一种抗菌壳聚糖基止血贴
阅读说明：本技术 一种抗菌壳聚糖基止血贴 (Antibacterial chitosan-based hemostatic patch ) 是由 张正男 段书霞 邵蕊娜 闫钧 付迎坤 常聪 周静 储旭 韩颖 柳小军 田林奇 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗菌壳聚糖基止血贴,包括从下到上依次设置的背衬层、止血层和保护层；所述背衬层为聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二酯制备的基材,其上涂有粘合剂；所述止血层包括下侧的无纺布和上侧的复合止血材料,所述复合止血材料为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶；所述保护层为PET薄膜。本发明提供的抗菌壳聚糖基止血贴,方便储存、携带,使用方便,不会对伤口产生刺激,具有良好的抗菌抗感染功效,能够通过粘附密封及激活凝血系统实现迅速凝血,且能够避免血管栓塞副作用的发生。(The invention discloses an antibacterial chitosan-based hemostatic patch, which comprises a back lining layer, a hemostatic layer and a protective layer which are sequentially arranged from bottom to top; the back lining layer is a base material prepared from polypropylene or polyethylene terephthalate, and is coated with an adhesive; the hemostatic layer comprises a non-woven fabric on the lower side and a composite hemostatic material on the upper side, and the composite hemostatic material is composite hydrogel prepared from modified chitosan, polyethylene glycol 2000, gelatin, xanthan gum, a tea polysaccharide-nano selenium compound, dopamine-modified nano silicon dioxide and oleamide; the protective layer is a PET film. The antibacterial chitosan-based hemostatic patch provided by the invention is convenient to store and carry, is convenient to use, does not stimulate wounds, has good antibacterial and anti-infection effects, can realize rapid blood coagulation by adhering and sealing and activating a blood coagulation system, and can avoid the side effect of vascular embolism.)
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种抗菌壳聚糖基止血贴。
背景技术
已有研究表明壳聚糖可黏附聚集红细胞和血小板，通过血小板的活化激活凝血途径，加速纤维蛋白胶的合成，刺激血管收缩，最终封合伤口。同时壳聚糖还具有一定的抗菌、止痛、促进伤口愈合及减少疤痕的作用，是一种理想的止血材料。然而单纯的壳聚糖材料，包括凝胶和纤维，其机械强度往往较弱。因此，研发性质稳定、安全无毒、具有良好的机械强度的壳聚糖基复合止血材料成为热点。现有技术在制备壳聚糖复合材料时为了提高材料的机械强度，大都需要用到交联剂，如对苯二甲醛、己二醛或戊二醛等，而残留的交联剂会对伤口造成刺激，不利于伤口愈合。
止血贴具有保存和使用方便，不易污染的优点，应用广泛。纳米硒具有良好的抗菌活性，但是其容易发生聚集而失活；而纳米二氧化硅具有良好的止血、吸水性能，能够激活凝血系统，也是制备复合止血材料常用的组分，但是粉体不稳定，容易聚集造成止血效果下降，还存在粉体脱落进入血管造成血管栓塞的风险，既能固载粉体保证其活性，使其充分发挥止血凝血功效，还能避免泄露是复合止血材料研发面临的难题。为改进复合止血材料贴合性、粘附性及避免粉状矿物泄露，研发人员通常采用增大材料黏度或提高材料致密性的方法，这又引发了止血材料难以与伤口分离，揭掉时造成二次伤害或材料舒适度变差的问题。
本发明为了解决上述问题，首先对纳米颗粒进行修饰改性，减少聚集，又通过改性壳聚糖与聚乙烯醇、明胶、黄原胶合理配比形成双网络结构对颗粒组分进行固定，在不使用交联剂的情况下避免了颗粒组分的泄露。
发明内容
本发明提供一种能直接用于创面、不会与伤口粘结，机械性能良好、安全无毒、抗感染的抗菌壳聚糖基止血贴及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种抗菌壳聚糖基止血贴，包括从下到上依次设置的背衬层、止血层和保护层；所述背衬层为聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二酯制备的基材，其上涂有粘合剂；所述止血层包括下侧的无纺布和上侧的复合止血材料，所述复合止血材料为改性壳聚糖、聚乙二醇2000、明胶、黄原胶、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅、油酸酰胺制备得到的复合水凝胶；所述保护层为PET薄膜。
进一步地，所述粘合剂为氨基甲酸酯甲基丙烯酸乙酯葡聚糖。
进一步地，所述无纺布由聚乳酸纤维、聚碳酸纤维、聚羟基乙酸纤维、聚己内酯纤维、聚丁二酸丁二醇酯纤维中的一种或几种制备得到。
进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入烷基醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
进一步地，所述烷基醛为己醛、十二醛、十八醛中的一种或几种。
进一步地，所述茶多糖-纳米硒复合物的制备方法为：将茶叶多糖冻干粉加去离子水配制成溶液，加入Vc溶液混合均匀后滴加亚硒酸钠溶液，振荡20～30s，40℃水浴条件下反应0.5～1h后，离心，沉淀加去离子水重悬浮，静置即得分散的球型茶多糖-纳米硒。
进一步地，所述Vc与亚硒酸钠的摩尔比为8:1。
进一步地，所述多巴胺修饰纳米二氧化硅的制备方法为：将质量比为20:1的纳米二氧化硅和盐酸多巴胺超声分散在pH＝8.0的弱碱溶液中，搅拌反应12～24h，离心分离，弃去上清液，沉淀用去离子水洗涤5次以上，冻干即得。
进一步地，所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖60～120份、聚乙二醇2000 2～4份、明胶16～32份、黄原胶8～16份、茶多糖-纳米硒复合物5～11份、多巴胺修饰纳米二氧化硅4～13份、油酸酰胺0.05～0.1份。
进一步地，所述明胶与黄原胶的重量份数比为2:1。
进一步地，所述所述改性壳聚糖、聚乙烯醇2000、明胶、黄原胶的重量份数比为30:1:8:4。
一种所述抗菌壳聚糖基止血贴的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、无纺布表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，分别加入EDC和NHS，将无纺布浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的无纺布；
步骤二、复合止血材料的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅超声处理40～60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应12～24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合止血材料；
步骤三、无纺布与复合止血材料的结合：将无纺布与复合止血材料叠置冷压，即得止血层；
步骤四、抗菌壳聚糖基止血贴的制备：将表面涂有粘合剂的背衬层按照尺寸要求分切，并与分切好的止血层粘合，止血层位于背衬层的中间，然后将保护层附于粘性背衬层胶面上，单独密封，辐照灭菌，即得抗菌壳聚糖基止血贴。
进一步地，步骤三中冷压采用的压力为2～4MPa，时间10～20min。
本发明无纺布表面可以接枝透明质酸，一方面透明质酸分子间存在较强的氢键作用提高了无纺布的力学性能，另一方面透明质酸具有非常优异的保持水分的作用，也进一步提高了无纺布的吸水保水性能。此外，多巴胺分子能够在无纺布表面进行自组装，通过自身聚合和与透明质酸的氨基反应对基材表面进行改性，使得改性后的无纺布表面具有良好的粘附性和亲水保水性。无纺布表面改性后无需使用粘合剂就能够在常温和较小压力条件下与复合止血材料结合，且结合牢固，有效避免了粘合剂对伤口的刺激。
本发明功能层所用壳聚糖与明胶、黄原胶是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用，壳聚糖通过烷基化改性止血功能及抗菌性得到提高，其在酸性水溶液中带正电荷，能够与明胶发生交联作用，从而与聚乙二醇一起对茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅进行初步交联固定，避免二者的聚集，当滴加入带负电荷的阴离子多糖黄原胶时，黄原胶通过与壳聚糖间发生聚电解质络合作用形成共凝胶，对茶多糖-纳米硒纳米球、多巴胺修饰纳米二氧化硅进行二次固定，避免了可能由于二者泄露造成血管栓塞的副作用，同时由于明胶的三维螺旋结构具有一定的刚性，其能够贯穿凝胶体系，既能保证复合凝胶的多孔结构又能提高水凝胶的机械性能。
明胶具有良好的吸水性、黄原胶具有良好的剪切性，本发明首先在明胶溶液中加入壳聚糖溶液，使得明胶三维结构和壳聚糖骨架间发生交联形成第一网络结构，使得水凝胶具有良好的韧性，在外力作用下第一网络结构交联骨架能够在水凝胶内部发生滑移而不会导致止血复合材料整体的移位，能够始终与伤口接触；油酸酰胺无毒，性质稳定，生物相容性良好，本发明首先将油酸酰胺在体系中分散均匀，然后加入茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅，超声处理过程中油酸酰胺能够促进矿物组分在体系中的分散，避免发生聚集，从而实现对矿物组分的分散固载；本发明所用聚乙二醇2000能够提高复合水凝胶的延展性、抗撕裂性，使得复合止血材料能够容纳较高含量的矿物成分，不会由于茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅的加入而变得发硬、易碎。黄原胶通过滴加的方式与明胶及改性壳聚糖复合形成第二网络结构，制得的复合止血材料一方面能够与伤口紧密贴合、持粘性高，可吸收渗液，促进伤口愈合，另一方面具有较小的剥离强度，能够轻松揭掉，从伤口剥离时不会对伤口造成二次伤害。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明提供的抗菌壳聚糖基止血贴，背衬层涂有生物相容性良好的粘合剂，背衬层基材既能够满足机械性能的要求，又具有柔软透气的性质，无纺布通过表面接枝透明质酸具有强大的吸水保水能力，能够将止血复合材料吸收的组织渗液吸收，使得复合止血材料保持适宜的湿度，促进伤口愈合；无纺布表面还具有通过自组装聚合及与透明质酸反应生成的聚多巴胺层，聚多巴胺具有粘附性，能够将无纺布与复合止血材料牢固结合在一起，也能进一步防止茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅的泄露，避免造成血管栓塞。
(2)本发明所用茶多糖-纳米硒复合物，将纳米硒原位负载在茶多糖上制备得到球型的复合物，该复合物具有良好的稳定性和较大的比表面积，与常规纳米硒粒子相比，活性和杀菌效率更高，赋予抗菌壳聚糖基止血贴优异的抗感染功能，还能促进伤口愈合；多巴胺修饰纳米二氧化硅能够促进复合止血材料粘附密封伤口，纳米二氧化硅具有激活凝血系统的特性，因而其能够快速激活凝血系统，与改性壳聚糖协同实现止血。
(3)本发明提供的抗菌壳聚糖基止血贴，方便储存、携带，使用方便，不会对伤口产生刺激，通过明胶与壳聚糖的交联形成第一网络结构，黄原胶与壳聚糖的胶凝作用形成第二网络结构，制备得到双网络结构复合水凝胶，加入适量的聚乙烯醇2000提高了复合水凝胶的延展性和抗撕裂性，同时能够有效固定颗粒组分，复合止血材料的多孔结构能够保证颗粒组分止血抗菌及促进伤口愈合功效的发挥，同时交联作用及聚乙烯醇2000的固定能够阻止颗粒组分的泄露，避免副作用的发生。
附图说明
图1为细胞毒性测试结果。
图2为体外全血凝固测试结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种抗菌壳聚糖基止血贴，包括从下到上依次设置的背衬层、止血层和保护层；所述背衬层为聚丙烯制备的基材，其上涂有氨基甲酸酯甲基丙烯酸乙酯葡聚糖粘合剂；所述止血层包括下侧的聚乳酸纤维无纺布和上侧的复合止血材料，所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖60份、聚乙二醇2000 2份、明胶16份、黄原胶8份、茶多糖-纳米硒复合物5份、多巴胺修饰纳米二氧化硅4份、油酸酰胺0.05份；所述保护层为PET薄膜。
进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入己醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
进一步地，所述茶多糖-纳米硒复合物的制备方法为：将茶叶多糖冻干粉加去离子水配制成溶液，加入Vc溶液混合均匀后滴加亚硒酸钠溶液，Vc与亚硒酸钠的摩尔比为8:1，振荡20s，40℃水浴条件下反应0.5h后，离心，沉淀加去离子水重悬浮，静置即得分散的球型茶多糖-纳米硒。
进一步地，所述多巴胺修饰纳米二氧化硅的制备方法为：将质量比为20:1的纳米二氧化硅和盐酸多巴胺超声分散在pH＝8.0的弱碱溶液中，搅拌反应12h，离心分离，弃去上清液，沉淀用去离子水洗涤5次以上，冻干即得。
一种所述抗菌壳聚糖基止血贴的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、无纺布表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，分别加入EDC和NHS，将无纺布浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的无纺布；
步骤二、复合止血材料的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅超声处理40s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应12h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合止血材料；
步骤三、无纺布与复合止血材料的结合：将无纺布与复合止血材料叠置冷压，即得止血层；其中，冷压采用的压力为2MPa，时间10min。
步骤四、抗菌壳聚糖基止血贴的制备：将表面涂有粘合剂的背衬层按照尺寸要求分切，并与分切好的止血层粘合，止血层位于背衬层的中间，然后将保护层附于粘性背衬层胶面上，单独密封，辐照灭菌，即得抗菌壳聚糖基止血贴。
实施例2
一种抗菌壳聚糖基止血贴，包括从下到上依次设置的背衬层、止血层和保护层；所述背衬层为聚对苯二甲酸乙二酯制备的基材，其上涂有氨基甲酸酯甲基丙烯酸乙酯葡聚糖粘合剂；所述止血层包括下侧的聚碳酸纤维无纺布和上侧的复合止血材料，所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖90份、聚乙二醇2000 3份、明胶24份、黄原胶12份、茶多糖-纳米硒复合物8份、多巴胺修饰纳米二氧化硅7份、油酸酰胺0.08份；所述保护层为PET薄膜。
进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入十二醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
进一步地，所述茶多糖-纳米硒复合物的制备方法为：将茶叶多糖冻干粉加去离子水配制成溶液，加入Vc溶液混合均匀后滴加亚硒酸钠溶液，Vc与亚硒酸钠的摩尔比为8:1，振荡25s，40℃水浴条件下反应0.8h后，离心，沉淀加去离子水重悬浮，静置即得分散的球型茶多糖-纳米硒。
进一步地，所述多巴胺修饰纳米二氧化硅的制备方法为：将质量比为20:1的纳米二氧化硅和盐酸多巴胺超声分散在pH＝8.0的弱碱溶液中，搅拌反应12～24h，离心分离，弃去上清液，沉淀用去离子水洗涤5次以上，冻干即得。
一种所述抗菌壳聚糖基止血贴的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、无纺布表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，分别加入EDC和NHS，将无纺布浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的无纺布；
步骤二、复合止血材料的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅超声处理40～60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应12～24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合止血材料；
步骤三、无纺布与复合止血材料的结合：将无纺布与复合止血材料叠置冷压，即得止血层；其中，冷压采用的压力为3MPa，时间15min；
步骤四、抗菌壳聚糖基止血贴的制备：将表面涂有粘合剂的背衬层按照尺寸要求分切，并与分切好的止血层粘合，止血层位于背衬层的中间，然后将保护层附于粘性背衬层胶面上，单独密封，辐照灭菌，即得抗菌壳聚糖基止血贴。
实施例3
一种抗菌壳聚糖基止血贴，包括从下到上依次设置的背衬层、止血层和保护层；所述背衬层为聚对苯二甲酸乙二酯制备的基材，其上涂有氨基甲酸酯甲基丙烯酸乙酯葡聚糖粘合剂；所述止血层包括下侧的聚羟基乙酸纤维无纺布和上侧的复合止血材料，所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖120份、聚乙二醇2000 4份、明胶32份、黄原胶16份、茶多糖-纳米硒复合物11份、多巴胺修饰纳米二氧化硅13份、油酸酰胺0.1份；所述保护层为PET薄膜。
进一步地，所述改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖粉末溶于1wt％醋酸配置成1wt％壳聚糖—醋酸溶液，加入十八醛，室温搅拌12h，用NaOH溶液调节pH至5，缓慢加入硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用乙醇反复洗涤，除去多余的醛，冷冻干燥研磨即得改性壳聚糖。
进一步地，所述茶多糖-纳米硒复合物的制备方法为：将茶叶多糖冻干粉加去离子水配制成溶液，加入Vc溶液混合均匀后滴加亚硒酸钠溶液，Vc与亚硒酸钠的摩尔比为8:1，振荡20～30s，40℃水浴条件下反应0.5～1h后，离心，沉淀加去离子水重悬浮，静置即得分散的球型茶多糖-纳米硒。
进一步地，所述多巴胺修饰纳米二氧化硅的制备方法为：将质量比为20:1的纳米二氧化硅和盐酸多巴胺超声分散在pH＝8.0的弱碱溶液中，搅拌反应24h，离心分离，弃去上清液，沉淀用去离子水洗涤5次以上，冻干即得。
一种所述抗菌壳聚糖基止血贴的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、无纺布表面改性：配制含透明质酸和多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液，分别加入EDC和NHS，将无纺布浸没其中，室温下反应2h，取出用去离子水多次冲洗后再浸没于去离子水中6h，真空冷冻干燥，得到表面改性的无纺布；
步骤二、复合止血材料的制备：将改性壳聚糖溶解于3wt％醋酸配成溶液；分别取明胶、黄原胶溶解于40℃的去离子水中配置成溶液，放置溶胀8h得明胶溶液和黄原胶溶液；在明胶溶液中加入改性壳聚糖溶液和油酸酰胺，快速搅拌30s，再加入聚乙二醇2000、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅超声处理60s，然后将黄原胶溶液逐滴加入，滴加完毕后置于室温下静置反应24h，用去离子水充分洗涤后冷冻干燥，得复合止血材料；
步骤三、无纺布与复合止血材料的结合：将无纺布与复合止血材料叠置冷压，即得止血层；其中，冷压采用的压力为4MPa，时间20min；
步骤四、抗菌壳聚糖基止血贴的制备：将表面涂有粘合剂的背衬层按照尺寸要求分切，并与分切好的止血层粘合，止血层位于背衬层的中间，然后将保护层附于粘性背衬层胶面上，单独密封，辐照灭菌，即得抗菌壳聚糖基止血贴。
对实施例1～3制得的复合止血材料样品及单独调整明胶与黄原胶的重量份数比为1:2、1:1、3:1、4:1，而其余操作均与实施例2相同条件下制得的样品A、B、C、D，进行剥离强度和持粘性测试，所得结果如下表1所示。
表1
从表1可以看到，明胶与黄原胶的配比对抗菌壳聚糖基止血贴的剥离强度及持粘性有较大影响，实施例1～3制得的抗菌壳聚糖基止血贴具有较小的剥离强度和较佳的持粘性，即当明胶与黄原胶的重量份数比为2:1时，抗菌壳聚糖基止血贴一方面能够与伤口紧密贴合、避免移位，另一方面能够轻松揭掉，剥离时不会对伤口造成二次伤害。
对比例1
除复合止血材料不含黄原胶外，其余同实施例2。
对比例2
除复合止血材料不含明胶外，其余同实施例2。
对比例3
除复合止血材料不含聚乙二醇2000外，其余同实施例2。
对比例4
除复合止血材料不含油酸酰胺外，其余同实施例2。
对比例5
除所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖130份、聚乙二醇2000 3份、明胶24份、黄原胶12份、茶多糖-纳米硒复合物8份、多巴胺修饰纳米二氧化硅7份、油酸酰胺0.08份外，其余同实施例2。
对比例6
除所述复合止血材料制备原料的重量份数配比为：改性壳聚糖90份、聚乙二醇2000 3份、明胶16份、黄原胶8份、茶多糖-纳米硒复合物8份、多巴胺修饰纳米二氧化硅7份、油酸酰胺0.08份外，其余同实施例2。
拉伸性能测试
按照GB/T 1040.3-2006的方法，采用万能材料试验机对样品进行拉伸性能测试。测试分为干燥样品和溶胀样品(在0.05M，pH7.4的PBS缓冲溶液中溶胀1h)，每种样品做3次平行试验，记录拉伸强度与断裂伸长率。实施例1～3及对比例1～6制得的抗菌壳聚糖基止血贴的力学性能测试结果如下表2所示：
表2
孔隙率测定
在量筒中加入一定体积的无水乙醇，体积记为V1，将样品投入其中，静置5min，使样品被无水乙醇完全浸透且表面无明显气泡，此时的总体积记为V2；取出样品，量筒中剩余的无水乙醇体积记为V3。样品的孔隙率P按下列公式计算：P＝(V1－V3)/(V2－V3)×100％，每种样品平行测试3次，取平均值。
吸水性测试
将样本裁剪成相同尺寸大小，充分干燥，用电子天平分别称取各样品的起始重量记为m0，然后分别将各样本放入培养皿中，向培养皿中加入重蒸水，在不同的时间用镊子夹出样品，用吸水纸擦去表面水分，电子天平称重，记录为mt。利用如下公式计算吸水率，吸水率
抑菌性测试
采用金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 25922)来测试样品的抑菌性能。两种菌株分别培养24h后，稀释至1×106CFU/mL。将同样重量的样品(试验组)及医用无菌纱布(对照组)各三份分别放置在48孔板中，然后每孔加入1mL菌液置于37℃下温育。用MTT细胞增殖检测试剂盒测定在6h，12h及24h的吸光值。以纱布对照组为参考基准，按照公式W抑菌率＝(A对照组－A试验组)/(A试验组－0.04)，其中0.04为无菌培养液在OD＝600的吸光值。
对实施例1～3及对比例1～6制备得到的抗菌壳聚糖基止血贴进行孔隙率、吸水率、抗菌性测试，结果如表3所示：
表3
从表3可以看出，本发明实施例1～3制得的抗菌壳聚糖基止血贴样品具有较高的孔隙率和吸水率，抑菌性很强。对比例1和对比例2的孔隙率低，吸水性较差，可能是由于不能形成双网络结构，所得到的复合止血材料孔数量少且孔直径较大导致的；对比例3不含聚乙二醇2000、对比例4不含油酸酰胺，二者的抑菌性均较差，这可能是由于颗粒组分在复合止血材料中分散不均匀，导致纳米粒子的抑菌功效不能充分发挥；对比例5改性壳聚糖的用量大于120份，其抑菌率反而不及实施例2，推断是由于改性壳聚糖的用量对止血复合材料的双网络结构有重要影响，而双网络结构能够影响茶多糖-纳米硒复合物及多巴胺修饰纳米二氧化硅的分散及固定，表明本申请抗菌壳聚糖基止血贴的杀菌性不仅与茶多糖-纳米硒复合物的用量有关，也与其在复合止血材料中的分布有关；对比例6改性壳聚糖、聚乙烯醇2000、明胶、黄原胶的重量份数比不满足30:1:8:4，抗菌壳聚糖基止血贴的孔隙率增大，吸水性却下降，抑菌性也有一定程度下降，表明复合止血材料的双网络结构具有特定的结构，各组分的用量对该结构的形成起到关键作用。
细胞毒性检测
用96孔板培养NIH3T3成纤维细胞，分为11组，每组5个复孔。实验组换液时用样品浸提液代替正常培养基，实施例1～3依次编号为T1、T2、T3，对比例1～6依次编号为D1、D2、D3、D4、D5、D6；阳性对照组用含0.64％苯酚的DMEM高糖完全培养基，记为PC；阴性对照为正常的DMEM高糖完全培养基，记为NC。在培养24h后分别检测3次，计算平均值。检测方法为：每孔加入5mg/mL的MTT溶液0.02mL，37℃培养4h，吸去液体，再在每孔中加入DMSO 0.1mL，混匀。测定吸光值(波长570nm)，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(A样品-A空白1)/(A阴性-A空白2)×100％
式中，A样品：加入样品浸提液的孔的吸光度数值；
A空白1：只加浸提液而未接种细胞的孔中溶液吸光度数值；
A阴性：加入DMEM完全培养基的孔中溶液吸光度数值；
A空白2：只加入DMEM完全培养基而未接种细胞的孔中溶液吸光度数值。
试验结果如图1所示，从图1可以看出，本发明实施例及对比例制得的抗菌壳聚糖基止血贴浸提液24h细胞存活率均在90％以上，均无细胞毒性。
体外全血凝固试验
取健康的新西兰大白耳兔，经心脏取血后，将血液和抗凝剂枸橼酸按9:1的比例均匀混合，制成抗凝全血。将实施例1～3及对比例1～6样品编号为A～I，对照组为空白(Blank)，将样品放入试管中，37℃预温5min，加入1mL抗凝兔血后37℃继续孵育3min，然后从加入500μL CaCl2溶液(浓度25mM)后开始计时，毎隔10s取出试管并倾斜，观察血液是否流动，直至血液完全凝固，倾斜90℃也无血流下时，记录血液凝固的时间，即为全血凝固时间BCT。
试验结果如图2所示。从图2可以看出，本发明实施例1～3制得的抗菌壳聚糖基止血贴样品组血液凝固时间均小于100s，远远低于空白组。对比例1～2样品组血液凝固时间明显大于实施例1～3样品组，这可能是由于这两组样品的单网络结构使得其亲水性较实施例2变差导致的；对比例3不含聚乙二醇2000，血液凝固时间超过130s，这可能是由于颗粒组分分布不均匀所致；对比例4不含油酸酰胺，血液凝固时间超过110s，这可能是由于多巴胺修饰纳米二氧化硅发生聚集，导致部分组分无法止血功效；对比例5改性壳聚糖的用量更多，血液凝固时间却显著大于实施例1～3，表明抗菌壳聚糖基止血贴对血液凝固的促进作用不仅与其所含的组分有关，还与复合止血材料特定的双网络结构有关；对比例6改性壳聚糖、聚乙烯醇2000、明胶、黄原胶的重量份数比不满足30:1:8:4，血液凝固时间长达160s，也表明复合止血材料特定的双网络结构能够与改性壳聚糖、茶多糖-纳米硒复合物、多巴胺修饰纳米二氧化硅协同促进血液凝固。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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