基于活性微生物菌株制备富含多肽螯合钙产品的方法
阅读说明：本技术 基于活性微生物菌株制备富含多肽螯合钙产品的方法 (Method for preparing polypeptide-enriched chelated calcium product based on active microbial strain ) 是由 董超 孙晓富 史延茂 赵洪妹 张丰文 余英敏 于 2021-02-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于活性微生物菌株制备富含多肽螯合钙产品的方法,利用活性微生物菌株对骨粉、大豆粉原料进行液体发酵,微生物菌株对大豆蛋白和胶原蛋白进行发酵分解,并与钙螯合形成多肽螯合钙成分,经过特定的后处理工艺制备得到富含多肽螯合钙的产品,所得产品同时具有溶栓酶活性。依据本发明的生产工艺制备的多肽螯合钙粉具有十分优秀的生物活性指标。(The invention discloses a method for preparing a product rich in polypeptide chelated calcium based on an active microbial strain. The polypeptide chelated calcium powder prepared by the production process has very excellent biological activity indexes.)
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是一种适用于发酵生产多肽螯合钙的工艺及其应用。
背景技术
钙是人体含量最高的无机元素，占人体总质量的1.5—2.2％，在人体的细胞代谢、血液凝结、骨骼结构、神经传导和体液平衡中起着重要作用。全国的最近三次营养调查结果显示：我国的城乡居民钙的摄入量为0.413g，只有健康组织推荐量的52％，钙缺乏人群比例高达90％以上。国民的饮食结构含钙低是原因之一，例如含钙较高的牛奶等还不是主要餐品；另一个原因是补钙的产品吸收效果较差，很多年龄较大的缺钙人群，虽然主动添加补钙产品，但是缺钙的比例一直居高不下。
市场上的补钙产品主要分为两大类，第一类是无机酸和有机酸钙盐类，比如：碳酸钙、贝壳珍珠粉和；乳酸钙、葡萄糖酸钙等；第二类是氨基酸螯合钙类，比如苏糖酸钙和天门冬氨酸钙等。其中无机酸和有机酸钙适口性差、吸收率低，并且必须有维生素D参与；氨基酸螯合钙可以提高吸收率，但是需要人体必须的氨基酸，两者都易在消化道环境中产生沉淀。近些年发展较快的多肽螯合钙可以采用多种剂型，在消化道内不易形成沉淀，肠粘膜主动运输，可以直接吸收，目前是开发前景最好的一款补钙产品。
多肽螯合钙的生产工艺一般包括：酶解蛋白和螯合，提取纯化和无菌处理。具有工艺步骤复杂、生产成本高的缺点。本发明采用纳豆芽孢杆菌SWS-001菌株(枯草芽孢杆菌的亚属)直接发酵牛骨粉，然后喷雾干燥，得到多肽螯合钙与其他发酵产物的复合干粉，开发一种新型的多肽螯合钙的生产工艺。该技术的菌株安全可靠，具有传统的开发应用历史。通过代谢生成的蛋白酶降解牛骨中的胶原蛋白，打破胶原蛋白和羟基磷灰石钙的紧密结构，分泌的有机酸促进析出钙，与大豆蛋白多肽和胶原多肽形成螯合钙，一步法发酵生成钙肽产物，产物中不但具有多肽螯合钙，还有高活性溶栓酶以及益生活性菌株，大大减少了无菌后处理工艺的步骤，降低了多肽螯合钙生产成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于活性微生物菌株制备富含多肽螯合钙产品的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
基于活性微生物菌株制备富含多肽螯合钙产品的方法，其特征在于：利用微生物菌株对骨粉、大豆粉原料进行液体发酵，所述微生物菌株对大豆蛋白和胶原蛋白进行发酵分解，并与钙螯合形成多肽螯合钙成分，经过特定的后处理工艺制备得到富含多肽螯合钙的产品，所得产品同时具有溶栓酶活性；所述微生物菌株属于纳豆芽孢杆菌，保藏日期2019年1月23日，保藏号CGMCC NO：17226；其主要生物学特征包括：革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，芽孢椭圆形或柱状，革兰氏染色阳性，接触酶阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，D-木糖发酵阳性，D-葡萄糖发酵阳性，明胶液化阳性，淀粉水解阳性，菌落形态乳白不透明圆形。
作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：
C、多肽螯合钙的液体深层发酵：
C-1、培养基配方，以重量份数比计：牛骨粉3-5，豆粉4-6，葡萄糖0.1-0.3，KH2PO40.1-0.3，K2HPO4·3H2O 0.4-0.6，MgSO4·7H2O 0.05-0.2，灭菌前pH＝7.5；
C-2、培养基灭菌及发酵：将培养基配好后装入三角瓶，装量500ml/3000ml,120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入所述微生物菌株种子液,发酵条件为33℃，摇床转速200r/min，发酵时间60h。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C-1中培养基的具体化配方为，以重量份数比计，牛骨粉4，豆粉5，葡萄糖0.2，KH2PO4 0.2，K2HPO4·3H2O 0.52，MgSO4·7H2O 0.1，灭菌前pH7.5。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤C之前还包括如下步骤：
A、菌种斜面制备及菌种活化：
A-1、培养基制备：按如下配方制备PB培养基，以重量份数比计：牛肉膏0.3-0.7，酵母粉0.5-2.0，磷酸氢二钠0.3-0.7，磷酸二氢钠0.3-0.7，琼脂1-3；将斜面培养基加热溶化后调pH到6.0-6.2，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
A-2、菌种活化与扩大培养：用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A-1中培养基的具体化配方为：以重量份数比计，牛肉膏0.5，酵母粉1.0，磷酸氢二钠0.5，磷酸二氢钠0.5，琼脂2。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤A之后还包括如下步骤：
B、种子液培养：
B-1、种液培养基的配制，以重量份数比计包括：牛肉膏0.3-0.7，酵母粉0.5-2.0，磷酸氢二钠0.3-0.7，磷酸二氢钠0.3-0.7，调pH到7.0-7.8，灭菌备用；
B-2、接种及培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-1中种液培养基的具体化配制方法为，以重量份数比计，牛肉膏0.5，酵母粉1.0，磷酸氢二钠0.5，磷酸二氢钠0.5，调pH到7.0-7.8，灭菌备用。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤C之后还包括如下步骤：
D、多肽螯合钙粉的喷雾干燥：
液体深层发酵后，取麦芽糊精加入发酵液中，添加比例：固体/液体＝1：3w/v,混合均匀，喷雾干燥；进口温度120℃，出口温度60℃，喷雾后得到呈发酵味道的淡黄色粉末，即为多肽螯合钙粉产品。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤D之后对所得多肽螯合钙粉产品进行质量检测，检测指标至少包含多肽螯合钙含量、溶栓酶活性、纳豆芽孢杆菌活菌数含量。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明利用纳豆芽孢杆菌菌株SWS-001(保藏号CGMCC NO：17226)开发了一步法发酵生产多肽螯合钙的生产工艺，试验生产工艺流程包括：原菌种活化、种液培养、液体深层发酵、喷雾干燥、质量检测。
依据本发明的生产工艺制备的多肽螯合钙粉具有十分优秀的生物活性指标：①多肽螯合钙含量≥1.5mg/g，总钙含量≥20mg/g；②溶栓酶酶活≥3000U/g；纳豆芽孢杆菌数≥5×106cfu/g；④水分≤9.0％；⑤多肽螯合钙发酵粉卫生标准符合《发酵豆制品卫生标准GB2712-2003》。
详细试验研究数据及生产数据参见下文的实施例。
附图说明
图1是实施例1步骤C中合格斜面菌种镜检图。
图2是实施例2步骤C中三角瓶种液6小时图。
图3是实施例2步骤C中三角瓶种液16小时图。
图4是实施例3中用于计算钙离子浓度所绘制的标准曲线。
保藏说明
保藏菌种归类于枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，拉丁名为Bacillus natto，命名为Bacillus natto.SWS-001，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期2019年1月23日，保藏号CGMCC NO：17226。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本申请的描述。
应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
本发明的菌株Bacillus natto.SWS-001从纳豆中采集并经筛选获取，筛选方法为单菌株蛋白纤维平板透明圈法。
实施例1、菌种斜面生产操作
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、试管、茄子瓶、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨及琼脂等。
b、培养基制备
按如下配方制备培养基(PB培养基)：按如下配方制备PB培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，琼脂2％；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
c、菌种活化与扩大培养
用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
实施例2、种子液培养方法
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸等。
b、种子液培养基的配制
按如下方法配制种液培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，调pH到7.0－7.8，灭菌备用；
c、接种及培养
取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
所有种子液合并，装入无菌不锈钢接种壶内冰箱保存备用，同时用划线法作无菌检查，种子液保存不得多于三天。
实施例3、多肽螯合钙的液体深层发酵
培养基灭菌及发酵：将培养基配好后装入三角瓶，装量500ml/3000ml,培养基配方：牛骨粉4％，豆粉5％，葡萄糖0.2％，KH2PO40.2％，K2HPO4·3H2O 0.52％，MgSO4·7H2O0.1％，灭菌前pH7.5。120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入实施例2的种子液,发酵条件为33℃，摇床转速200r/min，发酵时间60h。
测定液体中的总钙和多肽螯合钙。发酵液中总钙和多肽螯合钙的测定方法为：发酵液5ml加入10mL 2mol·L-1盐酸水解，采用EDTA络合滴定法测定钙的含量：在4℃，4000rpm离心10min，取上清液5mL逐滴加入45mL无水乙醇中充分混匀震荡，静置30min后于4℃，8000r/min离心20min。沉淀加入10mL 2mol·L-1盐酸水解，然后EDTA滴定测定钙含量。通过绘制标准曲线计算钙离子浓度，如图4所示。
实施例4、多肽螯合钙的喷雾干燥
液体深层发酵后，发酵液中加入麦芽糊精做辅料，添加比例：固体/液体＝1：3(m/V),继续振荡30min，混合均匀后喷雾干燥。进口温度120℃，出口温度60℃，喷雾后呈特殊发酵味道的淡黄色粉末，即为多肽螯合钙粉产品。实施例5、多肽螯合钙的发酵试验结果
如下为实施例3个批次发酵试验的结果数据。多肽螯合钙粉各主要指标
可见，经过3批次多肽螯合钙发酵后喷雾干燥实验可知，菌株SWS-001的液体深层发酵及喷雾干燥工艺满足多肽螯合钙的一步法生产要求，设备常规化，工艺设计合适；批次之间指标差异较小，多肽螯合钙的含量在1.58mg/g左右，活菌数在6.16×106左右，溶栓酶活性在3500(U/g)以上。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。
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