得干浸膏2100g，提取物(干浸膏)用加水(约6L，例如5-7L)分散，依次用等体积的石油醚萃取，萃取3次，收集石油醚部分，回收溶剂，得到的石油醚萃取物171g。将石油醚萃取物用硅胶柱(200-300目的柱层析硅胶，样品与硅胶质量比为1:10)层析纯化，用石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％，0:100％)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，收集二氯甲烷洗脱液，回收溶剂，得到通式(I)化合物的粗提物。该粗提取再采用硅胶柱层析进行纯化，以石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％)为洗脱剂洗脱，收集50％:50％洗脱液，洗脱5个柱体积，回收溶剂，得到所述化合物38g。(98％HPLC)
实施例2：
通式(I)化合物的制备：
取干燥的大丁草(Gerbera anandria)全草9.0kg用10倍量的95％乙醇冷浸提取3次，每次2天，合并提取液，回收乙醇，得干浸膏470g，提取物(干浸膏)用加约2.5L水分散，加两倍体积的石油醚萃取，萃取5次，取石油醚部分，回收溶剂，得到的石油醚萃取物207g。将石油醚萃取物用硅胶柱(200-300目的柱层析硅胶，样品与硅胶质量比为1:15)层析纯化，用石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％，0:100％)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，收集二氯甲烷洗脱液，回收溶剂，得到通式(I)化合物的粗提物。该粗提取再采用硅胶柱层析进行纯化，以石油醚-二氯甲烷(100％:0，50％:50％)为洗脱剂洗脱，收集50％:50％洗脱液，洗脱5个柱体积，回收溶剂，得到所述化合物58g。(98％HPLC)
实施例3：
与实施例1不同之处在于，被提取物为石上大丁草，药用部位为茎叶，所以溶剂为甲醇。得到所述化合物20g。(98％HPLC)
实施例4：
与实施例2不同之处在于，被提取物为非洲菊，药用部位为根，所以溶剂为丙酮。得到所述化合物10g。(98％HPLC)
实施例5：
与实施例1不同之处在于，被提取物为弯苞大丁草，所以溶剂为50％乙醇。到所述化合物14g。(98％HPLC)
实施例6：
化合物II的制备：
实施例1所得总化合物再分别采用prepHPLC(60％CH3OH)、semi-prepHPLC(60％-90％CH3OH-H2O 0～35min梯度洗脱)和手性制备(正己烷-异丙醇＝95:5)，得到化合物II，纯度98％以上，化合物III命名为(3S,4R,11R,14S)-gerbeloid A。
化合物II的理化数据如下：白色粉末，ECD(MeOH)λmax(Δε)210(-16.95),231(+19.71),251(-8.13)；UV(MeOH)λmax:215nm,IR(neat)vmax:2929,1748,1463,1386,1249,1100,1039,822cm-1；HRESIMS(pos.):m/z 311.1647[M+H]+(calcdfor C22H23O3,311.1635)；1H NMR(CDCl3，500MHz)和13C NMR(CDCl3，125MHz)数据如下。
以核磁共振法确认该化合物结构：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ7.00(1H,d,J＝7.5Hz,H-6)，7.20(1H,dd,J＝7.5,8.2Hz,H-7)，6.87(1H,d,J＝8.2Hz,H-8)，6.35(1H,d,J＝10.8Hz,H-9)，5.97(1H,d,J＝10.8Hz,H-10)，1.65(1H,m,H-12a)，1.84(1H,m,H-12b)，1.92(1H,m,H-13a)，2.06(1H,m,H-13b)，2.39(1H,dd,J＝12.0,4.8Hz,H-14)，2.47(3H,s,H-16)，1.30(3H,s,H-17)，1.09(3H,s,H-18)，1.13(3H,s,H-19)。13C NMR(CDCl3,125MHz)δ167.4(C-2)，49.5(C-3)，69.7(C-4)，124.1(C-4a)，138.5(C-5)，128.1(C-6)，129.7(C-7)，115.2(C-8)，151.1(C-8a)，126.2(C-9)，134.3(C-10)，69.9(C-11)，30.1(C-12)，18.3(C-13)，43.2(C-14)，45.0(C-15)，19.9(C-16)，27.8(C-17)，27.8(C-18)，21.2(C-19)。
实施例7：
化合物III的制备：
实施例1所得总化合物再分别采用prepHPLC(60％CH3OH)、semi-prepHPLC(60％-90％CH3OH-H2O 0～35min梯度洗脱)和手性制备(正己烷-异丙醇＝95:5)，得到化合物III(98％以上)，命名为(3R,4S,11S,14R)-gerbeloid A。
化合物II的理化数据如下：白色粉末，ECD(MeOH)λmax(Δe)209(+13.68),231(-16.93),251(+6.92)；UV(MeOH)λmax:215nm,IR(neat)vmax:2929,1748,1463,1386,1249,1100,1039,822cm-1；HRESIMS(pos.):m/z 311.1647[M+H]+(calcdfor C22H23O3,311.1635)；1H NMR(CDCl3，500MHz)和13C NMR(CDCl3，125MHz)数据如下。
以核磁共振法确认该化合物结构：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ7.00(1H,d,J＝7.5Hz,H-6)，7.20(1H,dd,J＝7.5,8.2Hz,H-7)，6.87(1H,d,J＝8.2Hz,H-8)，6.35(1H,d,J＝10.8Hz,H-9)，5.97(1H,d,J＝10.8Hz,H-10)，1.65(1H,m,H-12a)，1.84(1H,m,H-12b)，1.92(1H,m,H-13a)，2.06(1H,m,H-13b)，2.39(1H,dd,J＝12.0,4.8Hz,H-14)，2.47(3H,s,H-16)，1.30(3H,s,H-17)，1.09(3H,s,H-18)，1.13(3H,s,H-19)。13C NMR(CDCl3,125MHz)δ167.4(C-2)，49.5(C-3)，69.7(C-4)，124.1(C-4a)，138.5(C-5)，128.1(C-6)，129.7(C-7)，115.2(C-8)，151.1(C-8a)，126.2(C-9)，134.3(C-10)，69.9(C-11)，30.1(C-12)，18.3(C-13)，43.2(C-14)，45.0(C-15)，19.9(C-16)，27.8(C-17)，27.8(C-18)，21.2(C-19)。
本发明不局限于上述实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或相近似的产品，均不排除在本发明的保护范围之外。
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