一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法 (Kit for measuring calcium ions and use method thereof ) 是由 柯成锋 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析检测技术领域,具体涉及一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法。本发明主要涉及一种含有如下式I所示化合物的用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒稳定性好、精密度高、线性范围广、不受镁干扰、且不含环境不友好的砷元素,可以应用于生化及临床医药领域。(The invention belongs to the technical field of analysis and detection, and particularly relates to a kit for measuring calcium ions and a using method thereof. The invention mainly relates to a kit containing a compound shown as the following formula I and used for measuring calcium ions and a using method thereof. The kit has good stability, high precision, wide linear range, no interference of magnesium and no environmentally unfriendly arsenic element, and can be applied to the fields of biochemistry and clinical medicine.)
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法。
背景技术
血清总钙量是常用的临床生化检验指标，具有重要的临床意义。
钙是人体内含量最多的阳离子，参考范围非常窄(2.08-2.70mmol/L)，医学决定水平浓度分别是1.75mmol/L、2.75mmol/L和3.38mmol/L。在这些水平之上或之下的轻微偏离对数种生理障碍具有诊断意义。血清钙升高常见于甲状旁腺功能亢进、多发性骨髓瘤、结节病、大量应用维生素D治疗引起的肠道过量吸收。血清钙水平降低一般与甲状旁腺功能减退、慢性肾衰竭等相关。
血清总钙测定方法主要有火焰光度法、原子吸收分光光度法、放射性核素稀释质谱法、滴定法和比色法，其中决定性方法为放射性核素稀释质谱法，参考方法为原子吸收分光光度法。火焰光度法、原子吸收分光光度法和放射性核素稀释质谱法虽然结果准确，干扰因素少，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验和自动分析。
在临床检验中常用的测量钙的方法是比色法，有邻甲酚酞络合酮(OCPC)法、偶氮砷III法、甲基麝香草酚蓝法和NM-BAPTA法。虽然这些方法目前市面都在使用，但是每种方法都有缺点。
OCPC法虽然是WHO和我国卫生部临床检验中心(1997年)推荐的常规方法，但是该方法存在选择性差(也会结合镁)、稳定性差(过分依赖于强碱环境)、线性不通过“零点”等严重缺点。
偶氮砷III法是近几年发展起来的方法，该方法消除了OCPC法的许多缺点，具有试剂稳定、本底吸光度低、无强碱、不怕镁干扰等优点，但是该方法存在试剂间化学污染、灵敏度低和环境污染等问题。
甲基麝香草酚蓝比色法测定血清钙具有快速、简便、结果准确的特点，适用于临床生化检验，缺点是由于试剂碱性较强、试剂本身的稳定性不甚理想。
NM-BAPTA法存在显色剂硝化的产率低的缺点。而且，NM-BAPTA法专一性地与罗氏销售的相关设备配套使用，因而该方法具有价格高、适用设备机型少并且不利于临床应用推广等缺点。
综上所述，开发出稳定性好、精密度高、线性范围广、不受镁干扰、不含砷元素、能应用于临床、全自动检测、适用范围广泛的钙检测试剂是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供新的钙检测试剂，以改进或消除现有技术中的钙检测试剂的缺陷。
发明人发现双硝基取代的BAPTA型螯合剂在此方面表现出非常好的性质，非常适合检测钙离子。
本发明首先提供如下式I的化合物，
其中，R1、R4相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、羧基、C1-6烷基和甲酰基；
R2、R3、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基；
X+为带正电荷的抗衡离子。
根据本发明的实施方案，R1、R4相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、羧基、C1-3烷基和甲酰基；
R2、R3、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1-3烷基或C1-3烷氧基；
X+独立地为钾离子、钠离子、锂离子或铯离子。
根据本发明优选的实施方案，R1、R4选自氢；
R2为甲基或乙基；
R3、R5和R6为H；
X+独立地为钾离子。
作为示例，式I所示的化合物选自如下化合物NNM-BAPTA，
本发明还提供一种检测钙离子浓度的试剂盒，包括：如上所述式I化合物，缓冲试剂及释放剂；
所述缓冲试剂使检测体系的pH维持在7.0-11.0；
所述释放剂选自螯合钙离子性能优于式I化合物的物质。
根据本发明的实施方案，所述缓冲试剂使检测体系的pH维持在7.0-10.0。
根据本发明的实施方案，所述缓冲试剂选自巴比妥钠缓冲体系、TRIS缓冲体系、硼酸缓冲体系、甘氨酸缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系、CAPSO[3-环己基氨基-2-羟基-1-丙磺酸]缓冲体系、CAPS[3-环己基氨基-2-丙磺酸]缓冲体系或咪唑缓冲体系。
根据本发明的实施方案，所述释放剂选自EDTA(乙二胺四乙酸，CAS登记号：60-00-4)、EDTA-2K(乙二胺四乙酸二钾，CAS登记号：25102-12-9)、EGTA(乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-N,N,N,N-四乙酸，CAS登记号：67-42-5)、DTPA(二亚乙基三氨基五乙酸，CAS登记号：67-43-6)、DTPMP(二亚乙基三氨基五(亚甲基膦酸)，CAS登记号：15827-60-8)和/或EDPMP(亚乙基二氨基四(亚甲基膦酸)，CAS登记号1429-50-1)。
根据本发明的实施方案，所述释放剂的浓度为NNM-BAPTA浓度的5倍，10倍，20倍，或50倍，或任意两个这些值为上下限组成的范围。
根据本发明的实施方案，所述试剂盒检测钙离子的浓度范围为0.0～5mmol/L，例如0.0001～3mmol/L，如0.2～1mmol/L。
根据本发明的实施方案，所述试剂盒中式I化合物的最终浓度将为检测样品中钙离子浓度的至少1.1至2.5倍，3倍和至多20倍，15倍或10倍，其是针对具有5mmol/L预期上限的样品所计算的。优选地，式I化合物在测定混合物中的最终浓度将为用样品的稀释因子乘以5mmol/L所得到的摩尔浓度的至少1.1倍，2倍，2.5倍，3倍和至多20倍，15倍或10倍。例如，在所述样品被以1:100稀释的情况中，测定混合物中的最终钙离子浓度将为0.05mmol/L。式I化合物的最终浓度应为该浓度的至少1.1倍，即0.055mmol/L。
在一个优选实施方案中，用于测量钙的试剂盒包含浓度为0.05mmol/L-50mmol/L的式I化合物。
根据本发明的实施方案，所述检测钙离子浓度的试剂盒可以包括两种或更多种式I化合物。在一个优选实施方案中，所述检测钙离子浓度的试剂盒包含单一的一种式I化合物。
根据本发明的实施方案，所述检测钙离子浓度的试剂盒还可以包含或不包含洗涤剂。优选地，所述检测钙离子浓度的试剂盒不包含洗涤剂。在钙离子检测过程中，将洗涤剂添加至用于测量钙离子的试剂中来减少干扰性非特异性结合，减少泡沫和气泡等。优选地，所述洗涤剂指离子洗涤剂或非离子洗涤剂。洗涤剂的实例包括但不限于：十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪酸盐、家族、辛基糖苷、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基-铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、十二烷基麦芽糖苷钠(DM)、月桂基二乙基胺氧化物(LDAO)、NP-40和 家族、伯胺、胺乙酸盐和胺盐酸盐、季铵盐、三甲基乙基溴化铵、取代的二胺的酰胺、二乙醇氨基丙胺或二乙基氨基丙酰胺(diethylaminopropylamide)、环化的二亚乙基三胺的酰胺、烷基芳基磺酸盐、石油磺酸盐、磺化甘油酯、胆酰胺类(cholamides)、磺基甜菜碱类(sulfobetaines)、烷基糖苷、皂苷、烷基-聚乙二醇醚。
本发明还提供如上所述检测钙离子浓度的试剂盒用于检测血液样品(例如全血、血浆或血清)或任何其它含水液体样品(例如脑脊髓液、淋巴液、唾液或尿)中的钙的用途。
本发明还提供如上所述检测钙离子浓度的试剂盒测定样品中的钙离子浓度的方法，包括以下步骤：使样品与包含式I化合物及缓冲液的溶液混合，由此使钙离子与式I化合物结合，然后加入释放剂从式I化合物与钙离子形成的结合体中释放出钙离子，其中所述释放导致式I化合物的吸光度变化，测量吸光度变化并使用测量的吸光度变化来测定钙离子浓度。
因此，根据本发明的实施方案，在检测前可以不使用洗涤剂处理样品。
根据本发明的实施方案，所述样品为血液样品(例如全血、血浆或血清)或任何其它含水液体样品(例如脑脊髓液、淋巴液、唾液或尿)。
根据本发明的实施方案，所述钙离子浓度与吸光度变化成正比关系，根据标准操作可求得所关注样品中钙离子浓度，具体使用如下公式计算：
Ca浓度(mmol/L)＝((A测定-A空白)/(A校准品-A空白))×C校准品。
其中，A测定为待测样品吸光度的实测值，A空白为空白样品吸光度的值，A校准品为校准品吸光度的值。
本申请中式I化合物能够通过以下原理测量钙离子浓度：首先使式I化合物结合钙离子，然后通过添加释放剂而释放钙离子，由此比较释放钙离子之前和之后的吸光度变化；由于吸光度变化与钙离子浓度成正比关系，因而可以由该吸光度变化计算样品中的钙离子浓度。
本发明的有益效果
本发明含式I所示化合物的钙检测试剂稳定性好、精密度高、线性范围广、不受镁干扰且不含环境不友好的砷元素的钙离子检测试剂，该试剂可以应用于生化及临床医药领域，在制成成套试剂盒时可以不使用本领域通常必需的洗涤剂。
术语定义和说明
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。换言之，F、Cl、Br和I在本说明书中可描述为“卤素”。
术语“C1-6烷基”应理解为表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。
术语“C1-6烷氧基”指C1-6烷基-O-，其中C1-6烷基具有如上所述的定义。
附图说明
图1为实施例1中NNM-BAPTA的合成路线图。
图2为实施例1中合成得到的NNM-BAPTA的一维1H NMR谱图(溶剂为D2O)。
图3为实施例1中合成得到的NNM-BAPTA的二维1H NMR谱图(溶剂为D2O)。
图4为根据实施例2，在东芝TBA-40FR全自动生化分析仪上测量钙离子浓度的结果。在上部分(A)中，将理论值和实际测量值彼此相对地作图。在下部分(B)中，给出回收率值。
图5为根据实施例2，在东芝TBA-40FR全自动生化分析仪上测量钙离子浓度的结果，其中将理论值和实际测量值彼此相对地作图。
图6为根据实施例6，NNM-BAPTA在罗氏C8000 701模块全自动生化分析仪上测量钙离子浓度的结果，其中将理论值和实际测量值彼此相对地作图。
图7为根据实施例6，NM-BAPTA在罗氏C8000 701模块全自动生化分析仪上测量钙离子浓度的结果，其中将理论值和实际测量值彼此相对地作图。
图8为根据实施例2，分别给出分析“样品+R1”后和分析“样品+R1+R2”后读取的吸收光谱。两个谱图的索引在图的下面给出。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，否则以下实施例中使用的试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
NNM-BAPTA的合成路线如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)合成2-(2-氯乙氧基)硝基苯
将300g 2-硝基苯酚和620g 1-溴-2-氯乙烷溶解在800mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌均匀之后向其中加入300g碳酸钾，加热回流并且搅拌过夜。冷却至室温之后用乙酸乙酯萃取3次，将有机相旋干之后，用甲醇重结晶得到目标产物300g。
(2)合成2-(2-(2-硝基苯氧基)乙氧基)-4-甲基硝基苯
将300g 2-(2-氯乙氧基)硝基苯和230g 2-硝基-5-甲基苯酚溶解在1000ml DMF中，搅拌均匀之后向其中加入220g碳酸钾，加热回流并且搅拌过夜。冷却至室温之后将反应液倒入冷水中，收集固体，用甲醇重结晶得到目标产物400g。
(3)合成2-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-甲基苯胺(化合物a)
将250g 2-(2-(2-硝基苯氧基)乙氧基)-4-甲基硝基苯溶解在1800mL D MF中，向其中加入25g 20％Pd/C，在10psi氢气下加热搅拌过夜。反应完之后过滤掉Pd/C，滤液旋干得固体产物200g。
(4)合成N-(2-(2-(2-(二(甲氧基羰基甲基)氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基苯基),N-甲氧基羰基甲基-氨基-乙酸甲酯(化合物b)
将200g 2-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-甲基苯胺(化合物a)和600g溴-乙酸甲酯溶于1000mL乙腈中，搅拌均匀之后向其中加入500g碳酸钾。加热回流并且搅拌过夜。冷却至室温之后过滤除去固体，滤液旋干之后用甲醇重结晶，得到目标产物215g。
(5)合成N-(2-(2-(2-(二(甲氧基羰基甲基)氨基)-4-硝基苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-5-硝基苯基),N-甲氧基羰基甲基-氨基-乙酸甲酯(化合物c)
将100g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯(化合物b)溶解在1000ml浓硫酸中。在0℃环境下搅拌均匀，然后向其中加入10mL硝酸，之后在室温下反应2小时。将反应液直接倒入冰水混合物中，析出固体。过滤收集固体，将其用水洗3次之后烘干，然后用甲醇重结晶得到目标产物88g。
(6)合成N-(2-(2-(2-(二(甲氧基羰基甲基)氨基)-4-硝基苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-5-硝基苯基),N-甲氧基羰基甲基-氨基乙酸(化合物d)
将20g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-4-硝基苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-5-硝基苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯(化合物c)溶解在150mL甲醇中，然后加入4mol/L氢氧化钾50mL。加热回流反应2小时，冷却至室温后旋蒸除去甲醇。然后加入150mL水，调节pH至酸性。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。旋蒸除去有机溶剂后得目标产物12g。
(7)合成化合物d的钾盐
将12g化合物d溶解在甲醇中并添加与化合物d等摩尔的氢氧化钾/甲醇进行反应。蒸发和干燥后，得到目标产物15g。其一维和二维核磁氢谱数据如图2和3所示。
实施例2
用实施例1制备的NNM-BAPTA测量钙离子
将一等分试样的关注样品与包含化合物NNM-BAPTA的缓冲溶液混匀并在37℃孵育5分钟。在不同品牌全自动分析仪上，将这种试剂称为R1。
然后读取分析样品和R1混合溶液在最适波长的吸光度值。
然后向样品和R1混合溶液中加入EDTA-2K，混匀并在37℃孵育5分钟。在不同品牌全自动分析仪上，将这种试剂称为R2。
然后分别读取分析样品、R1和R2在最适波长的吸光度值。
吸光度的变化与关注样品中的钙离子浓度成正比，根据标准操作可求得所关注样品中钙离子浓度。具体计算公式为：
Ca浓度(mmol/L)＝((A测定-A空白)/(A校准品-A空白))×C校准品
其中，A测定为待测样品吸光度的实测值，A空白为空白样品吸光度的值，A校准品为校准品吸光度的值。
在表1中，给出推荐用于在不同品牌全自动分析仪上测量钙离子的方法概述。
表1：推荐的用于测量钙离子的移液体积(μL)
表2：R1和R2的各自组成
缓冲液或释放剂
pH
NNM-BAPTA
R1
CAPS(50mmol/L)
10.0
0.275mmol/L
R2
EDTA-2K(5.5mmol/L)
7.0
-
实施例3
使用NNM-BAPTA进行钙测量的准确度
根据本发明的用于测量钙离子的式I化合物及其使用方法具有技术优异性，例如它显示出非常好的准确度。通过向血清样本加内标来测试回收率。如果将理论预期值与实际测量值相比较，这一点会变得显而易见，具体示例如下。
将不同的钙离子浓度(即理论值)与实际测量值进行比较。
例示的一个代表性实例作为图4给出，这是在东芝TBA-40FR的全自动分析仪上测量的。该图证实了测量的准确度。从图4明显看出，NNM-BAPTA实现的回收率在97％-103.5％之间，这反映出该试剂在所研究的整个浓度范围内测试钙离子是相当准确的。
实施例4
使用NNM-BAPTA进行钙测量的线性相关性体现出根据本发明的用于测量钙离子的方法的技术优异性，尤其是它在通常的钙离子测量范围内(0-5.0mmol/L)显示出非常好的线性相关性。如果将理论预期值与实际测量值相比较，这一点会变得显而易见。
在根据本发明的方法中，将不同的钙离子浓度(理论值)与实际测量值进行比较。
例示的又一个代表性实例作为图5给出，其值是在东芝TBA-40FR的全自动分析仪上测量的。这个图证实了根据本发明进行的测量的/线性范围广，即具备突出的技术质量性质。从图5可以看出，线性r值≥0.9998，这反映出在所研究的整个浓度范围内具有相当好的线性。
实施例5
加速稳定性考察
为了研究NNM-BAPTA的稳定性，将NNM-BAPTA在不同pH环境下贮存。贮存环境温度为37℃。在其它条件都相当的情况下，加速考察含有NNM-BAP TA的试剂在不同pH环境下的稳定性。从第0天(即开始对试剂在37℃环境下进行加速稳定性考察的当天)开始，将所述试剂贮存在37℃环境后的测量的值与未贮存在37℃的试剂测量的值进行比较。
所使用的缓冲体系分别是：40mmol/L巴比妥钠(pH＝7.2)，50mmol/L硼酸(pH＝8.0)，50mmol/L甘氨酸(pH＝9.8)，50mmol/L CAPSO(pH＝10)，50mmol/L咪唑(pH＝10)，50mmol/L CAPS(pH＝10)。获得的实验数据汇总于表3-表8。
表3：NNM-BAPTA在40mmol/L巴比妥钠(pH＝7.2)在37℃的稳定性
表4：NNM-BAPTA在50mmol/L硼酸(pH＝8.0)在37℃的稳定性
表5：NNM-BAPTA在50mmol/L甘氨酸(pH＝9.8)在37℃的稳定性
表6：NNM-BAPTA在50mmol/L CAPSO(pH＝10)在37℃的稳定性
表7：NNM-BAPTA在50mmol/L咪唑(pH＝10)在37℃的稳定性
表8：NNM-BAPTA在50mmol/L CAPS(pH＝10)在37℃的稳定性
从表3-表8的数据可以看出，1)含NNM-BAPTA的试剂在pH＝9.8和pH＝10.0的环境下，钙离子恢复在102％-105％，说明试剂在pH＝10.0环境下是稳定的。2)含NNM-BAPTA的试剂在pH＝7.2和pH＝8.0的环境下，钙离子恢复在105％-110％，说明试剂在pH＝7.2和pH＝8.0的环境下也是稳定的。但是稳定性在pH＝10.0环境中相对更好。
实施例6
与市售测试钙离子的试剂NM-BAPTA(罗氏(Roche)，批号：27022701，代理商：罗氏诊断产品(上海)有限公司)进行线性性能对比测试
采购市售NM-BAPTA法试剂，进行对比测试，以用于考察线性指标。
用钙单元素溶液标准物质(GBW(E)080118批号16123)稀释成高低浓度：0.2mmol/L和5mmol/L。然后用高低浓度混合成至少6个稀释浓度(xi)。用试剂盒对每一稀释浓度样本平行测试3次，分别求得测定均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程和线性相关系数r。
在罗氏C8000 701模块的全自动分析仪上测量各种实验值。从图6拟合的线性图来看，NNM-BAPTA法试剂线性方程y＝0.9937x+0.0487，R2＝0.9999，r＝0.9999；从图7拟合的线性图来看，NM-BAPTA法试剂线性方程y＝0.9624x+0.0839，R2＝0.9985，r＝0.9992。其中NNM-BAPTA法试剂拟合曲线r值更接近1.000，说明在线下范围内NNM-BAPTA法试剂测值相对于NM-BAPTA法更接近实际值，具有好的线性。
实施例7
与市售NM-BAPTA进行精密度性能对比测试
对于诊断试剂而言，试剂的精密度指标也是至关重要的，因此，采购市售NM-BAPTA法试剂，进行对比测试，主要考察精密度指标。
分别用含NNM-BAPTA试剂盒和市售的NM-BAPTA法试剂测试了钙单元素溶液标准物质(GBW(E)080261批号16012，标示值2.5mmol/L)和3个不同浓度的血清样品。在重复条件下，分别测试以上样品重复测试20次，计算测量值的平均值和标准差(SD)，计算变异系数(CV)。其值是在罗氏C8000 701模块的全自动分析仪上测量的。对比的实验数据汇总于表9。
表9NNM-BAPTA与市售NM-BAPTA精密度对比测试数据
从表9的实验结果来看，不管是测试标准品还是测试不同水平的血清样本根据本发明的NNM-BAPTA法试剂的精度都显著优于市售NM-BAPTA法试剂。
实施例8
使用NNM-BAPTA进行镁离子干扰的测定
按照《干扰实验指南》(WS/T 416-2013)第15页，附录C中表C.1里面的“建议实验室浓度”的10倍浓度，分别配制不同浓度的Mg2+标准溶液。将不同浓度的Mg2+标准溶液添加到基质血清中，Mg2+标准溶液的加入量为基质血清体积的10％，对照组加入同样量的水作为对照，同时检测添加Mg2+标准溶液的基质血清(C1)和不添加Mg2+标准溶液质的基质血清(C2)，按以下公式(1)、(2)、(3)进行计算：
干扰浓度＝加标准液样品(试验样品)测得浓度C1－未加标准液样品(基础样品)测得浓度C2………………………………………………………(2)
相对干扰浓度＝干扰浓度/基质血清浓度×100％………………………(3)
实验数据汇总于表10。
表10 Mg2+干扰浓度测试结果
表10结果显示，样本中Mg2+浓度达到2mmol/L时，NNM-BAPTA法试剂检测钙离子浓度的结果偏差仅1.0％，即使Mg2+浓度达到5mmol/L时，该偏差也仅3.16％。在人体内镁离子的正常浓度范围为0.75mmol/L～1.02mmol/L，因此，NNM-BAPTA法试剂在临床上用于钙离子测量时并不会受到镁离子的干扰。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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