一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法
阅读说明：本技术 一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法 (Method for breeding lotus triploid by 2n pollen hybridization ) 是由 刘凤栾 田代科 秦密 张大生 刘青青 付乃峰 于 2021-01-06 设计创作，主要内容包括：一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法,诱导荷花雄蕊稳定高效地产生2n花粉,再与二倍体植株有性杂交得到三倍体莲子,萌发和栽培后获得三倍体植株；诱导时,选择生长健壮、长度为3～3.5cm的荷花花蕾,拨开花蕾外层花瓣,内侧留一层花瓣包裹雄蕊群,在拨开的外层花瓣与保留的内层花瓣之间填充棉质物,两次滴加浓度为0.02～0.03wt.％的秋水仙素溶液,雄蕊成熟散粉后进行人工授粉,获得成熟三倍体莲子。处理方式稳定,诱导产生2n花粉的成功率高,可大批量地处理花蕾,展开定向杂交与自交,选育过程简便,育种周期短,获得的三倍体株型大,花量增加,显花度高,花朵颜色鲜艳,增加了荷花三倍体的多样性。(A method for breeding lotus triploid by 2n pollen hybridization comprises inducing lotus stamen to stably and efficiently generate 2n pollen, sexual hybridizing with diploid plant to obtain triploid lotus seed, germinating and cultivating to obtain triploid plant; during induction, a lotus bud which is robust in growth and 3-3.5 cm long is selected, the outer petals of the bud are poked, a layer of petals is left on the inner side of the bud to wrap a stamen group, cotton is filled between the poked outer petals and the reserved inner petals, colchicine solution with the concentration of 0.02-0.03 wt.% is dripped twice, and artificial pollination is carried out after the stamens are mature and loose powder, so that the mature triploid lotus seed is obtained. The treatment mode is stable, the success rate of inducing to generate 2n pollen is high, the flower buds can be treated in large batch, directional hybridization and selfing can be developed, the breeding process is simple and convenient, the breeding period is short, the obtained triploid plants are large in size, the flower quantity is increased, the flower development degree is high, the flower color is bright, and the variety of the lotus triploid is increased.)
技术领域
本发明属于荷花育种领域，具体涉及一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法。
背景技术
荷花为莲属植物(Nelumbo Adans.)，是中国的十大传统名花之一，也是印度、越南的国花和世界著名宗教圣花，具有极高的文化内涵及观赏价值。同时，莲藕是中国重要的蔬菜之一；莲子、花朵及叶片等皆可入药；还可用于生态环境净化与修复；因此，荷花亦具有十分重要的经济价值。
迄今，莲属植物仅两种，为分布于亚洲和澳洲北部的亚洲莲以及位于北美、中美洲的美洲莲。亚洲莲栽培品种繁多，包括单瓣、重瓣以及千瓣等花型，花色由红到粉红及白色；而美洲莲多数仍处于半野生或自然化状态，仅有淡黄色，品种较少。两者虽然在地理上存在隔离，但相互杂交可育。
目前，全球正式文献记载的荷花品种的名称已达2080个，中国是品种记载数量最多的国家，其次为日本、美国，而欧洲和非洲偏少。进入21世纪，人工物理射线辐射育种、化学诱变育种等技术被引入荷花良种选育，但传统有性杂交育种仍是主要方法。
尽管荷花育种工作受到越来越多的国家和育种者重视，并且已有很多优良品种，但与月季、菊花甚至水生植物睡莲相比，现在荷花在花型、花色以及抗性等诸多方面的丰富性偏低，很难提升市场竞争力。
并且，无论作为景观和庭院的栽培观赏、抑或莲藕和莲子的食用用途，荷花良种的市场需求量极大，而实践栽培仅局限在少数传统品种上，观赏性高同时抗逆性强的品种较少。因此，开展多层次、多途径、多方向的良种选育工作，是提升荷花产业发展的重要手段之一。
现有技术中，对荷花多倍体的选育研究较少，常规加倍方法中多使用秋水仙素处理莲子或者莲藕茎尖；或由脱脂棉直接包裹整个花蕾进行诱导处理或直接将液体注射进入花蕾，前者对极度重瓣或者花瓣厚实的荷花品种诱导效果差，后者液体直接浸泡雌蕊和雄蕊群，往往导致雌雄蕊发育不良，无法获得大量的、有活力的2n花粉。
黄国振等(荷花人工诱导多倍体的方法.园艺学报，2(10):143-144，1983年)对莲子萌发幼芽进行秋水仙素溶液的浸泡和滴芽处理，通过浸泡处理方法获得了加倍植株，而滴芽处理未获得加倍植株。
杜冰羣(莲三倍体的生长特性和某些经济性状表现的初步研究.植物科学学报，3(002)：119-125，1985年)利用多个四倍体与多个二倍体分别做父本和母本进行组合杂交，获得三倍体植株。该方法中培养三倍体的前提是需要四倍体亲本，其并未提及如何获得四倍体亲本。
四倍体亲本的选育一般需要诱导种子或者芽点来筛选，至成苗、鉴定、稳定性检测，至少需要2～3次或年，所得植株多为不同倍性的嵌合体，故而其周期较长，工作量大，成本较高。
此外，黄国振等(荷花新品种.中国花卉园艺，18：46-49，2007年)通过诱导莲子加倍，获得部分三倍体植株，但并未公开具体的处理流程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法，通过诱导荷花雄蕊高效产生2n花粉，再与二倍体花粉进行有性杂交得到后代，获得的三倍体株型大，花量提高，花朵高度增加，花朵颜色鲜艳，选育过程操作简便，育种时间短，可同时大规模地处理花蕾，以高效地诱导大批量的2n花粉，同时，对自身雌蕊群影响极低，花开后可展开自花授粉进行特定需求的三倍体自交系选育。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用2n花粉杂交选育荷花三倍体的方法，包括以下步骤：
1)诱导2n花粉
选择生长健壮、长度为3～3.5cm、雄蕊群为乳白色的荷花花蕾，于上午时间，拨开花蕾外层花瓣，仅留最内侧一层的4～6片花瓣包裹雄蕊群，在拨开的外层花瓣与保留的内层花瓣之间，填充棉质物，填充厚度为3～4mm，向棉质物中滴加浓度为0.02～0.03wt.％的秋水仙素溶液2～3ml，使棉质物达到水饱和，复位拨开的外侧花瓣，进行诱导；
诱导20～30小时后，再次滴加浓度为0.02～0.03wt.％秋水仙素溶液至棉质物水饱和，再诱导20～30小时，去除棉质物，待花开散粉后取其花粉；
2)人工授粉杂交
采集步骤1)中散粉的雄蕊群作为父本，选择花开第2天的荷花花朵作为母本，所述母本在花开前已套网兜并去雄，夹取散粉雄蕊，于上午10点前涂抹母本雌蕊柱头，完成后套回网兜；
授粉后25～30天，莲蓬发育成熟，莲子呈现棕褐色或黑褐色，剥取莲子。
进一步，步骤1)中，去除棉质物后8～10天，被处理花蕾发育成熟即将开花，套上网兜，2～3天后，成熟花蕾的花瓣逐渐打开，花开第2天的早上4～7点，雌蕊群花药裂开、大量花粉散出。
优选地，所述棉质物为脱脂棉、棉花或棉纱。
又，步骤1)中，每次诱导时间为20～25小时。
进一步，步骤1)中，复位拨开的外侧花瓣后，在花蕾上套纸袋。
又，步骤2)中，采集父本时，在被处理花蕾的花开第2天时，早上7～8点之间，采集已散粉雄蕊，放入硫酸纸。
优选地，所述花蕾为美洲莲花蕾。
本发明中，通过诱导荷花雄蕊高效产生2n花粉，再与二倍体花粉进行有性杂交得到三倍体莲子。在选择外植体时，选择长度为3～3.5cm的花蕾，处于花药呈白色为主、略微浅黄色的时期，此时期大致为初级精母细胞时期，精原细胞第一次减数分裂，最内层花瓣外包裹棉质物后再浸入秋水仙素处理，10～15小时后液体渗透穿过最内层花瓣和花药的表皮和内皮，最终达到花粉囊，而此时花粉囊内已发育至次级精母细胞时期，进行第二次减数分裂，秋水仙素具有抑制或破坏纺锤体微管形成的作用，导致含有两条染色单体的次级精母细胞无法正常完成第二次减数分裂，从而诱导2n花粉的形成。通过荷花花蕾长度及花药颜色结合判断，选出处于诱导产生2n花粉最佳时期的荷花花蕾进行诱导处理，以提高2n花粉的诱导成功率。
本发明在诱导2n花粉前，围绕最内侧一层花瓣裹夹一层棉质物，类似增加一层花瓣，既不直接接触雌蕊群也不直接暴露在花蕾外侧，这样棉质物上浸入的秋水仙素，可以通过内层保留花瓣慢慢渗透进入雌蕊群，不会对其发育造成很大影响，以保证花粉良好发育，并提高2n花粉的诱导率；外层也有花瓣保护，棉质物吸收的秋水仙素液体中的水分蒸发量小，不会导致其浓度因蒸发而逐渐变大，或因蒸发导致液体总量变少，影响向内层雌蕊群的渗透效果。
植物2n花粉加倍处理只能在其次级精母细胞时期展开，此窗口对荷花整个雄蕊群而言，仅约2天，因此，筛选合适的秋水仙素浓度在此时期达到最好的2n花粉诱导效果十分必要。本发明结合棉质物的填塞方式，对长度为3～3.5cm、处于次级精母细胞时期的荷花花蕾，在脱脂棉上滴加0.02～0.03wt.％的秋水仙素溶液，棉质物上浸入的秋水仙素液体通过内层保留花瓣慢慢渗透进入雌蕊群，浓度合适而稳定，不会对其发育造成很大影响，保证花粉良好发育并提高2n花粉的诱导率。
进一步，对荷花进行秋水仙素处理，需要结合浓度控制合适的处理时间，若处理时间过长，则会造成雌蕊发育不良，经过试验，在本发明的处理浓度下，若处理时间超过3天，则大部分雌蕊腐败死亡。
本发明在花蕾成熟而未打开时，套上尼龙网兜，防止花开时蜜蜂访花而发生其它花朵的花粉污染，在授粉后第2天即花开第3天进行摘除，这时花粉已进入胚珠并且柱头的可授性已极低。
本发明的棉质物优选脱脂棉，脱脂棉易吸水，且吸水后能保持一定形态，保水性也更好，脱脂棉作为工业产品，容易获得。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
利用本发明，父本花粉来源广泛，可以为任何目标荷花品种，无论是花瓣很多的品种，还是花瓣厚实的品种，都很容易被这种方式处理和诱导，获得加倍的2n花粉，再和二倍体植株有性杂交；以0.02wt.％的秋水仙素溶液处理时，2n花粉的诱导率在30％以上，以0.03wt.％的秋水仙素溶液处理时，2n花粉的诱导率在25％以上；重复性好，稳定性高，与母本相比，获得的三倍体植株株型变大，花量明显增加，花朵高度增加，花朵颜色鲜艳。
本发明在花季可大规模处理花蕾，获得大量2n花粉，花开后取粉、授粉进行杂交或者自交即可，当年秋季所采收种子中就包含三倍体种子，大大缩短了现有技术中的育种时间。就荷花而言，秋水仙素处理花蕾—花开—授粉—收种这个过程最快只需35天，大大缩短了育种周期，增加了荷花三倍体种质资源的多样性，为选育新优荷花品种储备了良好的种质资源。
附图说明
图1为本发明实施例及对比例的美洲莲花蕾长度对比图。
图2为本发明实施例中的秋水仙素溶液处理花蕾过程图，其中A、B、C、D分别代表不同处理环节。
图3为对比例中秋水仙素溶液处理花蕾的过程图，其中A、B、C、D分别代表不同处理环节。
图4为本发明实施例中的花粉散粉图。
图5为本发明实施例中的人工授粉图。
图6为本发明实施例中对成活植株幼叶进行流式细胞仪检测结果图，其中，A为‘微山红’莲二倍体，B为实施例杂交后代三倍体，C为自然三倍体。
图7为本发明实施例中对加倍植株的根尖进行染色体计数观察结果图，其中，a为‘微山红’莲二倍体，b为实施例杂交后代三倍体，c为自然三倍体。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例及对比例利用2n花粉杂交选育荷花三倍体
1.诱导2n花粉
分别以长度为3～3.5cm美洲莲花蕾为本发明实施例组处理对象，以长度为2.0cm的美洲莲花蕾为对比例组处理对象，参见图1。
两者除包裹脱脂棉方式和滴加液体量不同外，如无特殊说明，其它操作一致：
选取长度3～3.5cm花蕾，花药呈乳白色为主、略微浅黄色，此时期大致为初级精母细胞时期，轻轻拨开花蕾外层花瓣(图2A)，使得内侧只剩1层4～6片花瓣包裹雄蕊群(图2B)，使用钝头镊子在两者之间塞入1层3～4mm厚度的脱脂棉(图2C)，再利用移液枪滴加相应浓度的秋水仙素液体2ml(表1)，然后将拨开的外侧花瓣复位原态(图2D)，最后套上纸袋，以防止秋水仙素液体蒸发太快；次日早晨7～10点，再次滴加2ml秋水仙素液体，第3日早晨7～10点，去除纸袋和脱脂棉，每个浓度重复处理3个花蕾。
选择健壮发育的～2.0cm花蕾，于早晨7-10点，使用脱脂棉包裹花蕾3层，外缠棉线固定(图3A)，然后使用移液枪滴加(图3B)相应浓度的秋水仙素液体1ml(表1)，最后依次套上剪口塑料袋和纸袋(图3C、图3D)，只套一层塑料袋容易造成花蕾高温，只套纸袋会直接接触脱脂棉而吸走水分；次日早晨7-10点，再次滴加1ml秋水仙素液体，第3日早晨7-10点，去除罩袋和脱脂棉，每个浓度重复处理3个花蕾。
去除脱脂棉后8～10天时，即花蕾成熟而未打开时，套上尼龙网兜，防止花开时蜜蜂访花而发生其它花朵的花粉污染。2～3天后，成熟花蕾的花瓣逐渐打开，花粉大量散粉，参见图4，花开第2天，雄蕊群花药大量散粉，每个花药可散成千花粉粒。
表1诱导美洲莲2n花粉的秋水仙素梯度及镜检结果
2.人工授粉杂交
因为2cm长度花蕾被秋水仙素处理后，雄蕊多数发育畸形，部分花朵甚至直接死亡而未展开，后期无法获得足量花粉，故后续试验中仅选择3～3.5cm花蕾发育而成的花朵采集花粉进行人工授粉。
在花开第2天时，早上7～8点之间，采集已散粉雄蕊，选择花开第2天的母本，母本在花开前1～2天已套尼龙网兜并去雄，摘取网兜，使用镊子夹取10～15枚美洲莲散粉雄蕊，涂抹母本花托柱头5～6次(图5)，最后套回网兜。
授粉后第2天去除网兜，授粉后25～30天，花托(即莲蓬)发育成熟，莲子呈现棕褐色或黑褐色，剥取莲子，4度保存。
3.催芽、栽培
对收获的莲子进行常规催芽与栽培管理。
结果发现：在0.01wt.％浓度处理所得花粉的杂交莲子中未能检测到三倍体幼苗，而0.05wt.％浓度下被处理花蕾雄蕊常现黑死败育且授粉结实率较低。
以0.02wt.％浓度处理的花蕾所得花粉，完成人工授粉6个杂交组合共50朵，共收集成熟种子108粒。次年在6个组合中随机选择50粒催芽、栽培，常规养护管理，共成活28个植株(表2)。
表2秋水仙素0.02wt.％浓度诱导2n花粉的杂交效果
3.倍性鉴定
采摘28株成活植株的幼叶，进行流式细胞仪检测(结果参见图6A、6B、6C)，获得3株三倍体植株(表2)，占比11％，材料编号分别为G178、B3和B4，分别属于M360×M516(G178)、M305×M423(B3和B4)组合。对加倍植株的根尖进行染色体计数观察(图7a、7b、7c)，确定三者均为三倍体植株。因随机催芽，播种数较少，其余4个组合在此次催芽中未获得三倍体植株，但不排除其在剩余的58粒杂交莲子中含有三倍体莲子的可能性。
上述获得的3个三倍体植株的染色体数与自然三倍体荷花‘艳阳天’植株相同，在外形上无较大差异，都有3条较长的染色体，而二倍体中有2条染色体最长。
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