区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用 (Staining reagent for distinguishing normal cells from cancer cells and preparation method and application thereof ) 是由 许东 李乐 邓圣旺 陈轶 龙甜甜 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学检测技术领域,具体涉及一种区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用。本发明以橘红G溶液为碳源,采用电解法制备得到橘红G碳点溶液,所述橘红G碳点溶液即为区别正常细胞和癌细胞的染色试剂。将染色试剂处理过的受检细胞液和正常细胞液置于荧光微分干涉显微镜下,将细胞形态进行对比,即可判断出受检细胞是否发生癌变。本发明方法具有简单快捷的优势。(The invention belongs to the technical field of biomedical detection, and particularly relates to a staining reagent for distinguishing normal cells from cancer cells, and a preparation method and application thereof. The invention takes an orange G solution as a carbon source, and prepares the orange G carbon dot solution by an electrolytic method, wherein the orange G carbon dot solution is a staining reagent for distinguishing normal cells from cancer cells. The detected cell sap treated by the staining reagent and the normal cell sap are placed under a fluorescence differential interference microscope, and the cell morphology is compared, so that whether the detected cell is cancerated or not can be judged. The method has the advantages of simplicity and quickness.)
技术领域
本发明属于生物医学检测
技术领域
，具体涉及一种区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用。背景技术
在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。相对应的，起源于间叶组织的恶性肿瘤统称为肉瘤。有少数恶性肿瘤不按上述原则命名，如肾母细胞瘤、恶性畸胎瘤等。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。
正常情况下，来自同一组织的细胞大小、形态基本一致，癌细胞一般比相应的正常细胞大，而且癌细胞相互之间的大小形态也很不一致，有时出现体积很大的“瘤巨细胞”。细胞都含有细胞核和细胞浆，正常情况下，大多数细胞只有一个细胞核，细胞核与细胞浆也有一定比例；癌细胞的细胞核体积增大，形态也不一致，并可出现巨核、双核、多核或异形核；癌细胞长的很快，细胞核仁明显，而正常细胞的细胞核仁不明显。
癌细胞的检测方法有很多，如B超、CT、核磁共振检查，又如抽血查肿瘤标志物、穿刺活检、内镜检查等。而采用染色剂用于区分同一组织的正常细胞和受检细胞，根据受检细胞的形态判断是否有癌变现象的方法现有技术中鲜有报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用，目的是通过将染色试剂处理过的受检细胞液和正常细胞液置于荧光微分干涉显微镜下，将细胞形态进行对比，判断出受检细胞是否发生癌变，具有简单快捷的优势。
一种区别正常细胞和癌细胞的染色试剂，是橘红G碳点溶液，橘红G的质量浓度为0.125％，荧光激发波长为517nm，发射波长为304nm。
本发明的区别正常细胞和癌细胞的染色试剂得制备方法，按照以下步骤进行：
(1)采用PBS缓冲液作电解液，配制浓度为0.002mol/L的橘红G溶液；
(2)以橘红G溶液为碳源进行电解，当溶液由无荧光逐渐变为黄绿色荧光溶液，即制备得到橘红G碳点溶液。
其中，所述的PBS缓冲液pH＝7。
所述的电解工艺的电压为10V，电解时间为8min。
本发明还提供一种区别正常细胞和癌细胞的染色试剂在癌细胞检测中的应用。
一种癌细胞检测方法，包括如下步骤：
(1)受检细胞染色：取受检细胞100μL，加入1mL PBS溶液润洗，3000rpm离心5min，弃去上清液，更换新PBS溶液定容至1mL体积，吸取20-50μL质量浓度为0.125％的橘红G碳点加入该PBS溶液，孵育10min后吸净，再采用PBS溶液润洗后吸净，得到受检细胞液；
(2)正常细胞染色：将同一组织的正常细胞加入到装有PBS缓冲液的离心管中，离心后弃上清液，吸取20-50μL上述橘红G碳点溶液置于离心后的细胞试管中，孵育10min后吸净，再采用PBS溶液润洗后弃去上层液体，留底部悬浊的正常细胞溶液备用；
(3)将载玻片上滴入100μL受检细胞液，然后将染色处理的受检细胞玻片倒扣在载玻片上，置于荧光显微镜下观察细胞成像；同时吸取100μL染色处理后的正常细胞溶液滴在载玻片上，置于荧光显微镜下观察细胞成像；通过两组细胞成像对比，判断受检细胞是否发生癌变。
其中，所述的PBS溶液pH＝7.2-7.4。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明的提供的区别正常细胞和癌细胞的染色试剂，将染色处理的受检细胞液和正常细胞液置于荧光微分干涉显微镜下，对显现荧光的细胞形态进行对比，即可判断受检细胞是否发生癌变。
本发明的癌细胞检测方法简单，且在普通光学显微镜下即可检测。
附图说明
图1是本发明橘红G碳点溶液的紫外和荧光光谱图；
(a)紫外-可见光光谱图；(b)是荧光光谱图；
Wavelength：波长；Absorbance：吸收率；PL intensity：荧光强度；EX：荧光发射波长；EM：荧光激发波长；Chrysoidine G CDs：橘红G碳点；
图2是本发明橘红G碳点溶液的TEM电镜图；
图3是受检细胞和正常细胞经染色处理后的细胞成像对比图；
(a1)表示受检细胞在明场下的细胞形态图；(a2)表示受检细胞在荧光条件下的细胞形态图；(b1)表示正常细胞在明场下的细胞形态图；(b2)表示正常细胞在荧光条件下的细胞形态图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应该被视为在本文中具体公开。
实施例1
橘红G碳点的制备：
本实施例中，以橘红G(C12H12N4·HCl)为碳源采用电解法制备橘红G碳点溶液，所用电解装置为一个25mL的玻璃瓶容器和两个固定在瓶盖且4cm长的铂电极组成，电压为(220V/10V)。
用PBS缓冲液(pH＝7)作电解液配制好浓度为0.002mol/L的橘红G溶液，随后加16ml橘红G溶液到电解玻璃瓶中，插入电极并通电8min，溶液由最开始的无荧光逐渐变为黄绿色荧光溶液，这表明碳点形成，即制备得到橘红G碳点溶液。
如图1和图2所示，其中图1是本发明的橘红G碳点溶液的紫外和荧光光谱图，图2是本发明橘红G碳点溶液的TEM电镜图。其中图1a表示紫外-可见光光谱图；图1b表示荧光光谱图，由图1b可以看出，橘红G碳点溶液的荧光激发波长为517nm，发射波长为304nm。
实施例2
细胞染色：
癌细胞染色：将培养好的肝癌细胞HepG2爬片用PBS溶液(pH＝7.2-7.4)润洗2次后，吸取1.5ml制备好的橘红G碳点溶液于细胞中，孵育10min后吸净，再采用PBS溶液润洗两次后吸净。将载玻片上滴入10μL细胞培养液，然后将处理好的细胞玻片倒扣在载玻片上，置于荧光显微镜下观察细胞成像。
口腔上皮细胞染色：用干净棉签取口腔颊部黏膜细胞两次后浸于装有1.5ml PBS缓冲液(pH＝7.2-7.4)的离心管中，500rpm离心6min，后弃上清液，将制备好的橘红G碳点溶液吸取1.5ml置于离心过后的细胞试管中，孵育10min后吸净，再采用PBS溶液润洗两次后弃去上层液体，留下底部悬浊部分的细胞溶液。然后吸取30μL处理好的细胞溶液滴在载玻片上置于荧光微镜下观察细胞成像。
实施例3
显微镜观察试验：
将采取橘红G碳点溶液处理过的癌细胞和口腔上皮细胞玻片置于荧光显微镜下，采取40X的物镜先在明场下找到清晰的细胞形态并拍照，然后打开汞灯切换到与橘红G碳点材料的激发波长和发射波长相对应的滤光片，关掉外部光源在黑暗环境中对橘红G碳点溶液染色过后显现荧光的细胞进行观察，拍照后进行对比。
如图3所示，是受检细胞和正常细胞经染色处理后的细胞成像对比图。其中图3a1表示受检细胞在明场下的细胞形态图，图3a2表示受检细胞在荧光条件下的细胞形态图；图3b1表示正常细胞在明场下的细胞形态图，图3b2表示正常细胞在荧光条件下的细胞形态图。
由图3可以看出，采用本发明的橘红G碳点溶液对癌细胞和正常细胞进行染色处理后，通过显微镜观察，可以看到癌细胞的细胞核体积增大，细胞核仁呈现2-4个，细胞形态不一致，而正常细胞的细胞核不明显，大小形态一致；且癌细胞繁殖的很快，细胞核仁明显，而正常细胞的细胞核仁，不明显。
因此，通过橘红G碳点溶液对受检细胞和正常细胞进行染色处理后，通过荧光显微镜对细胞形态进行观察对比，即可判断受检细胞是否发生癌变，该检测方法操作简单。
本发明提供的区别正常细胞和癌细胞的染色试剂，除可应用于实施例2的肝癌细胞检测外，还适用于其他癌细胞的检测。
以上结合附图对本发明的实施方式作出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行的多种变化、修改、替换和变型均仍落入在本发明的保护范围之内。
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