乙酰化可溶性大豆多糖及其在提高奶茶稳定性中的应用
阅读说明：本技术 乙酰化可溶性大豆多糖及其在提高奶茶稳定性中的应用 (Acetylated soluble soybean polysaccharide and application thereof in improving milk tea stability ) 是由 童群义 徐洁茹 耿子蔚 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种乙酰化可溶性大豆多糖及其在提高奶茶稳定性中的应用。本发明按照可溶性大豆多糖与乙酸酐的质量体积比为1:10～25,向可溶性大豆多糖溶液中交替加入氢氧化钠和乙酸酐,在30～50℃下,搅拌反应1～3h,反应过程中,控制反应体系pH在8.0～10.0内,反应结束后调节pH至中性,分离得到乙酰化可溶性大豆多糖。本发明制备得到的乙酰化可溶性大豆多糖,乙酰取代度高,在1.0～1.3范围,具有较可溶性大豆多糖更高的乳化性和起泡性,应用在奶茶中,能够有效提高奶茶稳定性,尤其是高分子量乙酰化可溶性大豆多糖,具有较高的乳化性和起泡性,并能显著提高奶茶的稳定性。(The invention relates to acetylated soluble soybean polysaccharide and application thereof in improving the stability of milk tea. According to the method, sodium hydroxide and acetic anhydride are alternately added into a soluble soybean polysaccharide solution according to the mass-to-volume ratio of 1: 10-25 of the soluble soybean polysaccharide to the acetic anhydride, the mixture is stirred and reacted for 1-3 hours at the temperature of 30-50 ℃, the pH of a reaction system is controlled within 8.0-10.0 in the reaction process, the pH is adjusted to be neutral after the reaction is finished, and the acetylated soluble soybean polysaccharide is obtained through separation. The acetylated soluble soybean polysaccharide prepared by the invention has high acetyl substitution degree within the range of 1.0-1.3, has higher emulsibility and foamability than the soluble soybean polysaccharide, can effectively improve the stability of milk tea when being applied to milk tea, and particularly has higher emulsibility and foamability when being applied to high molecular weight acetylated soluble soybean polysaccharide, and can obviously improve the stability of milk tea.)
技术领域
本发明涉及食品技术领域，尤其涉及一种乙酰化可溶性大豆多糖及其在提高奶茶稳定性中的应用。
背景技术
多糖是由10个以上单糖通过糖苷键线性或分支连接而成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，是存在于动植物及微生物体内的一类重要的生物活性大分子物质。它广泛参与了细胞的各种生命现象及生理活动过程的调节，多糖具有抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、降血糖、保肝、调节免疫等生理活性。大量药理及临床研究表明，多糖是一种免疫调节剂，它能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，实现抗肿瘤的功能。
多糖的理化性质和生物活性与其结构密切相关，多糖的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和多糖分子的高级结构，其中多糖主链的糖单元组成、糖苷键类型均直接决定了多糖的性质和活性，多糖支链的类型、聚合度、支链在多糖链上的分布及其取代度决定了多糖性质的不同和活性的大小，因此为优化理化性质和生物活性，多糖的分子修饰和结构改造具有重要意义。
可溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharides，SSPS)是从豆渣中提取而来的一种水溶性阴离子多糖，众多研究表明，SSPS具有丰富的膳食纤维，具有独特的功能特性，如在酸性条件下稳定蛋白的能力、良好的乳化稳定性、起泡性、抗淀粉粘结以及成膜性等功能特性和抗氧化性等生物活性，因此大豆多糖在食品行业中具有愈来愈广泛的应用。
奶茶是一种以鲜奶或乳粉为原料并添加一定量茶粉或茶水的液态乳制品，是当下流行的饮品之一。由于奶茶为脂肪、蛋白质、碳水化合物等组成的复杂乳状液体系，其中乳蛋白易与茶汤中的茶多酚类反应产生大分子的络合不溶物质，乳脂肪易上浮形成顶部浮层。因此为了使奶茶在一定时间内保持均匀稳定的体系，需要添加恰当的乳化稳定剂。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种乙酰化可溶性大豆多糖及其在提高奶茶稳定性中的应用，本发明制备得到的乙酰化可溶性大豆多糖，乙酰取代度高，在1.0～1.3范围，具有较可溶性大豆多糖更高的乳化性和起泡性，应用在奶茶中，能够有效提高奶茶稳定性。
本发明的第一个目的是提供了一种乙酰化可溶性大豆多糖的制备方法，包括如下步骤：按照可溶性大豆多糖与乙酸酐的质量体积比为1:10～25，向可溶性大豆多糖溶液中交替加入氢氧化钠和乙酸酐，在30～50℃下，搅拌反应1～3h，反应过程中，控制反应体系pH在8.0～10.0内，反应结束后调节pH至中性，分离得到所述的乙酰化可溶性大豆多糖。
进一步地，所述的可溶性大豆多糖溶液的浓度为10～30mg/mL。
进一步地，所述的氢氧化钠的浓度为3～5mol/L。
进一步地，所述的分离包括透析、减压浓缩、醇沉和离心步骤。
进一步地，所述的透析是采用截留量为3000～4000Da的透析膜透析24～72h。
进一步地，所述的减压浓缩是在温度为50～70℃，真空度为0.08～0.095mPa条件下进行浓缩。
进一步地，所述的醇沉是加入3～5倍无水乙醇，醇沉10～15h。
进一步地，所述的离心是采用3500～4500r/min离心4～6min。
进一步地，所述的方法还包括采用超滤分离乙酰化可溶性大豆多糖，制备高分子量乙酰化可溶性大豆多糖；所述的超滤是采用孔径为15～25nm的超滤膜，在0.1～0.15mPa压力下超滤。
本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的乙酰化可溶性大豆多糖。
本发明的第三个目的是提供所述的乙酰化可溶性大豆多糖在提高奶茶稳定性中的应用。
进一步地，所述的应用是将所述的乙酰化可溶性大豆多糖按照1～5mg/mL添加在奶茶中，在40～80℃、10～20MPa条件下均质。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明制备得到的乙酰化可溶性大豆多糖，乙酰取代度高，在1.0～1.3范围，具有较可溶性大豆多糖更高的乳化性和起泡性，应用在奶茶中，能够有效提高奶茶稳定性，尤其是高分子量乙酰化可溶性大豆多糖，具有较高的乳化性和起泡性，并能显著提高奶茶的稳定性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为料液比对乙酰化可溶性大豆多糖取代度的影响图；
图2为反应温度对乙酰化可溶性大豆多糖取代度的影响图；
图3为反应时间对乙酰化可溶性大豆多糖取代度的影响图；
图4为可溶性大豆多糖乙酰化前后红外光谱测定图；
图5为乙酰化可溶性大豆多糖分离前后红外光谱测定图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中可溶性大豆多糖(SSPS)购自福建省泉州市味博食品有限公司，其中可溶性多糖含量81.4％、粗蛋白质(以干基计)为0.92％、粗灰分(以干基计)为7.2％、粗脂肪(以干基计)为0.2％。其他原料，如无特殊说明，均为普通市售。
乙酰化可溶性大豆多糖取代度的测定
本发明采用羟胺比色法测定乙酰化可溶性大豆多糖的取代度，具体操作步骤如下：
(1)β-D-五乙酰葡萄糖储备液的配制：精密称取β-D-五乙酰葡萄糖0.6978g，加入20mL乙醇中于60℃水浴加热溶解后，置于100mL容量瓶中冷却至室温，再加水稀释至刻度，摇匀后即得。
(2)β-D-五乙酰葡萄糖系列标准溶液的配制：精密吸取β-D-五乙酰葡萄糖对照品储备液2、4、6、8、10、12mL，分别置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得，依次标记为1～6号对照品溶液。
(3)样品溶液的配制：精密称取乙酰化可溶性大豆多糖0.02901g，用蒸馏水溶解，定容到10mL即得。
(4)样品测定步骤：精确吸取一定量的多糖溶液于50mL棕色容量瓶中，准确加入0.1mol/L新配制的盐酸羟胺溶液5mL，加入1.5mol/L氢氧化钠溶液5mL混匀，静置20min后，加入2mol/L盐酸3.5mL以中和过量的碱，混匀后静置20min，滴加0.37mol/L三氯化铁溶液10mL混匀，用去离子水定容，静置10min后，取2.5mL，置于1cm石英池中，500nm处测定吸收度值。以相同量的去离子水代替多糖溶液同法操作，作为空白，一定时间内测定吸收度。
(5)精密吸取1～6号对照品溶液5mL于50mL棕色容量瓶中，按步骤(4)的方法于500nm处测定吸收度值。以乙酰基浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制乙酰基质量浓度标准曲线。
(6)乙酰取代度的计算方法：乙酰取代度是指平均每个失水葡萄糖单元上被乙酰基取代的羟基数目，具体数值按以下公式得出：
W2(％)＝W2/W1×100
DS＝162×W2％/[4300-(43-1)×W2％]
式中：W1-多糖的质量(mg)，W2-多糖中乙酰基的质量(mg)，162-乙酰化可溶性大豆多糖中一个单糖基相对分子质量，43-乙酰基相对分子质量，1-氢原子的相对分子质量。
由于可溶性大豆多糖本身含有少量乙酰基，本发明的乙酰取代度将以相对取代度表示。
实施例1：乙酰化可溶性大豆多糖的制备
料液比、反应温度和反应时间的单因素实验
1.料液比对乙酰化可溶性大豆多糖的取代度的影响
将可溶性大豆多糖与蒸馏水按照质量比1：50的比例混合溶解，制备浓度为20mg/mL的可溶性大豆多糖溶液。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH为8.0，在40℃条件下向溶液中交替加入0.5mol/L氢氧化钠溶液和乙酸酐，控制体系pH在8.0～10.0范围，按溶液中可溶性大豆多糖质量与乙酸酐的体积比，即料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25添加乙酸酐，直至加完。本实施例中，溶液中可溶性大豆多糖含量为0.2g，故不同料液比下乙酸酐添加量为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL。搅拌反应1.5h后，用0.1mol/L的盐酸调节体系pH为7.0以终止反应。将反应液用截留分子量为3500Da的透析袋蒸馏水透析48h，透析液用旋转蒸发仪在真空度为0.08～0.095mPa、60℃条件下减压浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积的无水乙醇4℃醇沉过夜，冷冻干燥后即得乙酰化可溶性大豆多糖。
不同料液比条件下乙酰化可溶性大豆多糖的取代度如图1所示，从图1可以看出随着乙酸酐添加量的增大，乙酰化可溶性大豆多糖的取代度先增大后减小，在乙酸酐添加量为3mL，即料液比为1:15时，取代度达最大值。
2.反应温度对乙酰化可溶性大豆多糖的取代度的影响
同样进行上述实验步骤，料液比固定为1:15，反应温度分别控制为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，搅拌反应1.5h后调节体系pH为7.0，将反应液透析、浓缩、醇沉和冷冻干燥后得乙酰化可溶性大豆多糖。
不同反应温度条件下乙酰化可溶性大豆多糖的取代度如图2所示，从图2可以看出随着反应温度的升高，乙酰化可溶性大豆多糖的取代度先增大后减小，在反应温度为40℃时，取代度达最大值。
3.反应时间对乙酰化可溶性大豆多糖的取代度的影响
同样进行上述实验步骤，料液比固定为1:15，反应温度为40℃时，分别搅拌反应0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h后调节体系pH为7.0，将反应液透析、浓缩、醇沉和冷冻干燥后得乙酰化可溶性大豆多糖。
不同反应时间条件下乙酰化可溶性大豆多糖的取代度如图3所示，从图3可以看出随着反应时间的增加，乙酰化可溶性大豆多糖的取代度先增大后减小，在反应时间为1.5h时，取代度达最大值。
料液比、反应温度和反应时间的正交实验
按照表1得正交分析表进行实验，并测定乙酰化可溶性大豆多糖的取代度。
表1 L9(33)正交试验设计水平
乙酰化可溶性大豆多糖的取代度和极差分析结果如表2所示：
表2 L9(33)正交试验设计结果
由表2可知，三个实验因素对取代度的影响作用由大到小依次为：料液比＞反应温度＞反应时间，正交实验得到的最适条件为可溶性大豆多糖质量与乙酸酐体积比为1:15，反应温度40℃，反应时间1.5h，在最优条件下进行验证实验，制得乙酰化可溶性大豆多糖的取代度为2.257，表明该优选条件稳定可行，重复性良好。取该条件下制得的乙酰化可溶性大豆多糖进行后续实验。
实施例2：乙酰化可溶性大豆多糖的分级分离
将乙酰化可溶性大豆多糖充分溶于去离子水中，制备成质量分数为1％的乙酰化可溶性大豆多糖溶液。将溶液加入超滤装置的料桶中进行超滤，超滤膜为孔径为20nm的陶瓷复合膜，工作压力为0.1～0.15mPa。透过超滤膜的低分子量乙酰化可溶性大豆多糖在出料口被收集，而未被滤出的溶液则回到料桶中。当料桶中溶液降为初始溶液体积的25％时，向料桶中加入25％初始体积的去离子水，重复3次后，当料桶中溶液降至初始溶液体积的25％时结束超滤。将滤出液和未滤出液分别减压浓缩后48h冷冻干燥，即得高分子量乙酰化可溶性大豆多糖(Ac-SSPS-H)和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖(Ac-SSPS-L)。
实施例3：乙酰化可溶性大豆多糖分析
1.可溶性大豆多糖乙酰化前后及乙酰化可溶性大豆多糖分离前后红外光谱分析
用傅里叶红外光谱对样品进行红外的测定。在干燥灯下，分别精确称取1mg可溶性大豆多糖、乙酰化可溶性大豆多糖、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖样品，加入100mgKBr于玛瑙研钵中轻轻研磨均匀，经压片机压成透明薄片，在4000-400cm-1下扫描，扣除空气空白背景后得到样品多糖的红外扫描图谱。
由图4、5可知，3430cm-1处的宽吸收峰表示O-H的伸缩振动，2927cm-1处的弱吸收表示C-H的特征峰。可溶性大豆多糖经乙酰化修饰后出现了两个特征吸收峰：1740cm-1左右出现的峰，推断为乙酰酯基C＝O的伸缩振动峰；1245cm-1左右出现的弱峰，推断为酯基的C-O伸缩振动峰，分离后的高、低分子量乙酰化可溶性大豆多糖的红外光谱也出现这两个特征吸收峰。以上结果证实乙酰基团存在于分离前后的乙酰化可溶性大豆多糖中。此外，四图的红外吸收光谱非常接近，这说明乙酰化修饰和超滤分离并未改变可溶性大豆多糖的大体结构。
2.可溶性大豆多糖乙酰化前后分子量和均方旋转半径的测定
用高效凝胶渗透色谱仪与多角度激光散射和折射率检测器对样品进行分子量和均方旋转半径的测定，使用Shodex OHpak SB-805HQ色谱柱。分别将25mg可溶性大豆多糖、乙酰化可溶性大豆多糖、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖样品溶于5mL超纯水中，溶液用0.45um过滤器过滤后上柱，进样体积为150μL，流动相为0.1mol/L的NaNO3溶液，流速为0.5mL/min，柱温50℃。
可溶性大豆多糖(SSPS)、乙酰化可溶性大豆多糖(Ac-SSPS)、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖(Ac-SSPS-H)和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖(Ac-SSPS-L)的分子量及均方旋转半径测定结果如表3所示：
表3 SSPS和Ac-SSPS的分子量及均方旋转半径
由表3可知，乙酰化改性后可溶性大豆多糖的分子量增大,且孔径为20nm的超滤膜可成功将乙酰化可溶性大豆多糖分离为重均分子量为586kDa的高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和重均分子量为57.9kDa的低分子量乙酰化可溶性大豆多糖。Rz表示高分子链在空间的伸展程度，Ac-SSPS的Rz明显比SSPS大，这可能是相邻链的取代基之间的静电排斥导致的。
实施例4：可溶性大豆多糖和乙酰化可溶性大豆多糖乳化性的测定
乳化性主要指的是乳化剂的乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ES)。分别取0.15g的可溶性大豆多糖、乙酰化可溶性大豆多糖、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖样品溶于15mL蒸馏水中，向多糖溶液中分别加入玉米油5mL,15000rpm下高速剪切10min后，分别取0min和静置10min的乳液底层样品100μL加入到10mL的0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中，震荡均匀后用紫外分光光度计在500nm波长处测定其吸光度(A500)，以0.1％SDS溶液为空白对照。其中，
式中：EAI为单位质量多糖的乳化表面积(m2/g)；A为500nm波长处的吸光度值；DF为乳液在0.1％SDS溶液中的稀释倍数-100；C为样品溶液中多糖的质量浓度-10000g/m3；为油相在乳液中所占比例-0.25；L为比色皿的光径-0.01m；ES为乳液静置10min后的稳定值。
可溶性大豆多糖乙酰化前后的乳化性如表4所示
表4 SSPS和Ac-SSPS的乳化性
由表4可知，可溶性大豆多糖经乙酰化改性后其乳化活性和乳化稳定性都明显提高，其乳化性的改善可能是因为可溶性大豆多糖上接入疏水的乙酰基，提高了其两亲性,且高分子量的乙酰化可溶性大豆多糖的乳化活性和乳化稳定性比未分离的乙酰化可溶性大豆多糖更高。
实施例5：可溶性大豆多糖和乙酰化可溶性大豆多糖起泡性的测定
起泡性主要指起泡剂的泡沫膨胀率和泡沫稳定性。分别取0.1g的可溶性大豆多糖、乙酰化可溶性大豆多糖、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖样品溶于10mL蒸馏水中，将其转移到50mL的塑料量筒中，用匀浆器以17500r/min的速度搅打2min。其中:
泡沫稳定性(FS)＝V2V1
式中：FE为泡沫膨胀率，％；FS为泡沫稳定性，％；V0为溶液的初始体积，mL；V1为刚搅打完时泡沫的体积，mL；V2为静置30min后的泡沫体积，mL。
可溶性大豆多糖乙酰化前后的起泡性如表5所示
表5 SSPS和Ac-SSPS的起泡性
由表5可知，可溶性大豆多糖经乙酰化改性后泡沫膨胀率和泡沫稳定性都明显提高，其起泡性的改善可能是因为可溶性大豆多糖上接入疏水的乙酰基，分子量增大的同时增强其两亲性，使其更好地在气-水界面产生泡沫并保持稳定，且高分子量的乙酰化可溶性大豆多糖的起泡性和泡沫稳定性比未分离的乙酰化可溶性大豆多糖更高。
实施例6：乙酰化可溶性大豆多糖对奶茶稳定性的影响
奶茶的乳化稳定性常用奶茶的离心沉淀率、油脂析出率和粘度表示。称取1g绿茶茶叶加入30ml水中于95℃水浴20分钟，纱布过滤之后冷却至60～70℃即得茶汤。分别称取0.08g可溶性大豆多糖、乙酰化可溶性大豆多糖、高分子量乙酰化可溶性大豆多糖和低分子量乙酰化可溶性大豆多糖样品溶于10mL茶汤和30ml鲜奶的混合液中，65℃、15MPa条件下均质，并制备不含大豆多糖的奶茶作为空白对照。冷却至室温后，用粘度计测定奶茶粘度。通过离心测定奶茶的离心沉淀率和油脂析出率，离心条件为3000r/min离心10分钟。其中：
式中，M1为沉淀物质量，g；M2为离心前样品质量，g。
式中，N1为顶层浮层体积，mL；N2为离心前样品体积，mL。
乙酰化可溶性大豆多糖对奶茶稳定性的影响如表6所示
表6 SSPS和Ac-SSPS对奶茶稳定性的影响
由表6可知，在奶茶中添加SSPS和Ac-SSPS都能使奶茶的离心沉淀率和油脂析出率降低，且添加Ac-SSPS的奶茶离心沉淀和油脂析出更少；添加SSPS和Ac-SSPS都会使奶茶的粘度增大，添加Ac-SSPS的奶茶粘度更高。因此，在奶茶中加入大豆多糖或乙酰化可溶性大豆多糖都能提高奶茶的稳定性，添加高分子量的乙酰化可溶性大豆多糖做奶茶稳定剂的效果更好。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。