一种杨梅微生态绿色保鲜剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种杨梅微生态绿色保鲜剂及其制备方法 (Waxberry microecological green preservative and preparation method thereof ) 是由 祝子坪 李娜 李钧敏 谢振达 于 2021-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公布了一种杨梅微生态绿色保鲜剂及其制备方法,属于果蔬保鲜领域,主要解决杨梅常温下储藏期较短的难题。本发明为液体微生态保鲜剂,由对人体有益的活性微生物和成膜剂组成,活性微生物为桑黄菌和酵母菌,成膜剂为黄秋葵多糖和壳聚糖。活性微生物通过拮抗作用抑制杨梅腐败菌,成膜剂形成膜来抑制杨梅呼吸,减缓杨梅衰老,从而延长杨梅保鲜期。本发明所用活性微生物和成膜剂均可食用,安全可靠,保鲜效果好,能使杨梅常温储藏期延长3～4天,所用原料价格低廉、有益于推广。(The invention discloses a micro-ecological green preservative for waxberries and a preparation method thereof, belongs to the field of fruit and vegetable preservation, and mainly solves the problem of short storage period of the waxberries at normal temperature. The invention relates to a liquid microecological preservative which consists of active microorganisms beneficial to human bodies and a film-forming agent, wherein the active microorganisms are phellinus igniarius and saccharomycetes, and the film-forming agent is okra polysaccharide and chitosan. The active microorganisms inhibit the waxberry putrefying bacteria through antagonism, and the film-forming agent forms a film to inhibit the waxberry respiration and slow the waxberry aging, thereby prolonging the waxberry preservation period. The active microorganisms and the film-forming agent can be eaten, so that the method is safe, reliable, good in preservation effect, low in price of raw materials and beneficial to popularization, and the normal-temperature storage period of the waxberries can be prolonged by 3-4 days.)
技术领域
本发明涉及一种食品保鲜剂，具体涉及一种杨梅微生态绿色保鲜剂及其制备方法，属于果蔬保鲜
技术领域
。背景技术
杨梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc）是我国特产水果，栽培面积占全球的99%以上。主要产于福建、浙江、广东、江西等长江流域以南地区，其果实色泽鲜艳、酸甜适口、营养丰富，富含多种维生素、纤维素、矿物质及锌、铁、钾等微量元素和氨基酸等营养物质，有助消化、增食欲、收敛消炎止泻、防癌抗癌、祛暑生津等功效，兼具食用与药用价值，深受消费者喜爱。杨梅以鲜食为主，也可制蜜饯、酿酒等。由于杨梅成熟于高温多雨季节，且果实属浆果，由肉柱聚合而成，柔软多汁，无外果皮包裹，采后易受机械损伤及病原微生物侵染，导致果肉腐烂变质，不利于贮藏，室温条件下货架期仅为2～3 d，有“一日色变、二日味变、三日色香味全变”的说法。杨梅的采收期较为集中，导致上市高峰期产销压力大，严重影响了杨梅的经济效益。因此，研究如何延长杨梅果实的保鲜期、供应期，探讨有效的贮藏手段，对杨梅产业发展有着十分重要的意义。
杨梅的贮藏保鲜方法主要有低温贮藏、防腐保鲜剂处理、辐射保鲜以及气调保鲜等。化学保鲜剂对杨梅的保鲜效果有限，且保鲜剂残留给人体健康和环境带来诸多不利的影响，不易被消费者接受；低温冷藏会降低果实品质和风味口感，影响向外地的运输和销售。辐射保鲜和气调贮藏虽然对杨梅保鲜有一定的效果，但设备投资大、花费昂贵，不易推广。因此，对杨梅进行保鲜研究，开发出成本低、无污染、无公害和操作简便的室温保鲜技术显得尤为重要。研究表明杨梅果实采后腐败主要是由真菌导致的，其中真菌的种类主要有杨梅轮帚霉、桔青霉、绿色木霉、子囊菌、尖抱镰刀菌等，其中，桔青霉和杨梅轮帚霉是主要病害菌。若是在室温条件下贮藏，杨梅果实在第4d便会因为真菌感染而失去食用性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效延长杨梅保鲜期的绿色微生态保鲜剂，以解决杨梅室温下储藏期较短的难题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种杨梅微生态绿色保鲜剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、采用发酵培养基对桑黄菌进行发酵培养，
S2、步骤S1得到的培养液接种酵母菌继续发酵培养，
S3、步骤S2得到的发酵液添加黄秋葵多糖提取液和壳聚糖并搅拌溶解，黄秋葵多糖提取液添加量为60～90mL/L，壳聚糖添加量为5～15g/L，过滤，得到杨梅微生态绿色保鲜剂。
使用时，将杨梅微生态绿色保鲜剂喷洒至杨梅表面微湿形成水膜但不滴水为止，置于室内通风处晾干，装箱室温储藏。
拮抗是自然界中微生物之间普遍存在的现象，由益生菌组成的微生态制剂在调节人和动物肠道菌群，促进营养吸收，保持肠道健康上有显著疗效。基于拮抗原理，本发明筛选对人体有益或无害的微生物在微生态范围内抑制杨梅腐败菌，可延缓杨梅腐败。为了延迟杨梅自然衰老进程，本发明同时用一些多糖类的成膜剂形成膜来抑制杨梅呼吸，从而起到延长杨梅保鲜期的作用。
本发明所述的杨梅微生态保鲜剂由有益活性微生物和成膜剂组成，经试验验证，发明人从桑黄菌、野生乳酸菌Ⅰ、野生乳酸菌Ⅱ、啤酒酵母菌、葡萄酒专用酵母SY和葡萄酒专用酵母RW中筛选得到桑黄菌和葡萄酒专用酵母RW这两种菌作为活性微生物，成膜剂为壳聚糖和黄秋葵多糖。活性微生物通过拮抗作用抑制杨梅腐败菌，成膜剂形成膜来抑制杨梅呼吸，减缓杨梅衰老，从而延长杨梅保鲜期。本发明所用活性微生物和成膜剂均可食用，安全可靠，保鲜效果好，能使杨梅室温储藏期延长3～4天，所用原料价格低廉、有益于推广。
所述的桑黄菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌种编号为5.95，中文译名为火木层孔菌，拉丁学名为Phellinus igniarius。
所述的葡萄酒专用酵母RW，购自安琪酵母股份有限公司，产品标准号：Q/YB.J02.05。
作为优选，步骤S1采用的发酵培养基以质量百分含量计的组成为：桑枝粉5.16%、麦麸2.38%、米糠4.85%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%，余量为水；煮沸加热10min，8层纱布过滤，滤液用灭菌锅121℃灭菌20min，冷却。
作为优选，步骤S1中桑黄菌接种后于28℃、120r/min条件下摇瓶培养，当菌球数达到1～3个/mL时停止发酵；得到的发酵液在无菌条件下用组织粉碎机粉碎到无菌球为止，然后静置培养4～12h。
作为优选，步骤S2中酵母菌发酵条件为25℃、130r/min，发酵时间为10～20h，优选为12～18h。
作为优选，所述的黄秋葵多糖提取液为1L水中加黄秋葵干粉7～13g，50～80℃提取40～60min，提取后黄秋葵多糖浓度为30～45mg/L。
作为优选，步骤S1采用培养基体积5%的桑黄菌种子液接种；步骤S2采用培养基体积5%的酵母菌种子液接种。
作为优选，所述的桑黄菌接种在PDB培养基中28℃、120r/min摇瓶培养3d成种子液，酵母菌接种在PDB培养基中25℃、130r/min摇瓶培养1d成种子液。
上述的制备方法制得杨梅微生态绿色保鲜剂。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用对人体有益微生物来抑制杨梅腐败菌生长，用黄秋葵多糖和壳聚糖成膜来抑制杨梅呼吸，从而延长杨梅保鲜期，室温下储藏，储藏期延长3～4d，具有绿色安全的特点。
2、本发明的保鲜剂为微生物发酵液，多糖为黄秋葵多糖和壳聚糖，所用材料成本低廉，使用方便，易于推广。
附图说明
图1是酵母菌发酵生长曲线。
图2是杨梅保鲜对比实验中各组杨梅的比较照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指所有的份、百分比均指质量，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
桑黄菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌种编号为5.95，中文译名为火木层孔菌，拉丁学名为Phellinus igniarius。
酵母菌为葡萄酒专用酵母RW，购自安琪酵母股份有限公司，产品标准号：Q/YB.J02.05。
黄秋葵多糖提取液，为1L水中加黄秋葵干粉7～13g，50～80℃提取40～60min，提取后黄秋葵多糖浓度为30～45mg/L。
本发明参数优化过程中的失重率、好果率、霉变率、烂果率、裂果率、储藏期的测定方法如下：
（1）失重率
采摘后的新鲜杨梅50颗称重，计算每颗平均质量，记为M0，储藏一定时间t后称重，计算每颗平均质量，记为Mt，则储藏时间t时杨梅的失重率为：
失重率=[(M0-Mt)/M0]×100%
（2）好果率
果形端正、着色鲜艳、果面洁净、肉柱充实、有杨梅特有的香气、无腐烂的杨梅为好果，储藏期间每次随机选50颗，数好果个数，按下式计算好果率：
好果率=（好果个数/调查总果数）×100%
（3）霉变率
储藏期间每次随机选50颗杨梅，逐颗检查霉斑，霉斑直径大于2mm，视为霉果，按下式计算霉变率：
霉变率=（霉果个数/调查总果数）×100%
（4）烂果率
储藏期间每次随机选50颗杨梅，逐颗检查，果实肉柱塌陷，有大量汁液渗出，果实软腐即视为烂果，按下式计算烂果率：
烂果率=（烂果个数/调查总果数）×100%
（5）裂果率
储藏期间每次随机选50颗杨梅，逐颗检查，裂缝长度长于5mm，宽度大于3mm，视为裂果，按下式计算烂果率：
裂果率=（裂果个数/调查总果数）×100%
（6）储藏期
7人组成感官评定小组，每过6h对杨梅果实的外观、气味、质地、腐烂程度进行综合打分后取平均值，平均值≥3.5分的时期定为储藏期。感官评定标准：5分：果形端正，着色鲜艳，果面洁净，肉柱充实，有杨梅特有的香气，无腐烂；4分：果形正常，着色好，有淡淡的香气，肉柱较充实；3分：果实部分皱缩，着色失艳，有肉刺；2分：果实外表皱缩，部分发生霉变，有轻微异味；1分：果实软烂，有较重的腐烂气味。
为了保证试验的精确度，使试验原料具有一致性，本发明进行各项工艺参数优化试验所用杨梅为浙江仙居县乌岩山杨梅专业合作社提供的东魁杨梅，杨梅为八成熟、大小均匀、颜色鲜艳、表面无机械损伤和病虫害的优质果实，用加冰袋的泡沫箱运回实验室。
实施例 杨梅微生态绿色保鲜剂组分筛选方法
（1）微生物筛选
从腐败的杨梅上分离出杨梅主要腐败菌桔青霉和杨梅轮帚霉，取桑黄菌、乳酸菌Ⅰ（分离自酸奶）、乳酸菌Ⅱ（分离自酸菜）、啤酒酵母（购自安琪酵母股份公司）、葡萄酒专用酵母SY（购自安琪酵母股份公司）、葡萄酒专用酵母RW（购自安琪酵母股份公司）分别接种在同一PDA平板上，做拮抗试验，拮抗效果见表1。
表1 杨梅主要腐败菌与益生菌拮抗效果
拮抗菌
桑黄菌
乳酸菌Ⅰ
乳酸菌Ⅱ
啤酒酵母
葡萄酒专用酵母SY
葡萄酒专用酵母RW
桔青霉
+++
+
++
-
++
++
杨梅轮帚霉
++
-
+
+
++
+++
注：-：无拮抗，两菌落没有分界线；+：轻微拮抗，两菌落有明显分界线，分界线较细，宽度小于5mm；++中度拮抗，两菌落有明显分界线，分界线较粗，宽度大于5mm；+++拮抗，重度拮抗，两菌落有明显分界线，分界线较粗，宽度大于1cm。
从表1可知，桑黄菌和葡萄酒专用酵母RW与桔青霉和杨梅轮帚霉有较好的拮抗作用。选桑黄菌和葡萄酒专用酵母RW分别在PDB培养基中发酵，取发酵液喷洒在八成熟的杨梅表面，晾干后室温下储藏4d，考察杨梅失重率、好果率、霉变率、烂果率、裂果率和储藏期。结果可知，桑黄菌和酵母菌发酵液处理后的杨梅与没处理的对照相比好果率分别提高8.84%、12.03%，霉变率分别下降11.36%、15.31%，失重率、烂果率、裂果率没有变化，储藏期分别延长12h和18h，表明桑黄菌和野生酵母菌能够延长杨梅储藏期，因此选桑黄菌和葡萄酒专用酵母RW为保鲜用微生物。
（2）培养基筛选
根据前期试验结果并参考文献配制种子培养基PDB及发酵培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，121℃条件下灭菌20min，冷却至室温。桑黄菌接种在PDB培养基中28℃、120r/min摇瓶培养3d成种子液；酵母菌接种在PDB培养基中25℃、130r/min摇瓶培养1d成种子液。每100mL发酵培养基接种桑黄菌种子液5mL，28℃、120r/min摇瓶培养3d，无菌条件下用组织粉碎机粉碎至菌球消失，静止培养6h，然后每100mL发酵培养基接种酵母菌种子液5mL，25℃、130r/min摇瓶培养1d，发酵液单层纱布过滤，取滤液喷洒于杨梅表面，晾干后室温下储藏4d。考察杨梅失重率、好果率、霉变率、烂果率、裂果率和储藏期。结果可知，培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理后的杨梅与正常储藏的对照相比好果率分别提高15.17%、17.62%、21.48%，霉变率分别下降21.34%、27.63%、36.39%，失重率、烂果率、裂果率没有显著变化，表明培养基Ⅲ延长杨梅储藏期效果较好，因此优选培养基Ⅲ。
各培养基配方：
种子培养基（PDB培养基）：200g马铃薯沸水中煮15min，8层纱布过滤，取滤液，加入20g葡萄糖，补加自来水至1000mL，pH自然。
培养基Ⅰ（改良PDA培养基）：马铃薯200g、桑植20g，取滤液加入20g葡萄糖，补加自来水至1000mL，pH自然。
培养基Ⅱ：麦麸粉51.6g，米糠13.8g，磷酸二氢钾为0.94g，硫酸镁为0.54g，加自来水至1000mL，沸水中煮15min，8层纱布过滤，pH自然。
培养基Ⅲ：桑枝粉15g、麦麸32g、米糠18g、磷酸二氢钾0.94g、硫酸镁0.54g，加自来水至1000mL，沸水中煮15min，8层纱布过滤，pH自然。
（3）菌球粉碎及静置培养时间优化
桑黄菌为丝状真菌，摇瓶发酵时菌丝缠绕成菌球，发酵液中菌丝片段较少，为了增加菌丝片段使用组织粉碎机把菌球打碎，断裂的菌丝片段静置培养以恢复生长活性。
桑黄菌接种于培养基Ⅲ中，28℃、120r/min摇瓶培养3d，发酵液分成两份，一份接种葡萄酒专用酵母RW后继续发酵1d作为对照，另一份无菌条件下用组织粉碎机粉碎到无菌球为止，静置培养4、8、12、16h后接种葡萄酒专用酵母RW继续发酵1d，单层纱布过滤，取滤液喷洒于杨梅表面，晾干后室温下储藏4d，考察杨梅失重率、好果率、霉变率、烂果率、裂果率和储藏期。结果可知，4个时间处理，杨梅好果率提高2.33%、6.46%、5.15%、5.02%，霉变率下降3.69%、7.82%、6.64%、6.51%，失重率、烂果率、裂果率没有显著变化，表明静置培养4～12h桑黄菌恢复生长状态较好，培养液中菌较多，较好延长杨梅储藏期。
（4）酵母菌发酵时间优化
桑黄菌接种于培养基Ⅲ中，28℃、120r/min条件下摇瓶培养3d，接种发酵液体积5%的葡萄酒专用酵母RW种子液，继续发酵，无菌条件下分别在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h时取发酵液，4层纱布过滤，取滤液测OD 600nm 吸光值，结果见图1。从图1可知，10h～20h左右酵母菌处于对数生长期，优选12h～18h，此阶段处于对数生长期中间阶段，细胞生长旺盛。
（5）成膜剂优化
在前期实验的基础上选壳聚糖和黄秋葵多糖为成膜剂，黄秋葵多糖为黄秋葵加水提取而成，多糖浓度为35mg/mL，每1升桑黄菌和葡萄酒专用酵母RW发酵液加黄秋葵多糖提取液和壳聚糖（黄秋葵多糖提取液mL/壳聚糖g）分别为：120/0、90/5、60/10、30/15、0/20，溶解后过滤，取滤液喷洒杨梅表面，晾干后室温下储藏4d，以不用保鲜剂处理杨梅为对照，考察杨梅失重率、好果率、霉变率、烂果率、裂果率和储藏期。
结果为：5个多糖配比处理，杨梅失重率分别下降：7.29%、9.52%、10.83%、16.18%、11.41%，好果率分别提高：33.57%、41.48%、62.15%、82.14%、31.61%，霉变率分别下降：35.36%、51.34%、63.52%、89.47%、65.58%，烂果率分别下降：6.25%、9.56%、9.67%、11.26%、9.13%，裂果率分别下降：4.16%、5.23%、5.38%、7.26%、6.17%，储藏期分别延长：2、2、3、4、3d。根据实验结果可知，壳聚糖添加量为5～15g/L，黄秋葵多糖提取液添加量为60～90mL/L时保鲜效果较好。
实施例1
杨梅微生态保鲜剂的制备方法，具体是：按下面组成配制发酵培养基，培养基配方为：桑枝粉5.16%、麦麸2.38%、米糠4.85%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%，其余为自来水，培养基用灭菌锅121℃灭菌20min。接种发酵液体积5%的桑黄菌种子液，在28℃、120r/min条件下摇瓶培养，当菌球数达到2个/mL时停止发酵，无菌条件下用组织粉碎机粉碎至菌球消失为止，28℃静置培养6h，接种发酵液体积5%的野生酵母菌种子液，25℃、130r/min条件下摇瓶培养16h，每1升发酵液加60mL黄秋葵多糖提取液和12g壳聚糖，搅拌溶解后4层纱布过滤，得到杨梅微生态保鲜剂。
取杨梅微生态保鲜剂喷洒在八成熟、无病虫害和机械损伤的杨梅表面，至微湿不滴水为止，晾干后及时装于塑料筐中，每筐装2.5kg，放纸箱中室温储藏，储藏期比不用保鲜剂的对照延长3.5d。
实施例2
杨梅微生态保鲜剂的制备方法，具体是：按配方配制发酵培养基，培养基配方为：桑枝粉5.16%、麦麸2.38%、米糠4.85%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%，其余为自来水，培养基用灭菌锅121℃灭菌20min。接种发酵液体积5%的桑黄菌种子液，在28℃、120r/min条件下摇瓶培养，当菌球数达到3个/mL时停止发酵，无菌条件下用组织粉碎机粉碎至菌球消失为止，28℃静置培养8h，接种发酵液体积5%的野生酵母菌种子液，25℃、130r/min条件下摇瓶培养18h，每1升发酵液加80mL黄秋葵多糖提取液和10g壳聚糖，搅拌溶解后4层纱布过滤，得到杨梅微生态保鲜剂。
取杨梅微生态保鲜剂喷洒在八成熟、无病虫害和机械损伤的杨梅表面，至微湿不滴水为止，晾干后及时装于塑料筐中，每筐装2.5kg，放纸箱中室温储藏，储藏期比不用保鲜剂的对照延长4d。
实施例3
杨梅微生态保鲜剂的制备方法，具体是：按配方配制发酵培养基，培养基配方为：桑枝粉5.16%、麦麸2.38%、米糠4.85%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%，其余为自来水，培养基用灭菌锅121℃灭菌20min。接种发酵液体积5%的桑黄菌种子液，在28℃、120r/min条件下摇瓶培养，当菌球数达到1个/mL时停止发酵，无菌条件下用组织粉碎机粉碎至菌球消失为止，28℃静置培养10h，接种发酵液体积5%的野生酵母菌种子液，25℃、130r/min条件下摇瓶培养15h，每1升发酵液加90mL黄秋葵多糖提取液和12g壳聚糖，搅拌溶解后4层纱布过滤，得到杨梅微生态保鲜剂。
取杨梅微生态保鲜剂喷洒在八成熟、无病虫害和机械损伤的杨梅表面，至微湿不滴水为止，晾干后及时装于塑料筐中，每筐装2.5kg，放纸箱中室温储藏，储藏期比不用保鲜剂的对照延长4d。
实施例4
杨梅微生态保鲜剂的制备方法，具体是：按配方配制发酵培养基，培养基配方为：桑枝粉5.16%、麦麸2.38%、米糠4.85%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%，其余为自来水，培养基用灭菌锅121℃灭菌20min。接种发酵液体积5%的桑黄菌种子液，在28℃、120r/min条件下摇瓶培养，当菌球数达到2个/mL时停止发酵，无菌条件下用组织粉碎机粉碎至菌球消失为止，28℃静置培养8h，接种发酵液体积5%的野生酵母菌种子液，25℃、130r/min条件下摇瓶培养16h，每1升发酵液加70mL黄秋葵多糖提取液和10g壳聚糖，搅拌溶解后4层纱布过滤，得到杨梅微生态保鲜剂。
取杨梅微生态保鲜剂喷洒在八成熟、无病虫害和机械损伤的杨梅表面，至微湿不滴水为止，晾干后及时装于塑料筐中，每筐装2.5kg，放纸箱中室温储藏，储藏期比不用保鲜剂的对照延长3.5d。
对比例 杨梅保鲜对比实验
将新鲜采摘的杨梅平均分成3份，放普通包装箱中分别进行室温储藏（NC）、喷微生态绿色保鲜剂（本发明实施例1制得）室温储藏（EG）、喷0.5%山梨酸钾室温储藏（PC）。杨梅为八成熟、大小均匀、颜色鲜艳、表面无机械损伤和病虫害的优质果实。
储藏0d、4d、7d时，分别对各组杨梅失重率、霉变率等情况进行统计。
室温储藏（NC）、喷微生态绿色保鲜剂室温储藏（EG）、喷0.5%山梨酸钾室温储藏（PC）下的杨梅失重率分别为：6.29%、4.12%、6.13%，好果率分别为：35.36%、65.26%、60.96%，霉变率分别为：54.27%、5.96%、6.51%，烂果率分别为：14.38%、12.75%、14.26%，裂果率分别为：8.52%、7.93%、8.55%，储藏期分别为：3.5 d、7.5 d、7d，图2是各组杨梅的照片对比照片。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的一种杨梅微生态绿色保鲜剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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