一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法
阅读说明：本技术 一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法 (Method for preparing chondroitin sulfate from squid cartilage ) 是由 吴文惠 杨劲峰 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法,其解决提取硫酸软骨素的传统方法存在提取工艺复杂、产品得率低、蛋白含量高于5%的问题。其经过以下工艺步骤：1)硫酸软骨素裂解酶制备；2)鱿鱼软骨酶解；3)纯化；4)干燥。其是以鱿鱼软骨为原料,通过鸭小肠提取硫酸软骨素裂解酶,并应用于鱿鱼软骨酶解制备硫酸软骨素,发酵产物经醇-盐第一次纯化,联合膜-电场第二次纯化,干燥获得本发明产品。本发明采用生物法和联合纯化法,提取率高、生物活性强,制备的硫酸软骨素主要是硫酸软骨素C。本发明工艺流程简单高效,易控制,利于大规模推广生产。(The invention discloses a method for preparing chondroitin sulfate by utilizing squid cartilage, which solves the problems of complex extraction process, low product yield and protein content higher than 5 percent of the traditional method for extracting the chondroitin sulfate. The method comprises the following process steps: 1) preparing chondroitin sulfate lyase; 2) carrying out enzymolysis on squid cartilage; 3) purifying; 4) and (5) drying. The method comprises the steps of taking squid cartilage as a raw material, extracting chondroitin sulfate lyase through duck small intestines, applying the chondroitin sulfate lyase to the squid cartilage for enzymolysis to prepare chondroitin sulfate, purifying a fermentation product for the first time through alcohol-salt, purifying the fermentation product for the second time through a combined membrane-electric field, and drying the fermentation product to obtain the product. The invention adopts a biological method and a combined purification method, has high extraction rate and strong biological activity, and the prepared chondroitin sulfate is mainly chondroitin sulfate C. The method has the advantages of simple and efficient process flow, easy control and contribution to large-scale popularization and production.)
技术领域
本发明涉及硫酸软骨素的制备，尤其是一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法。
背景技术
鱿鱼加工常伴有大量副产物生成，包括软骨、内壳等，这些下脚料很少被利用，除部分加工成鱼粉或饲料外，因其易腐烂、变质而作垃圾处理，造成了资源的浪费。研究表明，鱿鱼软骨主要成分有蛋白质和硫酸软骨素，其中软骨素为生物医药产品，具有降血脂、预防血管硬化等多种活性。因此，加强综合利用，变废为宝，可有效提升其附加值，同时减少废弃物处理的成本，推进了鱿鱼加工的发展。因鱿鱼软骨来源广，是一种较为理想的硫酸软骨素新来源。
硫酸软骨素是糖胺聚糖，目前采用传统的碱法、酶法、中性盐法、碱-盐法、乙酸抽提法、稀碱-酶法等提取硫酸软骨素，尚存在提取工艺复杂、产品得率低、蛋白含量高于5%等缺陷。目前，未见利用酶解结合电纯化制备硫酸软骨素的报道。
发明内容
为了克服提取硫酸软骨素的传统方法存在提取工艺复杂、产品得率低、蛋白含量高于5%的不足，本发明的目的在于提供一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法。本发明采用生物法和联合纯化法，提取率高、生物活性强，制备的硫酸软骨素主要是硫酸软骨素C，工艺流程简单高效，易控制，利于大规模推广生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：
1）硫酸软骨素裂解酶制备
a.取新鲜鸭小肠，用破壁机粉碎，按重量份1:5-6添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌10-20min，用160-180目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板，30℃-37℃恒温培养1-3天，向平板中倒入无菌水，浸泡3-5min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养，控制温度保持在30℃-37℃，120-150r/min振荡好氧培养1-3天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度30-37℃、120-150r/min振荡通气培养1-3天，菌体密度为1×108 - 5×108个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；
b. 按4-6%v/v接种量将硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液接入发酵罐中，在30℃-37℃发酵培养基，经48-60h发酵，用低温离心机5℃、4000-5500r/min离心20-30min,取上清液，在冰浴中缓缓向上清液中加入氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物，5℃静置18-20h，低温离心机5℃、8000-10000r/min离心25-38min,取沉淀，用去离子水溶解，转移至透析袋中，透析脱除杂质即得硫酸软骨素裂解酶；
2）鱿鱼软骨酶解
a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡2-5h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；
b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数20%-30%和水混合，按2%-5%混合物重量百分比添加步骤1）b中提取的硫酸软骨素裂解酶，温度45-51℃、pH8.5-10、100-120r/min酶解4-6h；
c.酶解完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为30-35%；
3）纯化
a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇65-80%V/V，并调节pH5.2-7.0，搅拌30-60min，静置4-5h，离心去除上清液；
b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入透析袋进行透析纯化，同时外加0.5-0.8V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到74-81%V/V，同时调节pH5.5-6.5，静置8-10h，离心，重复结晶2-3次；
4）干燥
将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。
作为优选，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基、营养琼脂培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基中的一种。
作为优选，在步骤1）中，所述的鸭小肠取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂2-3年的鸭子。
作为优选，在步骤2）b中，在添加硫酸软骨素裂解酶前还加入了混合物重量2-4%CaCl2、3-5%乙醇。
作为优选，在步骤2）b中，在添加硫酸软骨素裂解酶前还加入了混合物重量3.5%CaCl2、4%乙醇。
作为优选，在步骤3）b中，所述的透析袋规格为4-10kD，且为即用型。
作为优选，在步骤1）b中，所述的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物按重量百分数添加量为85-92%。
作为优选，在步骤1）b中，所述的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物组成比例为W氯化钠：W硫酸铵：V乙醇为1:6-8:3，其中W氯化钠为氯化钠添加重量，W硫酸铵为硫酸铵添加重量，V乙醇为乙醇添加体积。
本发明有益效果：
(1)本发明采用的酶解耦合稀盐法，协同提取硫酸软骨素，较现有硫酸软骨素提取工艺提取率高，工艺流程简单、温和、高效，易控制，利于大规模推广生产；
(2)本发明采用的透析耦合电场纯化法，在脱除大分子杂质的同时将杂质盐类有效脱除，又因硫酸软骨素带负电，在负极方向聚集，从而与杂蛋白开，产物纯度高；
(3)本发明硫酸软骨素酶分离纯化采用盐析沉淀法耦合醇沉法和硫酸铵法，联合透析法。此方法较单一纯化方法制备的酶活性高，纯度高；
(4)本发明制备的产物主要为硫酸软骨素C，其中蛋白质含量小于2.5%。
附图说明
图1是实施例1的产物样品与C-S2标准品傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
除特殊说明，以下实施例中培养基均为LB培养基。
实施例1
一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其经过以下工艺步骤：
1）硫酸软骨素裂解酶制备
a.取新鲜鸭小肠，取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂2年的鸭子，用破壁机粉碎，按重量份1:5.5添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌15min，用180目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板，32℃恒温培养2天，向平板中倒入无菌水，浸泡4min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养，控制温度保持在32℃，130r/min振荡好氧培养2天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度，32℃、130r/min振荡通气培,1天，菌体密度为3×108个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；
b. 按5%v/v接种量将硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液接入发酵罐中，在32℃发酵培养基，经48h发酵，用低温离心机5℃、5000r/min离心25min,取上清液，在冰浴中缓缓向上清液中按重量百分数添加90%的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物，5℃静置18.5h，低温离心机5℃、9000r/min离心30min,取沉淀，用去离子水溶解，转移至透析袋中，透析脱除杂质即得硫酸软骨素裂解酶；所述氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物组成比例为W氯化钠：W硫酸铵：V乙醇为1:7:3；
2）鱿鱼软骨酶解
a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡4h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；
b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数28%和水混合，加入了混合物重量3%CaCl2、4%乙醇，3.5%硫酸软骨素裂解酶，温度50℃、pH9、120r/min酶解5h；
c.酶解完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为32%；
3）纯化
a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇70%V/V，并调节pH6.3，搅拌40min，静置4.5h，离心去除上清液；
b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入规格为8kD，且为即用型透析袋进行透析纯化，同时外加0.6V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到78%V/V，同时调节pH6.3，静置9h，离心，重复结晶3次；
4）干燥
将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。
实施例2
一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其经过以下工艺步骤：
1）硫酸软骨素裂解酶制备
a.取新鲜鸭小肠，取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂2年的鸭子，用破壁机粉碎，按重量份1:5添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌10min，用160目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板，30℃恒温培养1天，向平板中倒入无菌水，浸泡3min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养,控制温度保持在30℃℃，120r/min振荡好氧培养1天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度30℃、120r/min振荡通气培养1天，菌体密度为1×108个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；
b. 按4%v/v接种量将硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液接入发酵罐中，在30℃发酵培养基，经48h发酵，用低温离心机5℃、4000r/min离心2min,取上清液，在冰浴中缓缓向上清液中按重量百分数添加85%的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物，5℃静置18h，低温离心机5℃、8000r/min离心25min,取沉淀，用去离子水溶解，转移至透析袋中，透析脱除杂质即得硫酸软骨素裂解酶；所述氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物组成比例为W氯化钠：W硫酸铵：V乙醇为为1:6:3；
2）鱿鱼软骨酶解
a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡2h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；
b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数20%和水混合，加入了混合物重量2%CaCl2、3%乙醇，2%硫酸软骨素裂解酶，温度45℃、pH8.5、100r/min酶解4h；
c.酶解完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为30%；
3）纯化
a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇65%V/V，并调节pH5.2，搅拌30min，静置4h，离心去除上清液；
b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入规格为4kD，且为即用型透析袋进行透析纯化，同时外加0.5V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到74%V/V，同时调节pH5.5，静置8h，离心，重复结晶2次；
4）干燥
将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。
实施例3
一种利用鱿鱼软骨制备硫酸软骨素的方法，其经过以下工艺步骤：
1）硫酸软骨素裂解酶制备
a.取新鲜鸭小肠，取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂3年的鸭子，用破壁机粉碎，按重量份1: 6添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌20min，用180目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板， 37℃恒温培养3天，向平板中倒入无菌水，浸泡5min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养,控制温度保持在37℃，150r/min振荡好氧培养3天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度37℃、150r/min振荡通气培养3天，菌体密度为5×108个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；
b. 按6%v/v接种量将硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液接入发酵罐中，在37℃发酵培养基，经60h发酵，用低温离心机5℃、5500r/min离心30min,取上清液，在冰浴中缓缓向上清液中按重量百分数添加92%的氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物，5℃静置20h，低温离心机5℃、10000r/min离心38min,取沉淀，用去离子水溶解，转移至透析袋中，透析脱除杂质即得硫酸软骨素裂解酶；所述氯化钠、硫酸铵和乙醇复合物组成比例为W氯化钠：W硫酸铵：V乙醇为1:8:3；
2）鱿鱼软骨酶解
a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡5h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；
b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数20%-30%和水混合，加入了混合物重量4%CaCl2、5%乙醇， 5%硫酸软骨素裂解酶，温度51℃、pH10、120r/min酶解6h；
c.酶解完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为35%；
3）纯化
a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇80%V/V，并调节pH7.0，搅拌60min，静置5h，离心去除上清液；
b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入规格为10kD，且为即用型透析袋进行透析纯化，同时外加0.8V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到81%V/V，同时调节pH6.5，静置10h，离心，重复结晶3次；
4）干燥
将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。
对比例1
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤1）不进行硫酸软骨素裂解酶产生菌提取，直接用鸭小肠粉碎物进行步骤2）b步骤的发酵。
对比例2
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）b步骤中发酵前不添加CaCl2和乙醇做助剂且不调整pH。
对比例3
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）b步骤中不进行超声辅助处理。
对比例4
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）b步骤中不添加CaCl2和乙醇做助剂且不调整pH，同时也不辅助超声处理。
对比例5
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）b步骤中不接种微生物。
对比例6
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤3）不进行透析袋透析操作。
对比例7
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤3）不施加电场处理。
对比例8
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在不进行步骤3）的操作。
对比例9
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤1）b中不添加氯化钠、硫酸铵。
对比例10
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤1）b中不添加硫酸铵和乙醇。
对比例11
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤1）b中不添加氯化钠和乙醇。
将上述实施例和对比例进行提取率和纯度比较，提取率为最终获得的产物与原料重量之比，结果见表1所示。
表1不同处理条件硫酸软骨素提取率和纯度分析
表1实验结果表明，实施例均具有理想的提取率和纯度，提取方法与纯化方法的结合，构成硫酸软骨素制备的先进工艺。对比例1-5硫酸软骨素的提取受微生物纯化、发酵助剂的显著影响，其中微生物提取纯化是影响提取率的决定因素，但单一微生物提取硫酸软骨素的提取率低，采用复合提取法显著提高了硫酸软骨素的提取率。对比例6-8硫酸软骨素的纯化受透析操作和电场的双重影响，但透析袋作用更为显著。对比例9-11硫酸软骨素受沉淀剂的影响显著，与实施例1相比，单一使用某一种沉淀剂，制备的硫酸软骨素酶活性低，导致酶解效果差，致使产物纯度降低。
将上述实施例和对比例进行蛋白质和硫酸软骨素含量比较，蛋白质/硫酸软骨素含量是以最终获得的产物中蛋白质/硫酸软骨素量与产物重量之比，结果见表2所示。
表2产物蛋白质与硫酸软骨素分析
表2实验结果表明，实施例蛋白含量均小于2.5%，而其他操作，蛋白含量较高，采用本发明所提供制备条件的各组实施例所得成品硫酸软骨素的硫酸软骨素含量，均高于对比例，且成品硫酸软骨素中的蛋白质含量均低于对比例，其次，透析和电场作用对硫酸软骨素提取影响显著，从上述结果可以发现，助剂处理能够显著促进发酵过程，电场作用和透析作用提高成品硫酸软骨素的纯度，酶提取沉淀剂影响酶活性，制备产物蛋白含量高。
以傅立叶红外光谱（KBr 压片法）分析实施例1产物样品的化学结构。其中，实施例1的产物样品与C-S2标准品傅里叶红外光谱图，如图1所示。
由图1可以发现，实施例1的产物样品与标准品的硫酸软骨C 的红外光谱图谱基本一致， 在918cm-1 附近有典型硫酸软骨素A 的特征吸收。产物样品微弱的特征吸收表明该样品中存在少量的Chs-A，与国内外报道一致。也即是说，本申请采用的方法可靠、有效，且制备的硫酸软骨素均一性比较好，基本为硫酸软骨素C。
以实施例1的产物样品体外抗肿瘤活性检测工艺产品的有效性。
培养乳腺癌细胞株4T1细胞，培养条件：在含2mM非必须氨基酸、2mML-谷氨酰胺的DMEM培养液中加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素双抗加入合适浓度的细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养。检测具体步骤参阅专利CN202010552297.8。
表3抗肿瘤活性分析
组别
0μg/mL
25μg/mL
50μg/mL
100μg/mL
200μg/mL
对照组/%
100
100
100
100
100
施药组/%
100
73
65
54
48
检测结果显示，加入实施例1产品的4T1细胞数目降低；且随着多糖浓度的增加，抗肿瘤细胞增殖的能力逐渐增强，在200μg/mL本产品的作用下，细胞数目仅达到无糖作用时的45-50％，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，结果表明本发明产品及提取方法可行、有效。
以实施例1和对比例9-11制备的硫酸软骨素酶为研究对象，采用分光光度法检测硫酸软骨素酶活性。
表4酶活性的检测结果
组别
对比例9
对比例10
对比例11
实施例1
活性值
0.5726
0.6324
0.7943
0.9817
表4结果显示，实施例1制备的硫酸软骨素酶活性与对比例9-11相比，酶沉淀剂组成显著影响酶活性，单一酶沉淀剂效果差，复合沉淀剂制备的酶活性更高。
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