一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用 (Lysosome targeted fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 王慧 胡磊 汪明 陈曦 于坤 许丙嵩 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用,以具有强给电子能力的三苯胺单醛衍生物与强吸电子能力的2-甲基喹啉碘盐反应,简洁高效地制备了一种具有D-π-A构型的三苯胺类衍生物溶酶体靶向荧光探针,其最大发射峰在646nm左右,且随着粘度的增加,其荧光强度显著增强；激光共聚焦显微成像结果显示,本发明制备的溶酶体靶向荧光探针能够穿透细胞膜,靶向在细胞内的溶酶体部位,由于探针具有较好的光稳定性,其能够实时监测溶酶体的粘度变化、及融合和迁移的过程。(The invention discloses a lysosome targeted fluorescent probe and a preparation method and application thereof, wherein a triphenylamine single aldehyde derivative with strong electron donating capability reacts with 2-methylquinoline iodonium salt with strong electron withdrawing capability to simply and efficiently prepare the triphenylamine derivative lysosome targeted fluorescent probe with a D-pi-A configuration, the maximum emission peak is about 646nm, and the fluorescence intensity is obviously enhanced along with the increase of viscosity; laser confocal microscopy imaging results show that the lysosome targeted fluorescent probe prepared by the invention can penetrate cell membranes and target lysosome parts in cells, and the probe has better light stability, so that the viscosity change of lysosomes and the fusion and migration processes can be monitored in real time.)
技术领域
本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
在生命体内，细胞内的粘度对于控制信息的传递、物质的运输以及生物大分子之间的相互作用等有着非常重要的作用。细胞内粘度的异常与细胞的功能紊乱及许多疾病息息相关，如阿尔兹海默症、动脉硬化、细胞恶性肿瘤和糖尿病等。溶酶体几乎存在于所有的动物细胞中，它是单层膜围绕、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器，其主要功能是行使细胞内的消化作用，在维持细胞正常代谢活动及防御等方面起着重要的作用。作为细胞的消化器官，溶酶体在吸纳、降解生物大分子的过程中会伴随着粘度的变化。此外，若由于遗传缺陷导致溶酶体中缺乏某种水解酶，会使相应的底物不能降解而蓄积在溶酶体中，这样就会使溶酶体过载而引起溶酶体储积症。因此，监测溶酶体中粘度的变化具有重要的应用价值。
近年来，激光共聚焦荧光显微成像已经成为生物医学领域研究不可或缺的研究工具。与普通的荧光显微成像技术相比，激光共聚焦荧光显微成像技术有其自身的优势：高的空间分辨率和选择性、小的信号干扰等，为显影和分析活体细胞和组织的动态过程提供了更为锐利的工具。但目前大部分的溶酶体粘度荧光探针的发射波长短(<600nm)，易受细胞内蓝绿区自发荧光的干扰，组织渗透深度低，不利于生物成像。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种溶酶体靶向荧光探针，其最大发射峰在646nm左右，可消除生物体内自发荧光的干扰，从而降低背景噪音，提高信噪比，且具有较小的光损伤和较强的渗透能力。
本发明还提供了一种溶酶体靶向荧光探针的制备方法，该制备方法的原料易得，成本低，反应条件温和，后处理简单，收率较高，使其商业化成为可能。
本发明还提供了溶酶体靶向荧光探针在溶酶体标记或监测溶酶体粘度变化或实时监测溶酶体融合和迁移过程中的应用，其可能够穿透细胞膜，靶向在细胞内的溶酶体部位，追踪溶酶体的融合、迁移过程；且随着溶酶体粘度的增大，荧光强度增强。
本发明还提供了利用溶酶体靶向荧光探针进行溶酶体标记的方法，将生物细胞与所述溶酶体靶向荧光探针共同培养20分钟，利用激光共聚焦显微镜进行显影，该方法操作简单，观察方便。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种溶酶体靶向荧光探针，所述溶酶体靶向荧光探针的结构式为：
本发明提供的溶酶体靶向荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将化合物M1和化合物M2溶解在有机溶剂中，以有机碱为催化剂，经回流反应，反应结束后冷却至室温，然后进行抽滤、洗涤、干燥，即可制备得到所述溶酶体靶向荧光探针；
所述化合物M1的结构式为：
所述化合物M2的结构式为：
进一步地，所述有机溶剂为乙醇；所述有机碱为哌啶。
所述化合物M1、化合物M2、催化剂的物质的量之比为1：1.1～1.2：0.6～0.7，优选为1：1.13：0.67。
所述化合物M1相对于有机溶剂的浓度为0.05～0.1M，优选为0.06M。
所述回流反应的时间为22～26h，优选为24h。
本发明以具有强给电子能力的三苯胺单醛衍生物与强吸电子能力的2-甲基喹啉碘盐反应，简洁高效地制备了一种具有D-π-A构型的三苯胺类衍生物溶酶体靶向荧光探针，其最大发射峰在646nm左右，且随着粘度的增加，其荧光强度显著增强。激光共聚焦显微成像结果显示，本发明制备的溶酶体靶向荧光探针能够穿透细胞膜，靶向在细胞内的溶酶体部位。由于探针具有较好的光稳定性，其能够实时监测溶酶体融合和迁移的过程。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的溶酶体靶向荧光探针的合成原料易得，成本低，反应条件温和，后处理简单，收率较高，使其商业化成为可能。
2.本发明提供的溶酶体靶向荧光探针的发射波长在646nm左右，能有效降低生物背景，提高生物成像的信噪比。
3.本发明提供的溶酶体靶向荧光探针的荧光强度随着粘度的增加显著增强，其荧光强度可增强至458倍。
4.本发明提供的溶酶体靶向荧光探针是一种可以靶向细胞内溶酶体并可监测溶酶体粘度变化的荧光探针。
5.本发明提供的溶酶体靶向荧光探针能够实时追踪溶酶体融合和迁移的过程。
6.相较于商业化的溶酶体探针，溶酶体靶向荧光探针具有较大的斯托克斯位移，其激发波长为514nm，发射波长为646nm，斯托克斯位移为132nm，可降低背景干扰。
附图说明
图1为溶酶体靶向荧光探针的合成路线图；
图2为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针的核磁氢谱图；
图3为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针的红外光谱图；
图4为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针的质谱图；
图5为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针在不同体积分数水/甘油粘性介质中的荧光发射光谱(A)；化合物L与氨基酸、BSA、DNA、RNA相互作用后的荧光柱状图，其中：1.L-苯丙氨酸、2.L-丙氨酸、3.BSA、4.L-半胱氨酸、5.DNA、6.GSH、7.L-谷氨酸、8.L-组氨酸、9.L-亮氨酸、10.L-脯氨酸、11.RNA、12.L-丝氨酸、13.L-苏氨酸、14.L-缬氨酸、15.L-精氨酸、16、L-络氨酸、17.99％甘油(B)；
图6为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针与具有不同靶向功能的商业染料的共定位人肝癌细胞的结果：其中，图A1-A4为化合物L与人肝癌细胞作用后的显影图；图B1-B4分别对应Lysotracker green(溶酶体商染)、Mitotracker green(线粒体商染)、Hoechst33342(细胞核商染)、LCS LipidTOX Deep Red(脂滴商染)商业染料与化合物L作用后的人肝癌细胞共孵育后的显影结果；图C1-C4分别对应图A1-A4与图B1-B4的叠加结果；图D1-D4分别对应共定位结果的皮尔森系数值；
图7为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针与人肝癌细胞共孵育20分钟后，不加入(A)和加入(B)地塞米松后的细胞成像图；
图8为实施例1制备的溶酶体靶向荧光探针与人肝癌细胞共孵育20分钟后，加入氯喹溶液再培养30分钟后的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明中使用的化合物M1的合成方法参考文献CrystEngComm,2017,19:6489-6497；化合物M2的合成方法参考文献Angew.Chem.Int.Ed.,2018,57:16506-16510。
实施例1
一种溶酶体靶向荧光探针(化合物L)，其结构式为：
所述溶酶体靶向荧光探针的合成路线如图1所示，其制备方法包括以下步骤：
在100mL圆底烧瓶中，依次加入M1(0.43g,1.5mmol)，M2(0.48g,1.7mmol)和25mL乙醇，100μL哌啶作为催化剂，回流24h，反应结束后，冷却至室温，有固体析出，减压抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，真空干燥12h，得紫黑色固体0.68g，产率81.9％。并对其进行红外、氢谱、质谱的表征，结果如下：
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ:8.45-8.40(d,1H),8.26-8.02(m,4H),7.94-7.88(m,1H),7.76-7.63(m,2H),7.49-7.33(m,5H),7.16-7.10(m,6H),6.13-6.01(t,2H),4.15(s,3H)；如图2所示，结构式中的酚羟基上的H由于比较活波，在氢谱上没有出峰。
IR(KBr,cm-1)selected bands:3451.2,3057.0,1608.6,1584.5,1486.1,1437.3,1329.7,1291.1,1273.1,1227.5,1165.1,1133.2,1110.2,987.7,821.2,752.7,693.8；如图3所示。
ESI-MS:429.2014([M-I]+)；如图4所示。
将本实施例制备的化合物L溶解在二甲基亚砜溶剂中先配制成10-3mol/L的母液，吸取50μL母液分别分散在0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和99％不同体积分数水/甘油粘性介质中，各体系的总体积均为5mL，使化合物L的终浓度为10μM，在514nm激发波长下测试其荧光发射光谱；结果如图5A所示，从图中可以看出随着介质粘度的增加，化合物L的荧光强度逐渐增强。
将本实施例制备的化合物L溶解在二甲基亚砜溶剂中先配制成10-3mol/L的母液，吸取50μL母液分别分散在含有氨基酸、BSA、DNA和RNA的PBS缓冲溶液、99％甘油溶液、PBS缓冲溶液中，各体系的总体积均为5mL，各体系中化合物L的终浓度为10μM，氨基酸、BSA、DNA和RNA的终浓度均为200μM，在514nm激发波长下测试其荧光发射光谱，并以分散介质为横坐标，I/I0为纵坐标作图，其中I为化合物L与不同分析物作用后在646nm处的荧光强度值、I0为化合物L的PBS缓冲溶液在646nm处的荧光强度值；结果如图5B所示，从图中可以看出，化合物L只有在粘性介质中才显示出强烈的荧光，可见化合物L在粘性介质中的荧光发光可不受其他分析物的干扰。
实施例2
溶酶体靶向荧光探针对溶酶体靶向研究
将人肝癌细胞(HepG2 cell)种在激光共聚焦小皿(NEST货号：801002)上，每孔接种106个细胞，待细胞密度涨至60％时即可使用。用二甲基亚砜溶剂将实施例1制备的化合物L配成10-2mol/L的母液，用培养基稀释到8μM，每个小皿中加入1mL到已培养好的人肝癌细胞(HepG2 cell)中，在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，用PBS缓冲溶液洗2遍，然后在Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜设备上观察结果，设置激发波长为514nm；如图6所示，从图中可以看出化合物L能够靶向细胞内的溶酶体部位。
为了证明本发明中的探针能够靶向溶酶体，将四组人肝癌细胞(HepG2 cell)分别与8μM化合物L按照上述的方法在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，用PBS缓冲溶液洗2遍，然后在514nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，显影结果如图6中A1-A4所示；
然后分别与Lysotracker green、Mitotracker green、Hoechst 33342和LCSLipidTOX Deep Red这些商业染料分别共培养20分钟，用PBS缓冲溶液洗2遍，分别在488nm、488nm、405nm和633nm的激发波长之下进行激光共聚焦显影，显影结果如图6中B1-B4所示；图C1-C4分别对应图A1-A4与图B1-B4的叠加结果；图D1-D4分别对应共定位结果的皮尔森系数值。由图6可证明化合物L能够靶向细胞内的溶酶体。
实施例3
溶酶体靶向荧光探针监测溶酶体内粘度的变化
为进一步研究外部环境刺激影响溶酶体内粘度后溶酶体靶向荧光探针荧光强度的变化，该实施例选取一种可作为细胞溶酶体膜的免疫抑制剂地塞米松，该药物可诱导溶酶体粘度增强。将两组人肝癌细胞(HepG2 cell)分别与8μM化合物L按照实施例2中的方法在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，用PBS缓冲溶液洗2遍后加入新鲜的培养基，并取其中一组人肝癌细胞加入5μM的地塞米松，在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用30分钟，然后在514nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，设置激发波长为514nm；如图7所示，从图中可以看出，当用地塞米松刺激细胞后，探针的荧光强度明显增强，说明溶酶体内粘度的变化可诱导探针L的空间构型发生变化，从而表现出明亮的红色荧光，可见本发明制备的溶酶体靶向荧光探针可用于监测溶酶体内粘度的变化。
实施例4
溶酶体靶向荧光探针追踪溶酶体融合、迁移的过程
将人肝癌细胞(HepG2 cell)与8μM化合物L按照实施例2中的方法在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，用PBS缓冲溶液洗2遍后加入新鲜的培养基，并加入5μM的氯喹溶液，氯喹的作用是在细胞保持健康的状态下，诱导溶酶体的移动，在含有95％空气和5％CO2气体的培养箱中于37℃下作用30分钟，然后在514nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，设置激发波长为514nm；如图8所示，从图中可以看出，探针L可实时监测溶酶体融合和迁移的过程。
上述参照实施例对一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种盐酸丙卡特罗杂质的制备方法